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        白金定癇片抗癲癇及神經(jīng)保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究

        2016-08-04 09:41:47朱穎文繆曉路盧慧清伍小玲
        關(guān)鍵詞:癲癇

        朱穎文,繆曉路,盧慧清,伍小玲

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        白金定癇片抗癲癇及神經(jīng)保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究

        朱穎文,繆曉路,盧慧清,伍小玲

        廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬東莞市中醫(yī)院(廣東東莞 523000),E-mail: zzzhongyi@yeah.net

        摘要:目的觀察白金定癇片對(duì)致癇大鼠抗癲癇及神經(jīng)保護(hù)的作用。方法將47只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組、模型組予生理鹽水,對(duì)照組予丙戊酸鈉片,實(shí)驗(yàn)組予白金定癇片。每日1 次灌胃給藥,連續(xù)3 d。于第3天灌胃給藥后1 h,正常組予腹腔注射生理鹽水,其余組腹腔注射1%戊四唑60 mg/kg, 造癲癇模型。觀察各組大鼠癇樣發(fā)作行為,并測(cè)定大鼠海馬部位的神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)的水平。結(jié)果與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組大鼠完全停止發(fā)作時(shí)間縮短,重度發(fā)作發(fā)生率和死亡率都有所下降;其中完全停止發(fā)作時(shí)間上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);實(shí)驗(yàn)組NSE水平與模型組比較有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論白金定癇片有一定的抗癲癇作用,對(duì)大鼠的海馬部位神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

        關(guān)鍵詞:癲癇;白金定癇片;行為學(xué);神經(jīng)元特異性烯醇酶

        癲癇一種反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。無(wú)論臨床或亞臨床的癇樣放電,特別是癲癇持續(xù)狀態(tài),均有實(shí)驗(yàn)或臨床證據(jù)表明可以引起大腦神經(jīng)元損傷,進(jìn)而導(dǎo)致記憶、語(yǔ)言、定向等認(rèn)知功能損害。神經(jīng)元特異性烯醇酶(neuron-specific enolase,NSE)是神經(jīng)元損傷的敏感性標(biāo)志物,具有較高的特異性,且在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中顯著增高[1]。白金定癇片是我院用于治療癲癇的院內(nèi)制劑。本實(shí)驗(yàn)觀察白金定癇片對(duì)致癇動(dòng)物行為學(xué)以及海馬部位神經(jīng)元特異性烯醇酶的影響,以期從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中論證白金定癇片具有抗癲癇及神經(jīng)保護(hù)的雙重作用。

        1材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠,SPF級(jí),體重220 g±260 g,由廣東藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,飼養(yǎng)3 d適應(yīng)環(huán)境后再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

        1.2實(shí)驗(yàn)藥品白金定癇片(粵藥制字Z20070474),由東莞市中醫(yī)院制劑室提供,批號(hào):20130801;丙戊酸鈉片,湖南省湘中制藥有限公司,每片0.2 g;批號(hào):140424。

        1.3實(shí)驗(yàn)試劑及儀器戊四唑,Alfa Aesar公司,批號(hào): 10169798;神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)試劑盒,天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司,批號(hào): 2015010701;磷酸鹽緩沖溶液(PBS),賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。 酶標(biāo)儀(Thermo)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)。

        1.4藥物的配制白金定癇片(大鼠的等效劑量5.664 g/kg):取12片白金定癇片,研磨成粉,再用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液(CMC-Na)配至100 mL,放置冰箱備用。丙戊酸鈉片(大鼠等效劑量180 mg/kg):取9片丙戊酸鈉片,研磨成粉,再用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液(CMC-Na)配至100 mL,放置冰箱備用。

        1.5動(dòng)物分組與給藥SPF級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)、模型組(14只)、對(duì)照組(11只)、實(shí)驗(yàn)組(12只)。對(duì)照組、模型組予生理鹽水,對(duì)照組予丙戊酸鈉片,實(shí)驗(yàn)組予白金定癇片。按10 mL/kg體重灌胃給藥, 每日1 次灌胃給藥,連續(xù)3 d。各組動(dòng)物于第3天灌胃給藥后1 h,正常組腹腔注射相應(yīng)體積的生理鹽水,其余各組腹腔注射1%戊四唑注射液60 mg/kg, 造癲癇模型。

        1.6大鼠致癇行為學(xué)觀察根據(jù)Racine分級(jí)法標(biāo)準(zhǔn),觀察各組大鼠癇樣發(fā)作行為,0級(jí):無(wú)驚厥;Ⅰ級(jí):濕狗樣顫動(dòng),面肌抽動(dòng)、咀嚼;Ⅱ級(jí):面部陣攣伴節(jié)律性點(diǎn)頭;Ⅲ級(jí):面部陣攣、節(jié)律性點(diǎn)頭、前肢陣攣;Ⅳ級(jí):前肢陣攣、后肢站立;Ⅴ級(jí):失平衡、跌倒、四肢抽動(dòng)、全身陣攣。Ⅰ級(jí)~Ⅲ級(jí)為輕度發(fā)作;Ⅳ級(jí)以上為重度發(fā)作。連續(xù)觀察60 min, 并記錄大鼠癲癇完全停止發(fā)作時(shí)間(包括Ⅰ級(jí)~Ⅴ級(jí))、重度發(fā)作(相當(dāng)于Ⅳ級(jí)~Ⅴ級(jí))發(fā)生率和死亡率。

        1.7大鼠海馬部位NSE測(cè)定實(shí)驗(yàn)癇樣發(fā)作1 h后,脫臼處死大鼠,取腦,分離海馬部位,稱(chēng)取重量。按1∶9(海馬體重/生理鹽水體積)的體積比加入PBS(pH 7.4),用玻璃勻漿器將標(biāo)本勻漿充分(保持在冰水環(huán)境下勻漿)。低溫離心10 min(3 000 r/min)。仔細(xì)收集上清液。分裝兩份,取一份待檢測(cè)NSE水平(采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定),另一份冷凍備用。

        2結(jié)果

        2.1白金定癇片對(duì)戊四唑誘導(dǎo)大鼠癇樣發(fā)作行為的影響(見(jiàn)表1)

        表1 白金定癇片對(duì)戊四唑誘導(dǎo)大鼠

        2.2白金定癇片對(duì)大鼠海馬部位NSE的影響(見(jiàn)表2)

        表2 白金定癇片對(duì)癲癇大鼠

        3討論

        癲癇,俗稱(chēng)“羊癲風(fēng)” 或“羊角風(fēng)”,屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“癇證”的范疇,是一組由不同病因所引起,腦部神經(jīng)元高度同步化,由自限性的異常放電所導(dǎo)致。中樞性神經(jīng)系統(tǒng)失常為特征的綜合征。國(guó)內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示患病率為0.5%,全國(guó)有600萬(wàn)~700萬(wàn)病人[2]。研究認(rèn)為癲癇所致腦損傷可為短暫可逆性的影像學(xué)異常,也可形成腦結(jié)構(gòu)改變,如海馬硬化、皮質(zhì)萎縮等,并進(jìn)一步導(dǎo)致難治性癲癇;同時(shí)亞臨床癇樣放電病人出現(xiàn)的認(rèn)知缺損證實(shí)了癇樣放電對(duì)腦組織的損害??拱d癇藥物(anti-epileptic drugs,AEDs)在降低腦細(xì)胞易激惹性的同時(shí),也降低了興奮性,且影響認(rèn)知功能,所以選擇性應(yīng)用腦保護(hù)劑是有益的[3]。因此,目前研究方向要求新型抗癲癇藥物在控制癲癇發(fā)作的同時(shí)能具有良好的腦保護(hù),即神經(jīng)保護(hù)作用,以達(dá)到一舉兩得的效果。

        NSE主要存在于大腦神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi), 并參與糖酵解的特異性酶。神經(jīng)元損傷或壞死后,NSE從細(xì)胞內(nèi)溢入腦脊液和血液。因此,NSE是檢測(cè)腦內(nèi)神經(jīng)元損傷或壞死的客觀指標(biāo)[4]。有研究報(bào)道戊四氮點(diǎn)燃癲癇發(fā)作過(guò)程中海馬各區(qū)的NSE 表達(dá)增加,明顯高于對(duì)照組,隨著點(diǎn)燃的進(jìn)行、發(fā)作級(jí)別的增高,NSE表達(dá)明顯增加[5],而且認(rèn)為臨床NSE與癇性發(fā)作頻率、持續(xù)時(shí)間有關(guān),頻繁或持續(xù)發(fā)作將導(dǎo)致更嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷。通過(guò)對(duì)血清NSE檢測(cè),可早期發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作是否引起腦損傷及機(jī)體是否啟動(dòng)神經(jīng)保護(hù),為臨床診斷、評(píng)價(jià)嚴(yán)重程度、預(yù)測(cè)預(yù)后提供一項(xiàng)敏感的生化指標(biāo)[6]。

        本實(shí)驗(yàn)以戊四唑注射液腹腔給藥方式建立致癇動(dòng)物模型,以預(yù)處理給藥方法觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致癇后行為學(xué)改變,以及對(duì)致癇后海馬部位NSE的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)大鼠完全停止發(fā)作時(shí)間縮短,重度發(fā)作發(fā)生率和死亡率都有所下降;其中完全停止發(fā)作時(shí)間上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明白金定癇片有抗癇樣作用,但與丙戊酸納片比較無(wú)優(yōu)勢(shì)。與正常組比較,模型組大鼠的海馬部位NSE水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說(shuō)明大鼠癲癇發(fā)作后其海馬部位神經(jīng)受損傷,造模成功。與模型組及對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組NSE水平顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說(shuō)明白金定癇片對(duì)海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用,可以阻斷大鼠癇樣發(fā)作導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷。

        白金定癇片是根據(jù)我院老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方制定的中成藥物,由苦參、郁金、石菖蒲、遠(yuǎn)志、珍珠層粉等中藥組成,具有定驚、安神、寧心作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為白金定癇片有一定的抗癲癇作用,同時(shí)具有神經(jīng)保護(hù)的雙重作用。

        參考文獻(xiàn):

        [1]陳瑯,季曉林.腦啡肽、神經(jīng)肽Y、神經(jīng)元特異性烯醇酶與癲癇[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)情報(bào),2004,25(1):7-11.

        [2]吳江,賈建平,崔麗英.神經(jīng)病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:264.

        [3]劉忠霖,王麗敏.癲癇性腦病[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2012:431-471.

        [4]De Giorgio CM,Correale JD,Gott PS,et al.Serum neuron specificenolase in human status cepilepticus[J].Neurology,1995,45: 1134-1137.

        [5]馬玉新,陰金波,陳煥然,等.PTZ點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬NSE和BMP4的表達(dá)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,29(12):1183-1186.

        [6]高艷波,張暉.神經(jīng)元特異性烯醇化酶和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1在癲癇中的研究進(jìn)展[J].國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志,2010,37(4):332-336.

        (本文編輯薛妮)

        基金項(xiàng)目:廣東省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目(No.20131074)

        中圖分類(lèi)號(hào):R742.1R255

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

        doi:10.3969/j.issn.1672-1349.2016.12.010

        文章編號(hào):1672-1349(2016)12-1340-02

        (收稿日期:2015-09-18)

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