趙　晨，賈光鋒，陸文總

(西安工業(yè)大學(xué) 電子信息工程學(xué)院，西安 710021)

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壓電型分子印跡傳感器對(duì)棉酚的檢測(cè)*

趙晨，賈光鋒，陸文總

(西安工業(yè)大學(xué) 電子信息工程學(xué)院，西安 710021)

摘要：為了減小棉酚檢測(cè)的檢測(cè)周期，降低檢測(cè)成本，以分子印跡修的銀晶振作為傳感器敏感元件，提出了一種新型壓電分子印跡傳感器.通過(guò)對(duì)棉酚和其相似物的檢測(cè)，證實(shí)了壓電型分子印跡傳感器的靈敏性和特異性.結(jié)果表明：該傳感器的最低檢測(cè)限為6 μg·L-1，檢測(cè)范圍為6～16 μg·L-1(相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6)，響應(yīng)時(shí)間為15 min；在特異性檢測(cè)中，該傳感器對(duì)棉酚的響應(yīng)頻率顯著高于相似物.

關(guān)鍵詞：分子印跡傳感器；棉酚；響應(yīng)頻率；晶振

棉酚是存在于棉屬植物中的一種多元酚化合物，具有毒性[1-2].但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)棉酚還具有很重要的藥用價(jià)值，如抗生育作用[3]，抗腫瘤作用[4]，抗病毒[5]和抗菌作用[6-7]，特別是抗腫瘤活性[8].因此，棉酚的快速檢測(cè)已逐漸被研究者重視.目前國(guó)內(nèi)主要使用的是苯胺比色法和紫外分光光度法.但是，苯胺比色法中苯胺具有較高的毒性，操作危險(xiǎn)，操作步驟繁瑣，不易于區(qū)分棉酚和棉酚結(jié)構(gòu)類似物，干擾大.而紫外法雖然操作簡(jiǎn)便，但樣品不易處理，易被雜質(zhì)干擾，結(jié)果不精確.而隨著尖端儀器的發(fā)展，高效液相法和氣相色譜法也應(yīng)用到棉酚的檢測(cè)中，這兩種方法準(zhǔn)確度高，但成本高，周期長(zhǎng)，樣品需前處理.因此，需要?jiǎng)?chuàng)建一種快速、靈敏的檢測(cè)棉酚的分析方法.而壓電型分子印跡(Molecular Imprinting Polymer-Quartz Crystal Microbalance,MIP-QCM)傳感器可解決這一問(wèn)題.該方法在物質(zhì)檢測(cè)中有多方面的應(yīng)用，文獻(xiàn)[9]制備了適于檢測(cè)鹵代烴等物質(zhì)測(cè)定的壓電分子印跡壓電傳感器，該傳感器的研究成功更利于傳感器的小型化，且易于將印跡聚合物修飾在傳感器上.文獻(xiàn)[10]制備的壓電分子印跡傳感器可檢測(cè)芳香族化合物，且顯示了壓電型分子印跡傳感器良好的穩(wěn)定性，成本低，高靈敏性和響應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)良特性.為解決棉酚的快速檢測(cè)，本文將分子印跡技術(shù)與壓電傳感器結(jié)合，提出了用于棉酚檢測(cè)的壓電型分子印跡傳感器，以期提高棉酚檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)減少檢測(cè)時(shí)間.

1壓電分子印跡傳感器

壓電生物傳感器是基于壓電傳感器的基本原理，將具有生物活性的物質(zhì)如酶、抗體、核酸、蛋白及生物細(xì)胞等生物實(shí)體修飾于石英晶體的表面作為識(shí)別元件.而壓電生物傳感器的關(guān)鍵元件是壓電石英晶片，工作原理是具有各向異性的晶體會(huì)受到機(jī)械應(yīng)力而產(chǎn)生電偶極子.但是如果在具有壓電效應(yīng)的材料上施加一個(gè)電場(chǎng)，該材料的晶格出現(xiàn)形變，且若施加的電場(chǎng)為交變電場(chǎng)，則晶體晶格將產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)；當(dāng)該施加的電場(chǎng)頻率和晶體的固有頻率一致時(shí)，則晶體出現(xiàn)壓電諧振，此時(shí)的頻率為稱為諧振頻率，且該頻率與石英晶體物理尺寸和性質(zhì)相關(guān).1959年，Sauerbrey提出在石英晶體表面加上一層質(zhì)量負(fù)載層，導(dǎo)致晶振頻率下降.晶體表面負(fù)載的質(zhì)量與諧振頻率之間的關(guān)系為

(1)

式中：ΔM為質(zhì)量的改變(g)；ΔF為質(zhì)量改變所造成的頻率變化；F為石英晶體的諧振頻率(Hz)；A為石英晶體的面積(cm2).

壓電晶體靈敏度較高，被測(cè)物的質(zhì)量檢測(cè)限可達(dá)1×10-12g，因此振動(dòng)的石英晶體是靈敏的質(zhì)量檢測(cè)器，被稱作石英晶體微天平(Quartz Crystal Microbalance，QCM).壓電分子印跡傳感器傳感器主要分石英晶體微天平傳感器和表面聲波(Surface Acoustic Wave，SAW)傳感器.目前，QCM分子印跡(MIP-QCM)傳感器應(yīng)用最為廣泛.MIP-QCM傳感器的基本原理就是將分子印跡聚合物修飾在石英晶體表面，利用其分子識(shí)別功能，當(dāng)待測(cè)模板分子(目標(biāo)分子)與所固定的識(shí)別物相互作用而產(chǎn)生結(jié)合時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致晶體表面質(zhì)量負(fù)載的增加，所吸附的模板分子(目標(biāo)分子)的量可以通過(guò)傳感器的頻率變化加以監(jiān)測(cè).石英晶體的修飾方法一種是將高聚物粒子固定化于QCM的電極上；另一種則是在電極上“就地”聚合.分子印跡壓電生物傳感器對(duì)被測(cè)物的檢測(cè)在溶液中進(jìn)行，實(shí)時(shí)檢測(cè)被測(cè)物與印跡聚合物的結(jié)合過(guò)程.

2材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)材料

四氫呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，聚氯乙烯(Polyvinyl Chlorde，PVC)，均為分析純.棉酚購(gòu)買于Sigma公司，棉酚相似物(Tetra-Acetylapogossypol)為棉酚中間產(chǎn)物，制備于實(shí)驗(yàn)室中.棉酚分子印跡聚合物制備于實(shí)驗(yàn)室中[11].

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1壓電分子印跡傳感器的設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)檢測(cè)通道，在檢測(cè)電路中，將分子印跡聚合物或非印跡聚合物修飾在壓電晶體上，分子印跡聚合物與待測(cè)物特異性結(jié)合，而非印跡聚合物發(fā)生了非特異性吸附，將兩者頻率對(duì)比，計(jì)算兩路頻率差值.該過(guò)程中，去除了外在的干擾，使結(jié)果更為準(zhǔn)確.在實(shí)驗(yàn)中采用直徑 ?8 mm和 ?16 mm的兩面鍍銀石英晶體， 5 V工作電壓的震蕩電路，以及高精度通用計(jì)數(shù)器對(duì)震蕩頻率進(jìn)行檢測(cè).

2.2.2壓電傳感器銀晶振電極表面修飾

取一定量的分子印跡聚合物或非印跡聚合物溶于10 mL的THF溶液中，超聲30 min使溶液分散.然后，加入20 mg聚氯乙烯.在電極以200 rpm的速度旋轉(zhuǎn)的情況下，將該懸浮液滴加到銀晶振電極上(20 MHz，直徑為 ?8 mm或 ?16 mm).當(dāng)THF溶液在室溫下?lián)]發(fā)完全后，銀晶振電極表面修飾了一層表面分子印跡聚合物.這一過(guò)程重復(fù)3次，直到銀晶振電極表面被修飾好，且分子印跡聚合物的厚度為200 μm.其中分子印跡聚合物的制備在前期工作中已有報(bào)道[12-13].

2.2.3分子印跡壓電傳感器對(duì)棉酚的檢測(cè)

將這5種不同濃度的棉酚溶液以1～2 mL·min-1的速度噴灑到密閉容器中，樣品溶液被氣化.密閉容器內(nèi)氣化的樣品壓力穩(wěn)定時(shí)，壓電傳感器顯示與棉酚濃度相關(guān)的頻率改變.而且壓電傳感器頻率的變化可通過(guò)式(1)來(lái)計(jì)算.當(dāng)電極表面修飾了印跡聚合物后，ΔF值會(huì)減少.而當(dāng)棉酚與印跡聚合物結(jié)合后，ΔF值也會(huì)減少.則頻率變化為

Δf=ΔF1-ΔF0

(2)

式中：ΔF1為結(jié)合物樣品時(shí)的響應(yīng)頻率；ΔF0為結(jié)合樣品后壓電傳感器的響應(yīng)頻率.且其中Δf，ΔF1和ΔF0的值均由頻率計(jì)數(shù)器顯示.Δf可消除壓電印跡傳感器的非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的誤差.同時(shí)，也檢測(cè)了壓電傳感器的響應(yīng)時(shí)間，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，Δf值逐漸增大，到達(dá)一定時(shí)間后，趨于平緩，此時(shí)反應(yīng)到達(dá)飽和，而且此時(shí)的Δf值為所求的響應(yīng)頻率.

棉酚分子印跡壓電傳感器對(duì)棉酚相似物質(zhì)(Tetraacety Lapogossypol)也進(jìn)行了檢測(cè)，方法與對(duì)棉酚的檢測(cè)方法相同.通過(guò)兩者結(jié)果的比較可得出分子印跡壓電傳感器的特異性.棉酚及其相似物的壓電傳感器檢測(cè)過(guò)程如圖1所示.

圖1　棉酚分子印跡壓電傳感器檢測(cè)示意圖Fig.1　The detection of gossypol with piezoelectric imprinting sensor

3結(jié)果及分析

3.1分子印跡聚合物對(duì)晶振表面的修飾

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),制備的表面分子印跡聚合物必須均勻涂布在晶振表面，壓電傳感器的頻率才能達(dá)到穩(wěn)定.為了使表面分子印跡聚合物在THF溶液中分布均勻，采用超聲方法.將THF與分子印跡聚合物混合后，進(jìn)行超聲震蕩，且超聲時(shí)間為30 min為最佳.未超聲的分子印跡聚合物在晶振表面的分布結(jié)果如圖2(a)所示，可明顯看到印跡聚合物分散不均勻，有的地方密集，有的地方分散.超聲處理的結(jié)果如圖2(b)所示，可看到分子印跡聚合物在超聲后分散均勻.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，當(dāng)THF與表面分子印跡聚合物混合并超聲后，再加入聚氯乙烯效果更好.如果將聚氯乙烯、THF和表面分子印跡聚合物一起混合，再超聲30 min，超聲作用會(huì)使膠狀物質(zhì)THF和聚氯乙烯匯聚在一起，導(dǎo)致表面分子印跡聚合物無(wú)法均勻分布.如圖2(c)所示，可看出印跡聚合物團(tuán)聚在一起，這是由于THF和聚氯乙烯混合后，將聚合物凝聚在一起.修飾后的壓電晶體晶振頻率明顯下降，且頻率值基本穩(wěn)定.

晶振是壓電傳感器的轉(zhuǎn)換元件，對(duì)其修飾的方法是先將THF與表面分子印跡聚合物混合并超聲再加入PVC，如果在修飾過(guò)程中，操作不當(dāng)，致使分子印跡聚合物在晶振表面分布不均勻或形成的印跡聚合物層過(guò)厚，會(huì)導(dǎo)致晶振頻率不穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確.

3.2壓電型分子印跡傳感器的靈敏性檢測(cè)

使用了兩種直徑的晶振電極，分別對(duì)這兩種晶振電極進(jìn)行了分子印跡聚合物的修飾，并進(jìn)行棉酚的檢測(cè)，得到不同的結(jié)果.使用直徑為?8 mm的晶振作為壓電傳感器的電極時(shí)，當(dāng)樣品濃度C達(dá)到10 μg·L-1時(shí)，響應(yīng)頻率達(dá)到穩(wěn)定.即增大樣品濃度，響應(yīng)頻率將不再發(fā)生變化.而樣品濃度為6 μg·L-1時(shí)，響應(yīng)頻率能夠顯示；低于該濃度，壓電傳感器無(wú)法顯示，說(shuō)明壓電傳感器的檢測(cè)下限為6 μg·L-1.檢測(cè)結(jié)果如圖3(a)所示.對(duì)棉酚濃度的檢測(cè)范圍在6～10 μg·L-1，并且在該范圍內(nèi)有好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8).使用直徑為 ?16 mm的晶振作為壓電傳感器的電極，結(jié)果顯示如圖3(b)所示.該壓電傳感器的檢測(cè)限(信噪比S/N=3)為6～16 μg·L-1，并且在該范圍內(nèi)顯示了良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6).同時(shí)，在該方法中，檢測(cè)濃度增大到16 μg·L-1時(shí)，響應(yīng)頻率趨于平緩，而檢測(cè)下限依然為6 μg·L-1.這說(shuō)明分子印跡壓電傳感器的靈敏度為6 μg·L-1，而檢測(cè)范圍是6～16 μg·L-1.晶振面積對(duì)壓電分子印跡傳感器的檢測(cè)能力極為重要.直徑為 ?8 mm的晶振由于面積小，檢測(cè)范圍太窄(6～10 μg·L-1)，不適合應(yīng)用.直徑為 ?16 mm的晶振檢測(cè)范圍可增加到6～16 μg·L-1.但是再增大電極的面積，會(huì)導(dǎo)致分子印跡聚合物難于修飾，且修飾的印跡聚合物不均一，而靈敏性降低.

圖2　表面分子印跡聚合物的分散狀態(tài)(300 μm)Fig.2　The dispersed state of surface molecular imprinting polymer (300 μm)

在圖3中可看到，非印跡聚合物(Non Imprinted Polymer,NIP)也修飾在壓電傳感器上，得到非印跡壓電傳感器(Non Imprinted Polymer-Quartz Crystal Microbalance,NIP-QCM).并使用NIP-QCM對(duì)棉酚也進(jìn)行了檢測(cè)，并得到結(jié)果與MIP-QCM進(jìn)行了比較.NIP-QCM的值明顯要低于MIP-QCM，說(shuō)明該方法可快速和精確的檢測(cè)棉酚.

圖3　壓電傳感器對(duì)棉酚檢測(cè)結(jié)果Fig.3　QCM detection results for gossypol

同時(shí)，通過(guò)壓電分子印跡傳感器與其他檢測(cè)方法[14-15]的靈敏度比較，壓電分子印跡傳感器具有更高的靈敏度，見表1.表1給出了高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography-Ultraviolet，HPLC-UV)和壓電分子印跡傳感器(MIP-QCM)對(duì)棉酚檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限和線性范圍.從表1可看出，壓電分子印跡傳感器的檢測(cè)限最低 (6 μg·L-1).其最低檢測(cè)限低于HPLC-UV方法檢測(cè)限 (3 mg·L-1，見表1).且比HPLC-UV法更簡(jiǎn)單、便宜和快速.因此，壓電分子印跡傳感器是一種更為靈敏、快速和高效的檢測(cè)裝置，可廣泛應(yīng)用.

表1　不同方法檢測(cè)棉酚的靈敏度Tab.1　Sensitivity of different methods

3.3壓電分子印跡傳感器的特異性

圖4為隨著時(shí)間變化Δf的改變曲線圖.檢測(cè)了棉酚和其相似物對(duì)頻率響應(yīng)的比較，表示了壓電分子印跡傳感器的特異性.棉酚分子印跡壓電傳感器對(duì)棉酚具有很高的響應(yīng)頻率，且響應(yīng)頻率值顯著高于相似物.這是由于分子印跡聚合物具有專一與棉酚結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)和識(shí)別位點(diǎn)，這在結(jié)合過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用.因此,被棉酚分子印跡聚合物修飾過(guò)的壓電傳感器同樣具有了高的特異性，在識(shí)別棉酚時(shí)能具有高的響應(yīng)頻率.而識(shí)別其相似物時(shí)，由于，結(jié)合空間和識(shí)別位點(diǎn)的不配對(duì)，無(wú)法結(jié)合而具有很低的響應(yīng)頻率.

圖4　壓電分子印跡傳感器對(duì)特異性檢測(cè)Fig.4　Piezoelectric imprinted sensor detection results for selectivity

由圖4可看出，隨反應(yīng)時(shí)間的增大，Δf值逐漸增大，當(dāng)時(shí)間為15 min時(shí)，Δf值趨于穩(wěn)定，曲線達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài).這說(shuō)明壓電傳感器的響應(yīng)時(shí)間為15 min，表明MIP-QCM在檢測(cè)棉酚時(shí)具有快速響應(yīng)，高穩(wěn)定性和高特異性等優(yōu)點(diǎn).其高特異性與其他方法的比較見表1，其中壓電傳感器具有最高的特異性和靈敏性.

3.4壓電分子印跡傳感器的誤差分析

在棉酚檢測(cè)過(guò)程中存在檢測(cè)數(shù)據(jù)不穩(wěn)定、數(shù)據(jù)出現(xiàn)誤差的現(xiàn)象，這是由于壓電分子印跡傳感器制備過(guò)程中多因素導(dǎo)致的測(cè)量結(jié)果誤差.誤差產(chǎn)生的原因具體包括：① 石英晶體頻率不穩(wěn)定.由于石英晶體工藝的限制而導(dǎo)致比率不穩(wěn)定.在選擇石英晶體時(shí)，應(yīng)選擇工藝好的石英晶體，并進(jìn)行頻率測(cè)定，選用頻率穩(wěn)定的石英晶體.② 轉(zhuǎn)換電路的設(shè)計(jì)要考慮石英晶體的基頻，使兩者匹配.否則會(huì)影響傳感器的測(cè)量精度.③ 環(huán)境干擾.環(huán)境對(duì)壓電分子印跡傳感器測(cè)定結(jié)果有干擾，因此，一個(gè)密閉的檢測(cè)環(huán)境可減少外環(huán)境對(duì)傳感器的影響.④ 確保晶體表面潔凈.晶體需要在使用前清洗，但是在清洗過(guò)程中，電極會(huì)受到損傷，影響頻率穩(wěn)定，最終導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定.

4結(jié) 論

將分子印跡聚合物修飾在壓電晶體上，提出了一種具有高靈敏性和特異性的壓電型分子印跡傳感器.該傳感器的最低檢測(cè)限為6 μg·L-1，檢測(cè)范圍為6～16 μg·L-1，響應(yīng)時(shí)間為15 min.對(duì)棉酚檢測(cè)的響應(yīng)頻率顯著高于相似物.與紫外法和HPLC-UV法對(duì)棉酚檢測(cè)的靈敏性相比，壓電分子印跡傳感器的檢測(cè)限遠(yuǎn)低于這兩種方法.壓電分子印跡傳感器是一種檢測(cè)靈敏、檢測(cè)成本低廉的棉酚檢測(cè)裝置.

參 考 文 獻(xiàn)：

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(責(zé)任編輯、校對(duì)張超)

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DOI:10.16185/j.jxatu.edu.cn.2016.06.013

*收稿日期：2015-11-26

基金資助：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014JQ2-8053)

作者簡(jiǎn)介：趙晨(1981-)，女，西安工業(yè)大學(xué)講師，主要研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)工程.E-mail：19379886@qq.com.

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:中圖號(hào)：R446.5；TP212A

文章編號(hào)：1673-9965(2016)06-0504-06

Gossypol Detection by Piezoelectricity Molecular Imprint Sensor

ZHAOChen,JIAGuangfeng,LUWenzong

(School of Electronic Information Engineering，Xi’an Technological University,Xi’an 710021,China)

Abstract:In order to reduce testing cycle and testing cost in gossypol detection,a novel piezoelectric sensor was developed by sensitive element which was the silver crystal modified by molecular imprinting polymers.Both of sensitivity and specificity for the sensor was confirmed by its detection of gossypol and the similar.The result displayed the perfect characters of this novel sensor,such as detection limit of 6 μg·L-1,detection range of 6～16 μg·L-1(correlation coefficient R2=0.999 6) and response time of 15 min.The response frequency of the sensor to gossypol was much higher than that of similar molecular.

Key words:molecular imprinting sensor;gossypol;response frequency;crystal oscillator