董文培，李　濤，于　平，李　權(quán)，張鐵龍，梁軍號

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院泌尿外科，上?！?00092;2.上海交通大學醫(yī)學院，上?！?00025)

?

·基礎(chǔ)研究·

董文培1,2，李濤1,2，于平2，李權(quán)1,2，張鐵龍1,2，梁軍號1,2

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院泌尿外科，上海200092;2.上海交通大學醫(yī)學院，上海200025)

摘要：目的觀察在動物模型中遠端缺血預(yù)處理(RIPC)對缺血再灌注后腎功能是否有保護作用。方法將雄性SD大鼠24只隨機分成4組各6只：空白組，缺血再灌注組，早期RIPC組，晚期RIPC組?？瞻捉M僅分離左右腎蒂及腎周組織，45 min后關(guān)腹；缺血灌注組于大鼠右下肢置松弛止血帶30 min后分離左右腎蒂和腎周組織，切除右腎并夾閉左腎蒂45 min后復灌；早RIPC組和晚RIPC組先行30 min RIPC后，兩者分別于即刻和24 h后采取同缺血灌注組措施。術(shù)后24 h檢測血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)，取左腎組織行HE染色病理分析和檢測髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)。結(jié)果缺血灌注組、早RIPC組和晚RIPC組術(shù)后24 h的Cr、BUN、MPO、MDA、SOD和病理評分各項指標均顯著升高(P<0.05)。與缺血灌注組相比，早RIPC組和晚RIPC組有顯著保護效果，且晚RIPC組保護效果較早RIPC組好(P<0.05)。結(jié)論RIPC可為缺血再灌注后腎功能提供保護，且晚期保護窗作用較明顯，其機制可能與降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎性細胞浸潤有關(guān)。

關(guān)鍵詞：遠端缺血預(yù)處理；缺血再灌注；腎功能

在泌尿外科手術(shù)中，如腎部分切除術(shù)、腎移植手術(shù)等，腎臟會面臨一段缺血過程，而后血流復灌將導致缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IRI)。不少保護措施，如縮短缺血時間、術(shù)中采取低溫措施等可降低缺血再灌注對器官的損傷。1986年缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning, IPC)的現(xiàn)象在動物心臟缺血再灌注中被發(fā)現(xiàn)[1]。MURRY等[1]證實對左回旋支冠狀動脈進行缺血預(yù)處理后，可減少其后缺血對心肌的損傷。在1993年，PRZYKLENK等[2]發(fā)現(xiàn)遠端缺血預(yù)處理現(xiàn)象(remote ischemic preconditioning,RIPC)，即通過對冠狀動脈回旋支的預(yù)處理，可降低左前降支冠脈梗阻引起的心肌梗死損傷范圍。此后，更多研究發(fā)現(xiàn)對心外器官或組織，如腎臟[3]、小腸[4]、肢端[5]的缺血預(yù)處理也能實現(xiàn)對心臟的保護作用，并且不同時期保護作用不同[6]。但是目前，RIPC對腎功能的保護作用仍具有爭議性[7-9]。為此，本研究的目的在于動物模型中探尋RIPC對腎功能是否有保護作用，并比較不同時期RIPC作用的差異性。

1材料與方法

1.1實驗動物與手術(shù)方法本實驗采用雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley, SD)大鼠(210±20)g，予以標準飲食喂養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食，不禁飲。本實驗動物隨機分成4組:空白組、缺血再灌注組、早期RIPC組、晚期RIPC組，每組6只。以4 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，空白組開腹，分離左右腎蒂及腎周組織，45 min后關(guān)腹；缺血灌注組于右下肢股骨上1/3置松弛止血帶30 min，后開腹分離左右腎蒂和腎周組織，在切除右腎并以微創(chuàng)血管夾夾閉左腎蒂45 min后，松開血管夾復灌，關(guān)腹；早期RIPC 組先在右下肢股骨上1/3以止血帶夾閉5 min和松開5 min，連續(xù)3個循環(huán)共計30 min的RIPC后，其余措施同缺血灌注組[5]；晚期RIPC組采取同早RIPC組預(yù)處理后，24 h后，再采取同缺血灌注組措施。所有動物在術(shù)后24 h處死。

1.2標本采集與檢測所有動物在分離右腎蒂時，采集右腎動脈血樣檢測術(shù)前Cr、BUN。在處死前，采集左腎動脈血樣檢測術(shù)后24 h的Cr、BUN，同時取下左腎組織，一分為二，一份置于4%多聚甲醛中留后HE染色行病理分析；一份凍存用于檢測MPO、MDA和SOD。上述指標采用相應(yīng)試劑盒檢測(南京建成科技有限公司)。

1.3HE染色及病理診斷將保存于4%多聚甲醛的腎組織制成5 μm厚度切片后進行HE染色。病理切片評分標準采用PALLER[10]和YURDAKUL[11]的腎小管損傷評分法。

2結(jié)果

2.1急性腎損傷造模評判在24 h后，與空白組相比，缺血灌注組的Cr，BUN顯著增高(P<0.01)。在腎組織氧化應(yīng)激損傷指標MPO、MDA、SOD上，缺血灌注組均高于空白組，有顯著意義(P<0.01)，表明急性腎損傷模型造模成功(表1)。

2.2腎損傷指標經(jīng)過RIPC預(yù)處理后，早期RIPC組和晚期RIPC組的Cr、BUN、MPO、MDA水平低于缺血灌注組(P<0.05)。在Cr、MPO、MDA指標上，早期RIPC組和晚期RIPC組相比，無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)；但在BUN指標上，早期RIPC組顯著高于晚期RIPC組(P<0.05)；在SOD指標上，早期RIPC組和晚期RIPC組高于缺血灌注組，晚期RIPC組較早期RIPC組高(P<0.05，見表1)。

表1腎功能損傷指標

△：與空白組比較，P<0.05；#：與缺血灌注組比較，P<0.05；*：與早期RIPC組比較，P<0.05。

2.3腎HE病理評分早期RIPC組和晚期RIPC組病理得分顯著低于缺血灌注組(P<0.001)，且晚期RIPC組得分低于早期RIPC組(P<0.05，圖1)。在腎小管HE病理切片上，在空白組看見部分小管細胞腫脹，刷狀緣缺失和細胞凋亡；在缺血灌注組，除上述病理改變外，可見管腔多灶性壞死、管腔碎片以及管腔扁平擴張和管型；早期RIPC和晚期RIPC組亦可見灶性壞死、管腔扁平擴張和管型，但損傷程度較缺血灌注組小(圖2)。

圖1術(shù)后24 h腎小管HE病理評分比較

*：晚期RIPC與早期RIPC組相比，P<0.05；#：空白組、早期RIPC組分別與缺血灌注組相比，P<0.001。

圖2術(shù)后24 h腎小管病理鏡下觀(HE，×400)

A：空白組；B：缺血灌注組；C：早期RIPC組；D：晚期RIPC組。

↑：細胞腫脹，刷狀緣消失和細胞凋亡；☆：灶性壞死；△：小管扁平擴張或管型。

3討論

機體在正常生理情況下氧自由基的形成量極少，壽命短，加上機體自由基的清除系統(tǒng)，兩者在體內(nèi)維持動態(tài)平衡。在平衡體系中，超氧化物歧化酶SOD作為氧自由基清除劑的代表，一定程度上代表了氧自由基清除活力的指標；丙二醛MDA作為生物膜脂質(zhì)降解的主要代謝產(chǎn)物，常作為反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的指標[12-14]。髓過氧化物酶MPO是中性粒細胞和巨噬細胞的功能和激活標志，反映組織炎性細胞浸潤程度[15]。

器官血液供應(yīng)中斷將會導致缺血再灌注損傷，在缺血狀態(tài)下，缺氧組織間發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的高活性自由基，破壞自由基產(chǎn)生和清除的平衡系統(tǒng)，加劇生物膜的氧化損傷，引起并促進炎性細胞浸潤，進一步加劇細胞和組織損傷。

RIPC最早由PRZYKLENK等[2]在動物模型中發(fā)現(xiàn)具有縮小心梗面積的保護作用，在心外科領(lǐng)域運用于臨床。RIPC對腎功能的保護作用具有爭議性[7-9]，對既往回顧性分析發(fā)現(xiàn)其在動物模型中保護作用較明顯，在臨床試驗中因患者選擇，RIPC方案、手術(shù)方式等因素造成不同研究間保護差異較大。本研究建立在大鼠急性腎缺血再灌注模型后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)RIPC預(yù)處理后的早期RIPC、晚期RIPC組的損傷程度較低。通過對實驗觀察指標分析，RIPC預(yù)處理可能通過某種機制在一定程度上降低了氧自由基生成和MDA水平，同時增加SOD活力，提升組織中自由基清除能力；此外顯著降低髓過氧化物酶MPO水平，降低炎性細胞浸潤，改善腎功能Cr、BUN指標，提供明顯的保護作用。

RIPC保護作用分為兩個時期：早期保護窗(acute phase)和晚期保護窗(delayed phase)[9，16]。早期保護窗在RIPC預(yù)處理后即可起效，作用時間約4 h；晚期保護窗在預(yù)處理后約12 h發(fā)揮作用，持續(xù)時間可達72 h[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)晚期RIPC可提升SOD活力和改善BUN，降低腎小管損傷，較早期RIPC有明顯優(yōu)勢?？赡軝C制是晚期RIPC激活并通過體液循環(huán)等作用影響了腎組織的基因轉(zhuǎn)錄和表達，為腎臟提供更多的保護作用，這在非腎器官心肺等臟器的研究中得到證實[18]。

總之，RIPC預(yù)處理可能通過某種機制抑制氧自由基生成的同時，促進超氧化物歧化酶活力升高，降低了生物膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善了炎性細胞浸潤，為缺血再灌注后腎功能提供保護作用，晚期RIPC的保護作用明顯。RIPC的保護機制和運用有待進一步深入研究。

參考文獻：

[1] MURRY C E, JENNINGS R B, REIMER K A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J]. Circulation, 1986, 74(5): 1124-1136.

[2] PRZYKLENK K, BAUER B, OVIZE M, et al. Regional ischemic ‘preconditioning’ protects remote virgin myocardium from subsequent sustained coronary occlusion[J]. Circulation, 1993, 87(3): 893-899.

[3] TAKAOKA A, NAKAE I, MITSUNAMI K, et al. Renal ischemia/reperfusion remotely improves myocardial energy metabolism during myocardial ischemia via adenosine receptors in rabbits: effects of “remote preconditioning”[J]. J Am Coll Cardiol, 1999, 33(2): 556-564.

[4] GHO B C, SCHOEMAKER R G, VAN DEN DOEL M A, et al. Myocardial protection by brief ischemia in noncardiac tissue[J]. Circulation, 1996, 94(9): 2193-2200.

[5] OXMAN T, ARAD M, KLEIN R, et al. Limb ischemia preconditions the heart against reperfusion tachyarrhythmia[J]. Am J Physiol, 1997, 273(4 Pt 2): H1707-1712.

[6] BOLLI R. The late phase of preconditioning[J]. Circ Res, 2000, 87(11): 972-983.

[7] TRIALISTS G, HEALY D A, KHAN W A, et al. Remote preconditioning and major clinical complications following adult cardiovascular surgery: systematic review and meta-analysis[J]. Int J Cardiol, 2014, 176(1): 20-31.

[8] YANG Y, LANG X B, ZHANG P, et al. Remote ischemic preconditioning for prevention of acute kidney injury: a meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Am J Kidney Dis, 2014, 64(4): 574-583.

[9] TAPURIA N, KUMAR Y, HABIB M M, et al. Remote ischemic preconditioning: a novel protective method from ischemia reperfusion injury-a review[J]. J Surg Res, 2008, 150(2): 304-330.

[10] PALLER M S, HOIDAL J R, FERRIS T F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat[J]. J Clin Invest, 1984, 74(4): 1156-1164.

[11] YURDAKUL T, KULAKSIZOGLU H, PISKIN M M, et al. Combination antioxidant effect of alpha-tocoferol and erdosteine in ischemia-reperfusion injury in rat model[J]. Int Urol Nephrol, 2010, 42(3): 647-655.

[12] WU J Q, KOSTEN T R, ZHANG X Y. Free radicals, antioxidant defense systems, and schizophrenia[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2013, 46: 200-206.

[13] KWIECIEN S, JASNOS K, MAGIEROWSKI M, et al. Lipid peroxidation, reactive oxygen species and antioxidative factors in the pathogenesis of gastric mucosal lesions and mechanism of protection against oxidative stress - induced gastric injury[J]. J Physiol Pharmacol, 2014, 65(5): 613-622.

[14] BEN BAOUALI A, AUBE H, MAUPOIL V, et al. Plasma lipid peroxidation in critically ill patients: importance of mechanical ventilation[J]. Free Radic Biol Med, 1994, 16(2): 223-227.

[15] HAEGENS A, VERNOOY J H, HEERINGA P, et al. Myeloperoxidase modulates lung epithelial responses to pro-inflammatory agents[J]. Eur Respir J, 2008, 31(2): 252-260.

[16] DOW J, BHANDARI A, SIMKHOVICH B Z, et al. The effect of acute versus delayed remote ischemic preconditioning on reperfusion induced ventricular arrhythmias[J]. J Cardiovasc Electrophysiol, 2012, 23(12): 1374-1383.

[17] SHIAB F S. Preconditioning: from experimental findings to novel therapies in acute kidney injury[J]. Minerva Urol Nefrol, 2009, 61(3): 143-157.

[18] ONG S G, HAUSENLOY D J. Hypoxia-inducible factor as a therapeutic target for cardioprotection[J]. Pharmacol Ther, 2012, 136(1): 69-81.

(編輯何宏靈)

收稿日期：2015-09-23修回日期：2016-01-25

基金項目:上海市科委基金資助(No.14ZR1426900)

通訊作者:梁軍號，副主任醫(yī)師，碩士生導師.E-mail：ljh24103@gmail.com

作者簡介:董文培(1990-)，男(漢族)，碩士在讀.研究方向：泌尿系腫瘤的微創(chuàng)治療.E-mail：zjdwp-wz@163.com

中圖分類號:R691

文獻標志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.05.015

The protective effect of remote ischemic preconditioning on renal function after ischemia reperfusion injury

DONG Wen-pei1,2, LI Tao1,2, YU Ping1, LI Quan1,2, ZHANG Tie-long1,2, LIANG Jun-hao1,2

(1.Department of Urology, Xinhua Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200092;2.School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025,China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate whether remote ischemic preconditioning (RIPC) provides renal protection after ischemia reperfusion injury in animal model. Methods A total of 24 rats were equally divided into four groups: sham group, ischemia reperfusion group (IR group), acute RIPC group, and delayed RIPC group. Sham group received a sham operation; IR group had a right nephrectomy immediately following a 45 min ischemia by applying microvascular on left kidney; acute RIPC group accepted RIPC before surgery; delayed RIPC group received RIPC 24 h earlier. Cr, BUN, MPO, MDA, SOD and tubular score were measured 24 h after ischemia reperfusion. ResultsThe levels of Cr, BUN, MPO, MDA, SOD and tubular score were significantly increased in IR, acute RIPC and delayed RIPC groups. Compared with IR group, acute RIPC group and delayed RIPC group had better renal protection, and the delayed group achieved more (P<0.05). ConclusionRIPC can offer protection for kidney suffering IRI and the effect of delayed RIPC is more obvious, for RIPC may suppress the oxidative stress reaction and inhibit inflammatory cell infiltration.

KEY WORDS:remote ischemic preconditioning; ischemia reperfusion; renal function