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(1.青海大學農牧學院，西寧 810016；2.青海省天峻縣畜牧獸醫(yī)工作站，天峻 817200)

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牦牛和柴達木黃牛的頸動脈體Ⅰ型細胞線粒體和電子致密核心囊泡的體視學比較

常蘭1，張壽1*，雷乃虎1，2，尚果瑪1

(1.青海大學農牧學院，西寧 810016；2.青海省天峻縣畜牧獸醫(yī)工作站，天峻 817200)

摘要：作者旨在比較牦牛和柴達木黃牛頸動脈體(CB) Ⅰ型細胞線粒體和電子致密核心囊泡(EDCV)的體視學特征。選擇海拔3 200 m地區(qū)健康成年牦牛和柴達木黃牛各5頭，采用透射電鏡技術觀察CB的超微結構，并運用立體定量方法比較牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞線粒體和EDCV的體密度(Vν)、面密度(Sν)、面數密度(NA)、比表面(δ)。結果表明，牦牛和柴達木黃牛的頸動脈體實質細胞主要由Ⅰ型細胞和Ⅱ型細胞組成，頸動脈體Ⅰ型細胞細胞質中含有大量的線粒體和特征性的電子致密核心囊泡。牦牛Ⅰ型細胞線粒體的Vν值大于柴達木黃牛，但差異不顯著(P>0.05)；牦牛Sv、NA、δ值均小于柴達木黃牛，其中Sν、δ值在兩組間差異均不顯著(P>0.05)，NA在兩組間差異顯著(P<0.05)；牦牛Ⅰ型細胞質內EDCV的Vν值小于柴達木黃牛(P>0.05)；牦牛Sν、NA和δ值均大于柴達木黃牛(P>0.05)。結果提示這種結構特征可能使牦牛對環(huán)境低氧的感知比生活在相同海拔高度的柴達木黃牛遲鈍。

關鍵詞：線粒體；電子致密核心囊泡；頸動脈體；牦牛；柴達木黃牛；體視學

頸動脈體(carotid body，CB)是主要的外周化學感受器，位于頸總動脈分叉處、血管壁外周的結締組織中，其功能主要是感受動脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)和pH的變化，從而調節(jié)呼吸和循環(huán)反射。頸動脈體實質細胞包括兩種特殊類型的細胞：Ⅰ型細胞(或稱主細胞、球細胞)和Ⅱ型細胞(或稱支持細胞、衛(wèi)星細胞)。Ⅰ型細胞細胞質中除線粒體、溶酶體、內質網等細胞器外還具有許多特有的電子致密核心囊泡(electron dense-cored vesicles，EDCV)，已知這些囊泡內含兒茶酚胺、乙酰膽堿、腦啡肽、P物質等多種神經化學物質。有關CB方面的研究主要集中在人[1]、大鼠[2]、小鼠[3，4]、兔[5]和綿羊[6]上，而對生活在青藏高原高寒低氧生態(tài)環(huán)境下牦牛和柴達木黃牛CB的比較研究未見有報道。為此，作者對生活在相同海拔(海拔3 200 m)下的牦牛和柴達木黃牛的CB電鏡結構進行了比較研究。

1材料與方法

1.1材料

選取生活在青海省海西州(海拔3 200 m)成年健康牦牛和柴達木黃牛各5頭，經頸動脈放血處死后立即取兩側頸動脈體，一側頸動脈體取1 mm×1 mm×2 mm大小組織投入冷2.5%戊二醛固定液中用于透射電鏡制樣(另一側頸動脈體置入4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定48 h，用于光鏡制樣)。

1.2透射電鏡制樣

取2.5%戊二醛固定液中的頸動脈體組織，0.1 mol·L-1PB漂洗后，1%鋨酸固定2 h，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，每頭做2個包埋塊，超薄切片，進行醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，用日本產H-7650型透射電鏡在放大3 000倍、20 000倍、30 000倍和50 000倍下數碼照相觀察超微結構，在放大20 000倍下每頭牛頸動脈體組織拍攝7～10個視野，每組40張數碼照片用于體視學分析。

1.3立體定量分析方法

參照E.R.Weibel[7]和鄭富盛[8]正方測試格點計數法，繪制用于電鏡照片的電子方格測量系統(tǒng)，用點計數法在電鏡照片上計數落入參照系的測試點數(Pr)，參照系內待測結構(線粒體、電子致密核心囊泡)的數目(Nx)、待測結構內的測試點數(Px)、待測結構的邊界與測試線的交點數(Ix)，按立體學公式計算出待測結構的體密度(volume density，Vν；單位體積Ⅰ型細胞質中線粒體、EDCV的體積百分比)、面密度(surface density，Sν；單位體積Ⅰ型細胞質中線粒體、EDCV外膜的表面積)、面數密度(numerical density on area，NA；單位面積中線粒體、EDCV數目)、比表面(specific surface，δ；線粒體、EDCV表面積與其自身體積之比)各結構參數。

1.4統(tǒng)計學處理

2結果

2.1牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞線粒體和EDCV電鏡觀察

牦牛和柴達木黃牛的頸動脈體實質細胞主要由Ⅰ型細胞和Ⅱ型細胞組成。Ⅰ型細胞數量多，較大，呈圓形，細胞核也呈圓形(圖1A、B)，Ⅱ型細胞分布于Ⅰ型細胞的周圍，細胞小而少，胞體較扁，細胞核呈三角形、卵圓形或梭形的，并略向Ⅰ型細胞彎曲。Ⅰ型細胞的細胞質中含有大量的線粒體和特征性的電子致密核心囊泡(圖1C、D)。頸動脈體Ⅰ型細胞的線粒體形態(tài)有圓形、橢圓形、棒狀等，線粒體結構完整，牦牛頸動脈體Ⅰ型細胞中的線粒體數量比柴達木黃牛的相對少、體積相對大；EDCV 絕大部分呈圓形，少數呈卵圓形或短棒狀，有深、淺兩種致密顆粒，大小不一。它們包含有一個中心致密的嗜鋨核，呈圓形，周圍有電子密度低的空暈，其周圍有一層限界膜(圖1E、F)，牦牛頸動脈體Ⅰ型細胞中EDCV數量比柴達木黃牛的相對多、體積相對小(圖1C、D)。

2.2牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞線粒體體視學參數比較

A、C、E、F.牦牛；B、D.柴達木黃牛；A、B.3 000×；C、D.20 000×；E.30 000×；F.50 000×；△.Ⅰ型細胞；☆.Ⅰ型細胞核；.電子致密核心囊泡；.線粒體A，C，E，F.Yak；B，D.Qaidam yellow cattle;A，B.3 000×；C，D.20 000×；E.30 000×；F.50 000×；△.Type Ⅰ cell；☆.Necleus of type Ⅰ cell;.EDCV;.Mitochondria圖1　牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞線粒體和電子致密核心囊泡透射電鏡圖Fig.1　Type Ⅰ cells mitochondria and EDCV in carotid body of yak and Qaidam yellow cattle

表1可知，牦牛頸動脈體Ⅰ型細胞線粒體的Vν值大于柴達木黃牛，但差異不顯著(P>0.05)；Sν、NA、δ值均小于柴達木黃牛，其中Sν、δ值在兩組間差異均不顯著(P>0.05)，NA在兩組間差異顯著(P<0.05)。

表1　牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞線粒體參數的比較±s)

同一列中，標有*表示差異顯著(P<0.05)，下同

Values with * mean signifiant difference (P<0.05) in the same column，the same as below

2.3牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞EDCV體視學參數比較

由表2可以看出，牦牛頸動脈體Ⅰ型細胞質內EDCV的Vν值小于柴達木黃牛(P>0.05)；Sν、NA和δ值均略大于柴達木黃牛(P>0.05)，表明牦牛頸動脈體中Ⅰ型細胞質內EDCV的數量多于柴達木黃牛、體積小于柴達木黃牛，但差異均不明顯(P>0.05)。

表2　牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞內EDCV體視學參數比較±s)

3討論

3.1牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞線粒體的比較及其意義

頸動脈體是機體重要的外周化學感受器，能夠瞬間感知體內PaO2的變化，釋放神經遞質，產生神經沖動，通過頸動脈體竇神經傳入至中樞神經系統(tǒng)，引起機體對低氧的應答[9]，同時在慢性低氧中能自發(fā)的適應和調節(jié)，包括形態(tài)方面的改變[10]。頸動脈體Ⅰ型細胞被認為是氧感知細胞，但目前對于CB在慢性低氧中的調節(jié)機制并未得到系統(tǒng)性的闡明?！熬€粒體假說”認為氧分壓的直接感受器是Ⅰ型細胞中線粒體呼吸鏈末期的細胞色素氧化酶，線粒體通過氧化磷酸化的呼吸作用，介導頸動脈體對低氧分壓的反應[11]；而“能量代謝假說”認為頸動脈體Ⅰ型細胞通過線粒體能量代謝的變化感受氧，低氧抑制線粒體電子傳遞，導致細胞質Mg-ATP下降，使細胞膜氧敏感TASK樣鉀離子通道抑制[12-13]；另一種能量代謝假說“AMP酶假說”提出腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK) 調節(jié)不同的鉀離子通道(包括TASK通道)，AMPK是細胞內能量感受器，缺氧導致細胞內ATP不足時，AMP /ATP 值增高，AMP激活位于細胞膜上的 AMPK，進而抑制細胞膜鉀離子通道，引起細胞去極化和鈣離子內流以及竇神經的興奮[14]。

大鼠在出生前后慢性富氧引起CB永久性的萎縮和細胞功能的改變[15]，而慢性低氧可嚴重損害出生后CB細胞水平的氧敏感性。生活在海拔3 300 m的喜馬拉雅旱獺和高原鼠兔頸動脈體線粒體未見有缺氧損害[16]。高原人頸動脈體與平原人相比，部分線粒體增大、線粒體嵴并不減少[17]。本試驗結果表明牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞含有大量線粒體，結構完整，這與高原世居動物——喜馬拉雅旱獺和高原鼠兔[16]、高原人[17]的研究結果基本一致。本研究發(fā)現牦牛CB的Ⅰ型細胞線粒體比生活在同一海拔的柴達木黃牛數量明顯少，有文獻報道在光鏡水平暗細胞顯著增加反映CB對低氧反應表現為較高的功能活動[18]，作者先前的研究也發(fā)現生活在同一海拔的牦牛CB暗細胞與柴達木黃牛的數量差異不顯著 (另文發(fā)表)。分析其原因這可能與牦牛和柴達木黃牛的適宜的生活環(huán)境有關，根據牦牛的生活習性，海拔3 000～5 000 m是它的最為適宜范圍，而本試驗海拔為3 200 m，此海拔高度對牦牛而言是處于相對較低范圍，氧的供給相對充足，因而牦牛CB處在相對較低的功能狀態(tài)，這就表現為與氧感受、調節(jié)有關的Ⅰ型細胞線粒體數量明顯少；而對于適宜當地氣候條件的地方培育品種——柴達木黃牛而言，適宜生活海拔在2 800～3 200 m，試驗海拔3 200 m是相對較高的海拔范圍，使它處于低氧刺激高度，CB相對處在較高的功能狀態(tài)，表現出Ⅰ型細胞線粒體數量顯著多于牦牛的現象。另外，牦牛和柴達木黃牛Ⅰ型細胞線粒體數量的差別是否與低氧通氣反應鈍化有關將有待于進一步研究。

3.2牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞EDCV的比較及其意義

頸動脈體Ⅰ型細胞為神經分泌細胞，其細胞質內電子致密核心囊泡是具有調節(jié)心血管及呼吸功能的神經分泌顆粒，嗜鋨核是生物胺(如兒茶酚胺類的去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺、多巴、5-羥色胺等)的主要分泌源。E.M.Abdel-Magied等[19]對山羊的超微結構觀察發(fā)現，山羊CB的Ⅰ型細胞中含有數量、大小不一的EDCV；陳欽銘等[16]對喜馬拉雅旱獺與高原鼠兔的頸動脈體超微結構進行觀察，發(fā)現旱獺頸動脈體Ⅰ型細胞中的EDCV呈多形性，細胞核較不規(guī)則，多呈分葉狀，而高原鼠兔則多為圓形，細胞核比較規(guī)則，多呈球形。本研究結果顯示牦牛和柴達木黃牛頸動脈體Ⅰ型細胞質內EDCV絕大部分呈圓形，少數呈卵圓形或短棒狀，數量大小不一，每個EDCV具有一個中心致密的嗜鋨核。這一結果與高原鼠兔[16]和山羊[19]上的報道相似。本研究還發(fā)現牦牛和柴達木黃牛EDCV均有深、淺兩種，這是否與內含的神經活性物質不同有關，有待進一步研究。

當血液中氧分壓降低時可以引起頸動脈體球細胞去極化及神經遞質的釋放[20]，通過頸動脈體竇神經傳入至呼吸中樞，引起呼吸加深加快。高原成人頸動脈體內EDCV的體密度和面數密度明顯多于平原組[21]。本研究中牦牛CB的Ⅰ型細胞EDCV雖然比生活在同一海拔的柴達木黃牛小而多，但差異不明顯。這可能也與前述的牦牛和柴達木黃牛生存的適宜海拔高度有關。在海拔3 200 m時，牦牛呼吸相對平緩，導致頸動脈體Ⅰ型細胞中神經活性物質的合成緩慢、分泌、釋放減少，CB處在相對較低的功能狀態(tài)，EDCV也表現為相對小而多；對于柴達木黃牛而言在海拔3 200 m時，機體處于相對低氧狀態(tài)，呼吸功能相對增強，持續(xù)低氧的刺激下使頸動脈體Ⅰ型細胞中神經活性物質的合成增強，同時其分泌、釋放也加快，CB處在相對較高的功能狀態(tài)，EDCV也表現為較大而少。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.022

收稿日期：2016-01-06

基金項目：國家自然科學基金(31360590)；青海省科技應用基礎項目(2014-ZJ-711)；青海省科技支撐項目(2012-N-537)

作者簡介：常蘭(1965-)，女，青海互助人，教授，碩士，碩士生導師，主要從事高原動物低氧適應研究，E-mail：changlan0123@163.com *通信作者：張壽，E-mail：qhzhangshou@163.com

中圖分類號：S852.16

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1474-06

Stereologic Study on Mitochondria and Electron Dense-cored Vesicles of Carotid Body Type Ⅰ Cells between Yak and Qaidam Yellow Cattle

CHANG Lan1，ZHANG Shou1*，LEI Nai-hu1，2，SHANG Guo-ma1

(1.CollegeofAgricultureandAnimalHusbandary，QinghaiUniversity，Xining810016，China；2.TianjunCountyAmimalHusbandryandVeterinaryStationofQinghai，Tianjun817200，China)

Abstract:The aim of the present study was to compare the stereology characteristics of mitochondria and electron dense-cored vesicles (EDCVs) of carotid body(CB) type Ⅰ cells between yaks and Qaidam yellow cattle.In this study，the ultrastructures of CB in health adult yaks (n=5) and Qaidam yellow cattle (n=5) at altitude of 3 200 m were observed by electron transmission microscopy technique，and the volume density (Vν)，surface density (Sν)，numerical density on area (NA) and specific surface (δ) of mitochondria and EDCV of CB type Ⅰ cells between yaks and Qaidam yellow cattle were compared by stereology.The results showed that the CB parenchyma cells were composed of type Ⅰ cells with many mitochondria and EDCVs in the cytoplasm and type Ⅱ cells in yaks and Qaidam yellow cattle，The Vν of mitochondria of CB type Ⅰ cells in yaks were greater than that of in Qaidam yellow cattle (P>0.05)，the Sν，NA，δ were less than that of in Qaidam yellow cattles，with no significant difference in Sν and δ between yaks and Qaidam yellow cattle (P>0.05) and significant difference in NA between 2 gropes(P<0.05)；The Vν of EDCV of CB type Ⅰ cells in yaks were less than that of in Qaidam yellow cattle (P>0.05)，and the Sν，NA，δ were slightly greater than that of in Qaidam yellow cattle (P>0.05)，respectively.The results suggest that the structure characteristics may make the yak was more insensive to perceive hypoxia environment than the Qaidam yellow cattle.

Key words:mitochondria；electron dense-cored vesicle；carotid body；yak；Qaidam yellow cattle；stereology