賀騰飛，羅聯(lián)忠，陳　軍*，王德祥，丁少雄

(1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建廈門361102;2.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建廈門361005)

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葉片山海綿水溶性活性產(chǎn)物的大孔吸附樹脂分離及其抗腫瘤活性

賀騰飛1，羅聯(lián)忠2，陳軍1*，王德祥1，丁少雄1

(1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建廈門361102;2.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建廈門361005)

摘要：海綿擁有豐富的生物活性產(chǎn)物，以葉片山海綿(Mycale phyllophila)為材料，建立了以DA201-C大孔吸附樹脂為核心的從水提液中提取活性產(chǎn)物的方法.以Lowry法跟蹤得率，此方法對(duì)小分子肽類的回收率約為57%；粗提物的主要成分為肽類，約占89%.細(xì)胞活性檢測(cè)表明粗提物對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、A2780-CP卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用.本工作為深入研究葉片山海綿水溶性活性產(chǎn)物中的抗腫瘤組分奠定了基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：海綿；大孔吸附樹脂；肽類；抗腫瘤活性

海綿屬于多孔動(dòng)物門(Porifera)，是最原始的多細(xì)胞動(dòng)物.海綿擁有豐富的生物活性產(chǎn)物，在目前發(fā)現(xiàn)的20 000多種海洋天然活性產(chǎn)物中，有7 000多種來自海綿[1-2]，海綿作為最重要的海洋藥源生物越來越為醫(yī)藥界所重視.目前發(fā)現(xiàn)的海綿活性產(chǎn)物絕大部分是通過有機(jī)萃取方法富集起來的，這種方法對(duì)親水性較強(qiáng)的組分提取效率可能較低，而且一些組分尤其是肽類組分的生物活性也可能會(huì)在長時(shí)間的有機(jī)溶劑處理后丟失.葉片山海綿(MycalephyllophilaHentschel，1911)在福建沿海分布較為廣泛，本課題組對(duì)其開展了種屬鑒定、原位移植和生活史等研究工作[3-5].本研究以葉片山海綿為實(shí)驗(yàn)材料，建立了適合于水溶性活性產(chǎn)物尤其是小分子肽類的大孔吸附樹脂富集方法，細(xì)胞活性檢測(cè)證明了該方法獲得的肽類粗提物具有明顯的抗腫瘤活性.

1材料與方法

1.1材料

葉片山海綿采自福建省東山灣古雷附近的漁排，將海綿離心脫水后置于-80 ℃冰箱保存.

1.2海綿破碎和水提

稱取冷凍干燥后的葉片山海綿380 g，高速粉碎機(jī)粉碎；4 ℃條件下，粉末浸泡于1.2 L水提液(10 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，1.5 μmol/L抑肽酶，20 μmol/L苯硫脲，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF))中充分?jǐn)嚢?0 min.冰上超聲破碎，輸出功率100 W，運(yùn)行5 s，停止15 s，總運(yùn)行時(shí)間15 min；4 ℃，8 000g離心15 min；將沉淀重懸于1.2 L水提液中.如此反復(fù)重懸、超聲、離心4次，得合并后的上清約4.5 L，Lowry法檢測(cè)其中肽類的濃度.

1.3超濾

采用PALL Centramate超濾系統(tǒng)切向流過濾上述上清液，先以2個(gè)MWCO300K膜包(PALL，美國)并聯(lián)過濾，濾過液再以2個(gè)MWCO1K膜包(PALL，美國)并聯(lián)過濾.每級(jí)過濾的截留液體積剩余約200 mL時(shí)加入1 L純水繼續(xù)過濾，直至截留液剩余約200 mL.最終獲得約6 L MWCO1K膜包濾過液，將其命名為組分1，Lowry法檢測(cè)肽類濃度.

1.4大孔吸附樹脂富集水溶性活性產(chǎn)物

1.4.1評(píng)價(jià)4種大孔吸附樹脂對(duì)水溶性肽類的靜態(tài)吸附-解吸附效率

按照說明書處理4種大孔吸附樹脂：DA201-C、AB-8、D101和NKA-9(均購自鄭州勤實(shí)科技有限公司)；各取10 mL 樹脂與50 mL 組分1混合，4 ℃層析柜中搖床震蕩；在混合后2,4,6，16 h各取50 μL上清用Lowry法測(cè)定肽類濃度；16 h后去上清，純水洗滌5次，抽干液體，加10 mL 70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇，震蕩2 h，Lowry法測(cè)定溶液的肽類濃度.重復(fù)3次，計(jì)算靜態(tài)吸附率和解吸附率.

1.4.2富集葉片山海綿水溶性活性產(chǎn)物

4 ℃層析柜中，將剩余約5 L 組分1與1.5 kg DA201-C大孔吸附樹脂攪拌混合12 h；純水漂洗5次后將樹脂裝入直徑5.5 cm、高100 cm的層析柱并連入AKATA蛋白純化儀(GE，美國)，檢測(cè)A280信號(hào)峰；用純水以流速5 mL/min洗滌直至電導(dǎo)率接近于0；用70%乙醇以流速5 mL/min洗脫，收集洗脫峰，Lowry法檢測(cè)肽類濃度；洗脫組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除乙醇，冷凍干燥，稱量.以10 mmol/L PBS(pH 7.4)配制500 μg/mL粗提物溶液用于細(xì)胞活性檢測(cè).

1.5腫瘤細(xì)胞顯微觀察

C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、A2780-CP卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞由廈門市中山醫(yī)院贈(zèng)送.細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%(體積分?jǐn)?shù))小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco)，細(xì)胞置于5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次.細(xì)胞活性檢測(cè)：向180 μL的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞中加入20 μL粗提物溶液或負(fù)對(duì)照(10 mmol/L pH 7.4的PBS)，培養(yǎng)12 h后在倒置顯微鏡(Leica DMil)下觀察細(xì)胞形態(tài)變化.

2結(jié)果

2.14種大孔吸附樹脂對(duì)海綿水溶性肽類的靜態(tài)吸附-解吸附效率

海綿水提液超濾后的體積很大，如何高效地對(duì)樣品濃縮和脫鹽成為首要任務(wù).為提高水溶性活性組分的綜合回收效率，本實(shí)驗(yàn)以肽類為檢測(cè)指標(biāo)，測(cè)試了4種不同大孔吸附樹脂對(duì)肽類的靜態(tài)吸附率和解吸附率，結(jié)果如圖1所示.其中DA201-C對(duì)肽類在靜態(tài)吸附率、解吸附率和吸附穩(wěn)定性上有明顯的綜合優(yōu)勢(shì).以吸附2 h為例，DA201-C具有最高的靜態(tài)吸附率(約68%)和最高的解吸附率(約63%)，其綜合回收效率約43%，高于AB-8(約32%)、D101(約23%)和NKA-9(約8%)；且DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)肽類吸附2 h后達(dá)到吸附平臺(tái)，之后吸附率保持穩(wěn)定.由此可見，DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)肽類有綜合回收效率高和吸附穩(wěn)定的特點(diǎn)，適用于完成較大規(guī)模的吸附實(shí)驗(yàn).

圖1　4種大孔吸附樹脂對(duì)海綿水溶性 肽類的靜態(tài)吸附率(a)和靜態(tài)解吸附率(b)Fig.1The adsorption (a) and desorption (b) properties of four macroporous resin types

2.2DA201-C大孔吸附樹脂的洗脫曲線

組分1與DA201-C大孔吸附樹脂攪拌混合過夜后，將吸附了肽類的樹脂裝入層析系統(tǒng)，洗脫曲線如圖2所示.共收集得到2～5 L區(qū)間的約3 L淺黃色解吸液，Lowry法測(cè)得其中含肽類總質(zhì)量約8.01 g.解吸液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥得9.01 g粗提物干粉.

2.3水溶性肽類在提取流程各階段的得率

葉片山海綿在不同提取階段的得率見表1.本流程的出膏率約為2.4%，即從1 kg干質(zhì)量的海綿能獲得大約24 g的粗提物，此粗提物主要成分為小分子肽類，占比約為89%.

檢測(cè)波長280 nm.圖2　DA201-C型大孔樹脂對(duì)肽類的動(dòng)態(tài)解吸曲線Fig.2The dynamic desorption curve of DA201-C macroporous resin

2.4粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞活性的抑制作用

將粗提物以50 μg/mL的終質(zhì)量濃度加入到C6、A2780-CP和HepG2 3種腫瘤細(xì)胞中，并在12 h后于倒置顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖3所示.PBS對(duì)照組的C6細(xì)胞呈梭形，貼壁生長，胞質(zhì)豐富且透明，細(xì)胞核相

表1　肽類在不同提取階段的得率Tab.1　Yields of peptides at different extraction stages

對(duì)較大，細(xì)胞間黏連完好，單層排列密集；經(jīng)過粗提物處理的C6細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞發(fā)生皺縮，胞漿出現(xiàn)“發(fā)芽”結(jié)構(gòu)，其體積明顯減小，細(xì)胞間連接變少(圖3(a)和(b)).PBS對(duì)照組的A2780-CP細(xì)胞呈團(tuán)狀貼壁生長，細(xì)胞黏連較好，細(xì)胞體積較大，胞質(zhì)豐富且均勻；而經(jīng)過粗提物處理后的A2780-CP細(xì)胞體積顯著減小，細(xì)胞核固縮明顯，胞漿出現(xiàn)許多大小不一的空泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞連接較少，數(shù)量也顯著地減少(圖3(c)和(d)).PBS對(duì)照組的HepG2細(xì)胞為梭形，貼壁生長，大小較一致;而經(jīng)粗提物處理后的HepG2細(xì)胞變圓，細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的偏移，均集中在細(xì)胞的一側(cè)，而細(xì)胞膜完整(圖3(e)和(f)).由此可見，海綿的肽類粗提物對(duì)C6、A2780-CP和HepG2細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響顯著，且細(xì)胞數(shù)量減少，證明該粗提物可以抑制這3種腫瘤細(xì)胞的生長，有明顯的抗腫瘤活性.

對(duì)照組：(a)C6細(xì)胞，(c)A2780-CP細(xì)胞，(e)HepG2細(xì)胞； 粗提物處理組(12 h)：(b)C6細(xì)胞， (d)A2780-CP細(xì)胞，(f)HepG2細(xì)胞.圖3　葉片山海綿粗提物處理后腫瘤細(xì)胞的顯微形態(tài)變化Fig.3Morphological changes of tumor cells by treatment with sponge extracts

3討論

肽類具有分子質(zhì)量小、無免疫原性、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和副作用小等特點(diǎn)，具有很高的開發(fā)價(jià)值.海綿也擁有豐富的肽類或其衍生的活性產(chǎn)物，比如海綿來源的三肽化合物Hemiasterlin是微管蛋白的解聚物，能誘導(dǎo)有絲分裂阻滯和細(xì)胞凋亡，具有良好的開發(fā)為抗癌藥物的潛力[6]；從蒂殼海綿屬Theonellasp.中分離得到雙環(huán)肽類Theonellamide A～F，有強(qiáng)烈的抗真菌活性[7].但是已發(fā)現(xiàn)的海綿活性肽類主要是通過有機(jī)萃取獲得的，通常與其他類別的化合物混雜在一起，目前還沒有一個(gè)系統(tǒng)富集海綿肽類的方法，肽的種類、分離效率和規(guī)模受到限制.建立一種系統(tǒng)富集小分子肽類的方法是本研究的關(guān)注點(diǎn).

本方法首先通過超濾去除大分子，再利用大孔吸附樹脂富集水溶性小分子肽類.小分子肽類的提取難點(diǎn)在于脫鹽，許多寡肽和環(huán)肽的相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000，很難與水溶液中的鹽類分開.前期試驗(yàn)了凝膠過濾、納濾、固相萃取和離子交換等方法脫鹽，但這些方法由于通量低、成本高、耗時(shí)長或吸附率低等原因，對(duì)升以上規(guī)模的操作困難極大.多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道了大孔吸附樹脂對(duì)某些肽類有良好的吸附特性[8-10]，可以應(yīng)用于肽類水溶液的脫鹽.但由于肽類結(jié)構(gòu)繁多，理化性質(zhì)多樣，特定樹脂并不能把水溶液中的所有不同種類的肽類都吸附下來.本研究先測(cè)定了4種適用于肽類吸附的大孔吸附樹脂對(duì)海綿水提液肽類的靜態(tài)吸附率和解吸附率，確定了DA201-C大孔吸附樹脂具有最高的綜合回收效率；再通過動(dòng)態(tài)解吸附，對(duì)水提液中肽類的總回收效率達(dá)到57%.整個(gè)脫鹽流程耗時(shí)僅1 d，具有成本低、耗時(shí)少、通量高和易放大等優(yōu)點(diǎn).

粗提物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞明顯的抑制作用表明了本研究的提取方法有效地保留了小分子肽類的生物活性.雖然粗提物的細(xì)胞毒活性濃度處于中等水平，但通過進(jìn)一步的分離純化，有望追蹤獲得活性更高的組分；而且通過更廣泛的活性篩選，比如抗氧化、抗菌和抗病毒等活性篩選模型，很可能會(huì)從中發(fā)現(xiàn)新的活性.優(yōu)化的小分子肽類富集方法為后續(xù)的小分子肽類活性研究，包括更廣泛的活性篩選、活性組分的精細(xì)分離、結(jié)構(gòu)測(cè)定和活性機(jī)理研究等工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

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doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201508019

收稿日期：2015-08-26錄用日期：2015-11-16

基金項(xiàng)目：廈門南方海洋研究中心項(xiàng)目(13GYY002NF07)

*通信作者：chenjun@xmu.edu.cn

中圖分類號(hào):P 745

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0438-0479(2016)04-0506-04

The Enrichment Product from Sponge Mycale phyllophila Water Extract by a Macroporous Resin and Its Anti-tumor Activity

HE Tenfei1，LUO Lianzhong2，CHEN Jun1*，WANG Dexiang1，DING Shaoxiong1

(1.College of Ocean & Earth Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China;2.Department of Pharmacy,Xiamen Medical College，Xiaman 361005，China)

Abstract:Marine sponges contain abundant bioactive compounds.This study established a method that a DA201-C macroporous adsorption resin was used to enrich bioactive products from Mycale phyllophila water extract.Lowry′s assay showed that this method recovered about 57% of the total small molecular peptides from the water extract.The majority compounds of the enrichment product are peptides，accounting for about 89%.In addition，the enriched product has obvious inhibitory activities to C6 glioma cells，A2780-CP ovarian cancer cisplatin-resistant cells and HepG2 hepatoma cells.This study lays the foundation for in-depth study on the anti-tumor compound from M. phyllophila water extract.

Key words:marine sponge;macroporous adsorption resin;peptide;anti-tumor activity

引文格式：賀騰飛，羅聯(lián)忠，陳軍，等.葉片山海綿水溶性活性產(chǎn)物的大孔吸附樹脂分離及其抗腫瘤活性[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016,55(4)：506-509.

Citation：HE T F，LUO L Z，CHEN J,et al．The enrichment product from spongeMycalephyllophilawater extract by a macroporous resin and its anti-tumor activity[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：506-509．(in Chinese)