邵麟惠，鄭興衛(wèi)，李聰

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

?

蒺藜苜蓿E3泛素連接酶U-box基因克隆及表達(dá)分析

邵麟惠，鄭興衛(wèi)，李聰*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

摘要：泛素化在植物生長和發(fā)育過程中起重要作用，E3泛素連接酶負(fù)責(zé)對(duì)靶蛋白特異性識(shí)別，其中U-box結(jié)構(gòu)的E3泛素連接酶具有調(diào)控植物生長發(fā)育和免疫反應(yīng)等功能，并在抗逆性方面發(fā)揮作用。目前，關(guān)于蒺藜苜蓿U-box家族基因的研究尚未見報(bào)道。本研究從蒺藜苜蓿中克隆得到U-box (MtPUB4)基因，該基因cDNA全長2448 bp，編碼815個(gè)氨基酸，包括1個(gè)U-box結(jié)構(gòu)(C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H)和5個(gè)ARM結(jié)構(gòu)域，屬于U-box/ARM類型E3泛素連接酶。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-MtPUB4，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)表明在大腸桿菌中表達(dá)了MtPUB4蛋白。熒光定量PCR分析表明MtPUB4基因在蒺藜苜?；ㄖ械谋磉_(dá)量最高，在根中表達(dá)量最低。MtPUB4基因受到NaCl、聚乙二醇、脫落酸誘導(dǎo)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，表達(dá)量呈現(xiàn)出增長趨勢。這些結(jié)果表明，MtPUB4基因在蒺藜苜蓿生長發(fā)育和抗逆性中可能起到重要調(diào)節(jié)作用，但在低溫脅迫中表達(dá)量稍微下降，變化不明顯。本研究成功構(gòu)建了pBI121-MtPUB4植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化擬南芥突變體Atpub4奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蒺藜苜蓿；E3泛素連接酶；U-box；基因克隆；表達(dá)分析

泛素化是真核生物細(xì)胞中重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的過程，對(duì)生物體生長發(fā)育和生物體對(duì)周圍環(huán)境適應(yīng)性起調(diào)控作用，其中泛素分子是由76個(gè)高度保守的氨基酸組成的多肽[1]。該過程首先是靶蛋白被泛素分子標(biāo)記，然后被蛋白酶體識(shí)別后降解[2]。標(biāo)記靶蛋白的過程由E1泛素活化酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶共同介導(dǎo)催化完成[1]。E1泛素活化酶依靠ATP提供能量催化泛素分子與底物蛋白結(jié)合，同時(shí)激活泛素分子轉(zhuǎn)移至E2泛素結(jié)合酶，最后通過E3泛素連接酶與賴氨酸殘基結(jié)合標(biāo)記靶蛋白[3-5]。E3泛素連接酶在靶蛋白特異性識(shí)別中起關(guān)鍵作用，依據(jù)共價(jià)鍵結(jié)合方式，可分為HECT (homologous to the E6-AP carboxyl terminus)結(jié)構(gòu)域和RING/U-box結(jié)構(gòu)域[6]。近年來研究表明，E3泛素連接酶參與了各種抗病信號(hào)反應(yīng)途徑的調(diào)控，其中U-box蛋白也在抗非生物脅迫和抗病過程中發(fā)揮作用[7-8]。

U-box/ARM蛋白是植物中特有的一類蛋白，由70多個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，功能域最初在酵母UFD2蛋白中發(fā)現(xiàn)，在多種真核生物中高度保守[9]。植物U-box蛋白的數(shù)量多于其他生物，目前在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已經(jīng)鑒定出64個(gè)U-box蛋白[10]，水稻(Oryzasativa)中鑒定出77個(gè)U-box蛋白[11]，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中鑒定出41個(gè)U-box蛋白[12]。研究表明,擬南芥pub4基因影響花粉絨氈層細(xì)胞生長發(fā)育，在花粉發(fā)育的第8～9期開始出現(xiàn)差異變化，其突變體在22 ℃時(shí)花粉絨氈層細(xì)胞過度生長膨脹或延遲退化、減小了花粉囊腔空間，使花粉粒被擠壓粘連、無法釋放傳粉而造成雄性不育，卻在16 ℃的低溫時(shí)可恢復(fù)部分育性，說明該基因表達(dá)方式對(duì)溫度敏感[3]。因此，推測利用此類基因特性可創(chuàng)制出溫敏型雄性不育材料。此外，近年研究人員發(fā)現(xiàn)，U-box類基因也參與植物非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)，擬南芥AtPUB22和AtPUB23響應(yīng)干旱脅迫[7]，AtPUB18和AtPUB19基因受NaCl誘導(dǎo)表達(dá)[13]，辣椒(Capsicumannuum)基因CaPUB1在擬南芥中超表達(dá)可以增強(qiáng)植物的耐鹽性[14]。

蒺藜苜蓿是豆科苜蓿屬草本[15]。二倍體(2n=2x=16)，具有生育期短(80～100 d)、基因組小(454～526 Mb)、自花授粉、易于轉(zhuǎn)化、再生時(shí)間較短等特點(diǎn),被作為豆科模式植物進(jìn)行研究，目前已完成全基因組測序[12]。紫花苜蓿(Medicagosativa)與蒺藜苜蓿同屬于苜蓿屬植物，具有相似的遺傳特點(diǎn)，從蒺藜苜蓿中獲得的信息對(duì)研究其他豆科植物特別是紫花苜蓿具有重要參考價(jià)值。目前，有關(guān)蒺藜苜蓿U-box基因家族的研究尚未見報(bào)道[12]。因此，本試驗(yàn)以蒺藜苜蓿為研究材料，利用植物U-box基因序列高度保守的特點(diǎn)，采用RT-PCR方法對(duì)蒺藜苜蓿U-box基因編碼區(qū)序列進(jìn)行克隆研究，以期為蒺藜苜蓿U-box基因在花粉發(fā)育過程中所起的調(diào)控作用和該類基因抗逆特性進(jìn)行初步探索，為今后通過基因工程手段選育新種質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試植物與試劑

選取蒺藜苜蓿A17基因型，蒺藜苜蓿種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

RNA提取使用TransZolUp Plus RNA Kit(ER501)試劑盒，cDNA反轉(zhuǎn)錄使用TransScriptII One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix(AH311)試劑盒，PCR擴(kuò)增使用TransStartFastPfuFly DNA Polymerase酶，實(shí)時(shí)熒光定量使用TransStartTop Green qPCR SuperMix試劑盒，購于北京全式金生物有限公司。DNA maker DL5000、限制性內(nèi)切酶BamHI、T4 DNA Ligase連接酶，購于Takara公司；克隆載體使用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(CU101)試劑盒、質(zhì)粒抽提使用EasyPurePlasmid MiniPrep Kit試劑盒，原核表達(dá)載體使用pEASY-Blunt Simple cloning Kit試劑盒，膠回收使用 Gel Extraction Kit試劑盒，分別購于北京全式金生物有限公司和北京康為世紀(jì)生物有限公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α購于天根生化科技(北京)有限公司；根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacteriumtumefaciens) AGL1由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18R-T vector載體購于Takara公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1材料處理將蒺藜苜蓿種子用酒精消毒后播種于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，在光照培養(yǎng)箱(溫度24 ℃，光照12 h/d)培養(yǎng)至種子發(fā)芽，將發(fā)芽種子用海綿條包裹種植移至盛有MS營養(yǎng)液的水培盤繼續(xù)培養(yǎng)。20 d左右對(duì)幼苗開始處理，脅迫處理時(shí)將水培溶液換成0.1 mol/L NaCl溶液、20%聚乙二醇(PEG)溶液和 1×10-4mol/L ABA溶液，低溫處理的水培溶液換成蒸餾水置于4 ℃冰箱，分別處理0，2，6，12，24 h，各時(shí)間點(diǎn)選取葉片組織置于2 mL離心管，液氮速凍后貯于-80 ℃，提取總RNA，用于 Real-time PCR分析。組織特異性分析選取正常栽培條件下結(jié)莢期蒺藜苜蓿根、莖、葉、花、莢果?；蚩寺∵x取開花期16 ℃放置48 h的蒺藜苜蓿葉片。

1.2.2RNA提取及反轉(zhuǎn)錄取蒺藜苜蓿葉片組織100 mg，按照北京全式金TransZol Plus RNA Kit(ER501)試劑盒說明步驟提取總RNA[16]。利用紫外分光光度計(jì)測定RNA含量，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，將質(zhì)量合格的RNA在-80 ℃條件保存?zhèn)溆?。cDNA第一鏈合成方法，反應(yīng)體系為：RNA 1 μL，5×TransScript All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL, gDNA Removal 1 μL, RNase-free Water 14 μL, 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積為20 μL，反應(yīng)條件為：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，冰浴5 min，-20 ℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3MtPUB4基因全長克隆及生物信息學(xué)分析從Genbank中下載MtPUB4基因(登錄號(hào)：XP_013460388.1)序列，用Primer Premier 5.0和oligo 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增引物F1/R1(表1)，以反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL，Template 1 μL，Primer 各1 μL，5×TransStart Buffer 10 μL，dNTPs 5 μL；DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 31 μL；反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測合格后膠回收。將膠回收純化PCR產(chǎn)物，用pMDR18-T載體4 ℃條件下連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min后，42 ℃熱激30 s，加入LB培養(yǎng)基于37 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)過夜后，置于含Amp+抗性的LB平板中進(jìn)行篩選，對(duì)所獲得的單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增、用BamHI單酶切鑒定，重復(fù)24次。對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測，選擇陽性菌液送北京英俊公司進(jìn)行DNA測序。測定序列用DNAstar軟件進(jìn)行拼接分析，得到正確的U-box基因核苷酸序列，并進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測。

利用NCBI網(wǎng)站(http://ncbi.nlm.nih.gov/)ORF Finder和Conservd Domains程序分析核酸和氨基酸序列；利用在Expasy網(wǎng)站查詢(http://www.expasy.org/tools/)預(yù)測蛋白功能；利用Genebank篩選下載其他植物的12種U-box蛋白同源序列，在MEGA 5.0軟件中選擇鄰近結(jié)合法(neighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹，分析MtPUB4編碼的氨基酸序列物種進(jìn)化關(guān)系[16]。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測MtPUB4基因表達(dá)量提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，方法同1.2.2。使用Bio-Rad CFX96 實(shí)時(shí)定量PCR儀，采用兩步法進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增?；蛱禺愋砸颋3/R3(表1)，內(nèi)參基因選擇蒺藜苜蓿ACTIN1，引物F2/R2(表1)。反應(yīng)條件：第一步 94 ℃預(yù)變性30 s；第二步 94 ℃ 30 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得Ct值，利用Livak等[17]報(bào)道的fold change=2-ΔΔCT法，計(jì)算蒺藜苜蓿MtPUB4基因在根、莖、葉、花、莢果中的表達(dá)量。把根的表達(dá)量設(shè)為對(duì)照，莖、葉、花、莢果設(shè)為4個(gè)處理；不同脅迫處理中，把0 h表達(dá)量設(shè)為對(duì)照，2，6，12，24 h設(shè)為4個(gè)處理，利用公式進(jìn)行計(jì)算：

ΔΔCT=(CT-gene-CT-actin)脅迫處理-(CT-gene-CT-actin)對(duì)照

式中，CT表示循環(huán)閾值，CT-gene表示目標(biāo)基因達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)，CT-actin表示Actin基因達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)，(CT-gene-CT-actin)脅迫處理表示處理樣品中目標(biāo)基因經(jīng)Actin基因校正的循環(huán)次數(shù)；(CT-gene-CT-actin)對(duì)照表示對(duì)照樣品中目標(biāo)基因經(jīng)Actin基因校正的循環(huán)次數(shù)；ΔΔCT表示處理樣品中目標(biāo)基因和對(duì)照樣品中目標(biāo)基因循環(huán)次數(shù)的差值。然后再計(jì)算出2-ΔΔCT的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)計(jì)算所得結(jié)果繪制柱形圖。

1.2.5蛋白原核表達(dá)與鑒定以蒺藜苜蓿cDNA為模板，利用引物F4/R4(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取PCR膠回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pEASY-Blunt Simple進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，接種SOC(super optimal broth)培養(yǎng)基培養(yǎng)，涂于LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL Amp+)37 ℃過夜培養(yǎng)。次日挑取單菌落，以引物F5/R5(表1)進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將合格菌液加入1 mL含Amp+抗生素的LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過夜，提取合格質(zhì)粒送公司測序。以構(gòu)建好的亞克隆載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，引物使用F6/R6(表1)，膠回收PCR產(chǎn)物，連接pEASY-Blunt E1載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，通過篩選陽性菌液、提取質(zhì)粒、送交測序，得到插入目的基因重組子pEASY-MtPUB4。

將陽性克隆菌液20 μL接種至2 mL LB(含50 μg/mL的Kan+和Amp+)培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。取30 μL過夜培養(yǎng)菌液，加入至3 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600約0.6；取部分液體作為未誘導(dǎo)對(duì)照組，余下的分別加入0.1，0.2，0.5，1.0 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)劑作為實(shí)驗(yàn)組，在37 ℃震蕩培養(yǎng)。在誘導(dǎo)5 h時(shí)取菌體1 mL，離心10000 r/min×30 s 收獲沉淀，用100 μL 1% 磷酸鹽緩沖液PBS (phosphate buffer saline) 重懸，混勻，100 ℃ 10 min。10000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6植物表達(dá)載體構(gòu)建以克隆測序后的質(zhì)粒為模板，使用TransStartKDPlus DNA Polymerase聚合酶，通過PCR擴(kuò)增目的片段，以酶切鑒定引物F7/R7(表1)，用內(nèi)切限制酶BamHI，對(duì)克隆載體pMD18-T::Mtpub4進(jìn)行單酶切。酶切體系共200 μL，質(zhì)粒120 μL，限制性內(nèi)切酶4 μL，10×CutSmart Buffer 20 μL，ddH2O補(bǔ)足至200 μL。提取單酶切表達(dá)載體質(zhì)粒，取純化目的基因PCR產(chǎn)物和pBI121載體，用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit (CU101)連接酶連接，將連接體系置于25 ℃連接2 h；連接體系共10 μL，其中載體3.75 μL，目的片段1.25 μL,2×Assembly Mix 5 μL。對(duì)于酶切后的表達(dá)載體質(zhì)粒，取純化目的產(chǎn)物，用T4 DNA Ligase連接酶與pBI121載體連接，將連接體系置于25 ℃連接2 h；連接體系10 μL，其中載體3.0 μL，目的片段4 μL,T4 DNA Ligase 1 μL,5×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL。將質(zhì)粒連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min后，42 ℃ 熱激30 s，加入400 μL LB于37 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，涂于含Kan+抗性的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)；次日挑取單克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定；取鑒定合格菌液，加2 mL至含Kan+抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min轉(zhuǎn)速搖菌過夜，使用EasyPurePlasmid Mini Prep Kit試劑盒提取質(zhì)粒；將質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，反應(yīng)條件為25 ℃ 1 h，37 ℃ 1 h。取鑒定合格菌液，送北京英駿公司測序。

表1　引物信息Table 1　Primers information

2結(jié)果與分析

2.1目的基因克隆

取蒺藜苜蓿葉片提取總RNA，凝膠電泳檢測顯示有28S、18S兩個(gè)條帶，說明RNA較完整。用紫外分光光度計(jì)檢測，A260/A280值為1.877；A260/A230值為2.054，

圖1　蒺藜苜蓿RNA提取和MtPUB4基因PCR擴(kuò)增Fig.1　RNA extraction and U-box E3 ubiquitin-ligating enzyme gene amplication in M. truncatula　　　A： RNA提取 RNA extraction；B： MtPUB4基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(1～3) Amplification products of MtPUB4 gene by RT-PCR(1-3); M: DNA marker.

說明RNA質(zhì)量較好(圖1A)。將提取RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；以cDNA第一鏈為模板，以基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段(圖1B)，利用DNAMAN拼接后的全長cDNA為2448 bp。將該基因命名為MtPUB4，NCBI登錄號(hào)為XP_013460388.1。2.2生物信息學(xué)分析

2.2.1保守結(jié)構(gòu)域運(yùn)用Expasy網(wǎng)站SMART程序?qū)tPUB4基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示MtPUB4蛋白215～278位氨基酸具有U-box/AEM家族所具備的典型U-box結(jié)構(gòu)，515～764位氨基酸具有典型的ARM重復(fù)結(jié)構(gòu)，該基因?qū)儆赨-box家族的一員，其編碼的U-box保守氨基酸序列為FCCPLSLELMTDPVIVASGQTYERAFIKNWIDLGLT VCPKTHQTLAHTNLIPNYTVKALIANW。運(yùn)用NCBI保守域在線分析，該蛋白氨基酸序列C端存在U-box結(jié)構(gòu)域，修飾RING鋅指結(jié)構(gòu)，沒有Zn2+結(jié)合配體，蛋白N端存在ARM重復(fù)結(jié)構(gòu)，最末端是谷氨酰胺，可能參與E3泛素化。與其他物種U-box蛋白序列多重比對(duì)結(jié)果表明，U-box/ARM結(jié)構(gòu)區(qū)域保守性較強(qiáng)，有127個(gè)氨基酸完全一致(圖2)。

2.2.2系統(tǒng)進(jìn)化將克隆序列提交NCBI網(wǎng)站BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，選取同源性較高不同物種序列下載，利用MEGA 5.0軟件鄰近法程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[12]。根據(jù)圖3顯示結(jié)果，克隆序列蒺藜苜蓿MtPUB4與鷹嘴豆(C.arietinum)(XP_0012571337.1)同源性最高，為89%；與野生大豆(G.soja)(KHN48396.1)和大豆(G.max)(XP_003551173.1)、菜豆(P.vulgaris)(XP_007146857.1)同源性次之，都是81%；與其他科屬植物可可(T.cacao)(XP_007047436.1)、木本棉(G.raimondii)(KJB48641.1)、黃瓜(C.sativus)(XP_004149702.1)、煙草(N.tabacum)(AAO61490.1)、甘藍(lán)(B.oleracea)(XP_013605017.1)、擬南芥(A.thaliana)(NP_179895.6)和水稻(O.sativa)(AAT94161.1)等植物同源性較低，分別是71%，69%，65%，58%，56%，56%和54%。

2.3蒺藜苜蓿MtPUB4基因組織特異性表達(dá)

蒺藜苜蓿MtPUB4基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量見圖4。結(jié)果表明，MtPUB4在花中表達(dá)量最多，其次是葉，根中表達(dá)量最少。以蒺藜苜蓿根中MtPUB4基因表達(dá)量為對(duì)照，花中表達(dá)量是根中表達(dá)量的26.68倍，葉中表達(dá)量是根中15.45倍，莢果中表達(dá)量是根中的5.60倍，莖中表達(dá)量是根中的4.82倍。

2.4蒺藜苜蓿MtPUB4基因在非生物脅迫下的表達(dá)量

蒺藜苜蓿MtPUB4基因分別受到NaCl、PEG、ABA和低溫誘導(dǎo)0，2，6，12，24 h的相對(duì)表達(dá)量見圖5。結(jié)果顯示，MtPUB4基因在NaCl脅迫誘導(dǎo)下，6 h時(shí)迅速上升，是2 h時(shí)表達(dá)量的3倍，12 h時(shí)達(dá)到峰值，24 h下降(圖5A)。在PEG脅迫誘導(dǎo)下2 h以內(nèi)變化較小，6 h表達(dá)量增到2 h的4倍，達(dá)到峰值，與NaCl脅迫下變化近似，但是12 h時(shí)開始下降，24 h時(shí)表達(dá)量低于0 h時(shí)表達(dá)量(圖5B)。在低溫處理后，2 h時(shí)表達(dá)量稍微有所下降，6 h時(shí)表達(dá)量與2 h表達(dá)量接近，12 h時(shí)持續(xù)下降，24 h時(shí)恢復(fù)至6 h水平(圖5C)。在ABA誘導(dǎo)12 h后，表達(dá)量稍有降低，隨后迅速上升，24 h時(shí)表達(dá)量接近0 h的5倍(圖5D)。除了低溫脅迫MtPUB4基因表達(dá)量變化稍有降低，表達(dá)量變化不明顯外，其余3種處理方式表達(dá)量都出現(xiàn)數(shù)倍上升，這說明MtPUB4基因?qū)}、干旱和ABA脅迫響應(yīng)，可能參與這些逆境的信號(hào)調(diào)控。

2.5MtPUB4基因蛋白原核表達(dá)

將目的片段連接pEASY-Blunt Simple載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)測序驗(yàn)證序列正確，表明蛋白表達(dá)載體構(gòu)建成功。將含有陽性質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)pLysS Chemically Competent Cell株系，用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，上樣濃度為0.1，0.2，0.5和1.0 mmol/L。結(jié)果顯示，含有MtPUB4片段的表達(dá)載體菌體在誘導(dǎo)后出現(xiàn)特異性條帶，各個(gè)濃度對(duì)蛋白表達(dá)影響不明顯。該蛋白在90 kDa條帶處，與預(yù)期結(jié)果88.36 kDa相符(圖6)。說明該蛋白在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)，可用于進(jìn)一步蛋白表達(dá)研究。

圖2　MtPUB4與其他植物U-box蛋白氨基酸保守區(qū)序列多重對(duì)比分析Fig.2　Multiple alignment analysis of MtPUB4 conserved domain with its homologous in other plants

續(xù)圖2　MtPUB4與其他植物U-box蛋白氨基酸保守區(qū)序列多重對(duì)比分析Continued Fig.2　Multiple alignment analysis of MtPUB4 conserved domain with its homologous in other plants　Cicer arietinum:鷹嘴豆；Glycine soja:野大豆；Glycine max:大豆；Phaseolus vulgaris:菜豆；Theobroma cacao:可可；Gossypium arboreum:木本棉；Cucumis sativus:黃瓜；Nicotiana tabacum:煙草；Brassica oleracea:甘藍(lán)；Arabidopsis thaliana:擬南芥；Oryza sativa:水稻。Consensus 表示序列一致性，黑色表示100%相同，粉色表示75%相同，藍(lán)色表示50%相同。Consensus indicates same sequences and are listed below；Black indicates 100% identity；Pink indicates 75% identity；Blue indicates 50% identity.

圖3　蒺藜苜蓿U-box E3泛素蛋白MtPUB4進(jìn)化樹分析Fig.3　Phylogenetic tree analysis of U-box E3 ubiquitin-ligating enzyme MtPUB4 proteins in M. truncatula

圖4　MtPUB4基因在蒺藜苜蓿不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4　The relative expression of MtPUB4 gene in different tissues of M. truncatula

2.6植物表達(dá)載體構(gòu)建

將植物表達(dá)載體pBI121和克隆載體分別酶切，回收相應(yīng)片段純化連接、轉(zhuǎn)化、挑取單菌落、提取質(zhì)粒，構(gòu)建MtPUB4基因植物表達(dá)載體。經(jīng)過BamHI酶切鑒定，得到與預(yù)期大小一致的目的片段(圖7)。鑒定為陽性的質(zhì)粒送公司測序后拼接，與基因序列一致，說明成功構(gòu)建植物表達(dá)pBI121-MtPUB4。

圖5　MtPUB4基因在NaCl、PEG、4 ℃低溫和ABA處理后的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5　The relative expression of MtPUB4 gene treated by NaCl, PEG, ABA and 4 ℃　A: NaCl 處理 NaCl treatment; B: PEG處理 PEG treatment ; C: 4 ℃ 低溫處理 4 ℃ treatment; D:脫落酸處理 ABA(abscisic acid) treatment

圖6　MtPUB4融合蛋白SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色Fig.6　Coomassie-stained SDS-PAGE gel illustrating MtPUB4 His-tag fusion protein expression in E. coli

圖7　植物表達(dá)載體PCR和酶切驗(yàn)證Fig.7　Identification of expression vector by enzyme digestion

1～5 ：0，0.1，0.2，0.5和1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白。 1-5 indicate 0，0.1，0.2，0.5 and 1.0 mmol/L IPTG induction bacterial protein；M：蛋白標(biāo)記 Protein marker.1～2：表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒提取結(jié)果。1-2: Results of vector pBI121 plasmid extraction; 3～4：質(zhì)粒單酶切后結(jié)果。3-4: Results of single enzyme digestion; M：DL5000 DNA marker.

3討論

U-box E3泛素連接酶基因在植物生長發(fā)育和抗逆過程中起著重要作用。目前E3 泛素連接酶U-box的研究主要集中在擬南芥、水稻、煙草等模式植物中。本研究得到的蒺藜苜蓿MtPUB4基因的氨基酸序列中(圖3)，在C端存在Ring super family U-box結(jié)構(gòu)域，有Zn指結(jié)構(gòu)40個(gè)殘基結(jié)合2個(gè)Zn原子，由半胱氨酸和組氨酸組成，可能參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互反應(yīng)，Hatakeyama等[8]認(rèn)為這類蛋白與序列復(fù)制、信號(hào)傳導(dǎo)和發(fā)育有關(guān)；在N端有連續(xù)5個(gè)ARM重復(fù)結(jié)構(gòu)，末端是谷氨酰胺，推測參與E3泛素化。有學(xué)者認(rèn)為ARM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)在植物生長發(fā)育和激素應(yīng)答等方面起重要作用[9,18]。在某些植物U-box蛋白中，如擬南芥中ARC1(Arm Repeat Containing 1)，其C端含有一個(gè)6～7個(gè)ARM重復(fù)結(jié)構(gòu)功能域，中間含有一個(gè)U-box功能域，是SRK激酶下游信號(hào)的傳遞因子，能在柱頭乳突細(xì)胞中特異性表達(dá)，能促進(jìn)花粉水合、萌發(fā)和花粉管生長的雌性親和因子[19]。在水稻中發(fā)現(xiàn)的SPL11[20-22]、煙草中的ACER276[23]、擬南芥中的AtPUB17等U-box基因都與植物抗病性有關(guān)[24]；馬鈴薯(Solanumtuberosum)中發(fā)現(xiàn)的U-box基因PHOR1(photoperiod-responsive1)參與GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的正調(diào)控因子[25]；煙草中的NtPUB4參與了植物發(fā)育和細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]；擬南芥AtPUB4的U-box/ARM功能域缺失能使絨氈層結(jié)構(gòu)肥大最終導(dǎo)致植物雄性不育[3]；蒺藜苜蓿中未見報(bào)道。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，它們與同科屬植物同源性很高，和其他科屬的植物同源性較低，這與其他學(xué)者在其他物種間同源性分析結(jié)論基本一致[16,27]，說明同源關(guān)系較近的植物中基因保守性更強(qiáng)。依據(jù)屬內(nèi)同源性較高的理論，說明U-box/ARM蛋白家族基因進(jìn)化上也比較保守，其氨基酸序列相似度可在一定程度上說明了不同物種親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，本研究中的蒺藜苜蓿MtPUB4基因與擬南芥AtPUB4基因、煙草NtPUB4的同源性較低，但是在同一類型進(jìn)化枝上，這可能與擬南芥與煙草基因組較小有關(guān)系。

前人研究表明U-box E3連接酶可調(diào)控植物多個(gè)生理代謝途徑，Samuel等[28]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的U-box/ARM蛋白家族與擬南芥SD1受體蛋白激酶亞家族相互結(jié)合，通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明，兩個(gè)受體結(jié)合可使U-box/ARM蛋白的ARM功能域磷酸化，從而參與調(diào)控植物生理過程。Kim等[26]研究認(rèn)為，煙草的NtPUB4參與CHRK1介導(dǎo)的植物發(fā)育及細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。據(jù)報(bào)道，CHRK1是煙草內(nèi)的一種新型類受體激酶，參與調(diào)控發(fā)育信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及內(nèi)源細(xì)胞分裂素平衡，且NtPUB4在煙草的花器官大量表達(dá)，在苗、根、莖、葉中少量表達(dá)。本研究中，蒺藜苜蓿Mtpub4基因也在花中大量表達(dá)，與NtPUB4、ARC1有相似的結(jié)構(gòu)域，因此推測它們具有相似的功能。而CHRK1與SRK類受體激酶聚類在一起，推測NtPUB4與ARC1功能相似[26]。Samuel等[28]在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，一些U-box/ARM基因受到NaCl脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，基因表達(dá)量會(huì)上調(diào)。以上結(jié)果表明U-box基因在抗性方面也可能發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)增加了干旱、低溫和ABA誘導(dǎo)方面的研究，通過模擬各種脅迫條件，MtPUB4基因在受到NaCl、PEG和ABA脅迫誘導(dǎo)后，基因表達(dá)量都數(shù)倍提高，此基因在NaCl、PEG和ABA脅迫反應(yīng)中也可能參與調(diào)控反應(yīng)，但在低溫脅迫中，表達(dá)量稍微下降，變化不明顯。

雄性不育與一些基因突變有關(guān)，產(chǎn)生這些基因突變的主要原因包括光周期、光強(qiáng)度、濕度和溫度等環(huán)境因素的改變。目前，利用這種現(xiàn)象人工篩選突變體，通過兩系配套法培育不育系已在雜交作物的生產(chǎn)上成功應(yīng)用[29]。在擬南芥中，突變體Atpub4在16 ℃中可恢復(fù)部分育性，主要是花粉囊中的花粉粒可成功授粉。目前尚無蒺藜苜蓿U-box E3泛素連接酶蛋白的相關(guān)研究[30]，我們通過全基因組U-box結(jié)構(gòu)域分析得出，蒺藜苜蓿MtPUB32可能與ARK2共同調(diào)控植株側(cè)根發(fā)育，MtPUB26可能與干旱脅迫相關(guān)[12]。通過對(duì)克隆蒺藜苜蓿MtPUB4序列分析，得出它與擬南芥AtPUB4蛋白間有共同保守域結(jié)構(gòu)，利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件分析基因序列特征、功能蛋白結(jié)構(gòu)、基因進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)克隆基因?qū)儆谥参颱-box家族成員，具備1個(gè)U-box結(jié)構(gòu)域和5個(gè)ARM重復(fù)結(jié)構(gòu)。本研究為進(jìn)一步了解U-box基因如何調(diào)控蒺藜苜蓿的生長發(fā)育，以及如何參與逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，揭示植物生長發(fā)育過程中的一些機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR技術(shù)，克隆了蒺藜苜蓿U-box E3泛素連接酶基因，對(duì)其核苷酸、氨基酸序列對(duì)比分析，檢測相對(duì)表達(dá)量變化規(guī)律，進(jìn)行原核表達(dá)并提取了MtPUB4蛋白，同時(shí)成功構(gòu)建植物表達(dá)載體。為后期篩選蒺藜苜蓿雄性不育基因、將其轉(zhuǎn)化至擬南芥Atpub4雄性不育突變體材料進(jìn)行遺傳互補(bǔ)提供了候選基因。

References：

[1]Zeng L R, Park C H, Venu R C,etal. Classification, expression pattern, and E3 ligase activity assay of rice U-box-containing proteins. Molecular Plant, 2008, 1(5): 800-815.

[2]Chen J W, Zheng L N, Wang B Z,etal. The nonproteolytic functions mediated by ubiquitylation. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2012, 7: 613-621.

[3]Wang H, Lu Y, Jiang T,etal. TheArabidopsisU-box/ARM repeat E3 ligase AtPUB4 influences growth and degeneration of tapetal cells, and its mutation leads to conditional male sterility. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology, 2013, 74(3): 511-523.

[4]Gonzalez-Lamothe R, Tsitsigiannis D I, Ludwig A A,etal. The U-box protein CMPG1 is required for efficient activation of defense mechanisms triggered by multiple resistance genes in tobacco and tomato. Plant Cell, 2006, 18(4): 1067-1083.

[5]Yang J X, Zhang H, Wang Z L,etal. Recent progresses in the regulation mechanism of E3 ligases in plant disease resistance. Plant Protection, 2015, 4: 1-8, 28.

[6]Mudgil Y, Shiu S H, Stone S L,etal. A large complement of the predictedArabidopsisARM repeat proteins are members of the U-box E3 ubiquitin ligase family. Plant Physiology, 2004, 134(1): 59-66.

[7]Cho S K, Ryu M Y, Song C,etal.ArabidopsisPUB22 and PUB23 are homologous U-Box E3 ubiquitin ligases that play combinatory roles in response to drought stress. Plant Cell, 2008, 20(7): 1899-1914.

[8]Hatakeyama S, Yada M, Matsumoto M,etal. U-box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. The Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(35): 33111-33120.

[9]Hur Y J, Yi Y B, Lee J H,etal. Molecular cloning and characterization of OsUPS, a U-box containing E3 ligase gene that respond to phosphate starvation in rice (Oryzasativa). Molecular Biology Reports, 2012, 39(5): 5883-5888.

[10]Lu Y Q, Guan N, Li C. Advance in the study on U-box proteins ofArabidopsisthaliana. Molecular Plant Breeding, 2008, 6: 941-948.

[11]Chen H, Li L Y, Bai H,etal. Expression analysis of Rice U-Box proteins at different developmental stages. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2009, 36(9): 1208-1214.

[12]Zheng X W, Shao L H, Li C. Genome-wide screening and characterization of the U-box gene family inMedicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 130-141.

[13]Bergler J, Hoth S. Plant U-box armadillo repeat proteins AtPUB18 and AtPUB19 are involved in salt inhibition of germination inArabidopsis. Plant Biology, 2011, 13(5): 725-730.

[14]Cho S K, Chung H S, Ryu M Y,etal. Heterologous expression and molecular and cellular characterization of CaPUB1 encoding a hot pepper U-Box E3 ubiquitin ligase homolog. Plant Physiology, 2006, 142(4): 1664-1682.

[15]Wei Z W, Gai J Y. Model legume:Medicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2008, 17(1): 114-120.

[16]Zou X, Zhang Y, Wu M Y,etal. Cloning and analysis of the cytosolic glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPC) gene fromSolanumtuberosumandArabidopsisthaliana. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(1): 239-247.

[17]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[18]Mazzucotelli E, Belloni S, Marone D,etal. The E3 ubiquitin ligase gene family in plants: regulation by degradation. Current Genomics, 2006, 7(8): 509-522.

[19]Nasrallah J B, Nasrallah M E. Robust self-incompatibility in the absence of a functional ARC1 gene inArabidopsisthaliana. The Plant Cell, 2014, 26(10): 3838-3841.

[20]Liu J, Park C H, He F,etal. The RhoGAP SPIN6 associates with SPL11 and OsRac1 and negatively regulates programmed cell death and innate immunity in rice. PLoS Pathogens, 2015, 11(2): e1004629.

[21]Vega-Sanchez M E, Zeng L, Chen S,etal. SPIN1, a K homology domain protein negatively regulated and ubiquitinated by the E3 ubiquitin ligase SPL11, is involved in flowering time control in rice. The Plant Cell, 2008, 20(6): 1456-1469.

[22]Liu J, Li W, Ning Y,etal. The U-box E3 ligase SPL11/PUB13 is a convergence point of defense and flowering signaling in plants. Plant Physiology, 2012, 160(1): 28-37.

[23]Yang C W, GonzAilez-Lamothe, Rocio,etal. The E3 ubiquitin ligase activity ofArabidopsisPLANT U-BOX17 and its functional tobacco homolog ACRE276 are required for cell death and defense. The Plant Cell, 2006, 18(4): 1084-1098.

[24]He Q, McLellan H, Boevink P C,etal. U-box E3 ubiquitin ligase PUB17 acts in the nucleus to promote specific immune pathways triggered byPhytophthorainfestans. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(11): 3189-3199.

[25]Amador V, Monte E, Garcia-Martinez J L,etal. Gibberellins signal nuclear import of PHOR1, a photoperiod-responsive protein with homology toDrosophilaarmadillo. Cell, 2001, 106(3): 343-354.

[26]Kim M, Cho H S, Kim D M,etal. CHRK1, a chitinase-related receptor-like kinase, interacts with NtPUB4, an armadillo repeat protein, in tobacco. Biochimica et Biophysica Acta, 2003, 1651(1-2): 50-59.

[27]Niu J P, Zhang J W, Wang W T,etal. Cloning and sequence analysis of terminase gene of glycoalkaloid biosynthesis metabolismic pathway in potato. Acta Prataculturae Sinica, 2012, 21(3): 106-116.

[28]Samuel M A, Mudgil Y, Salt J N,etal. Interactions between the S-domain receptor kinases and AtPUB-ARM E3 ubiquitin ligases suggest a conserved signaling pathway inArabidopsis. Plant Physiology, 2008, 147(4): 2084-2095.

[29]Zhou H, Liu Q, Li J,etal. Photoperiod- and thermo-sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA. Cell Research, 2012, 22(4): 649-660.

[30]Wiborg J, O’Shea C, Skriver K. Biochemical function of typical and variantArabidopsisthalianaU-box E3 ubiquitin-protein ligases. Biochemistry Journal, 2008, 413(3): 447-457.

參考文獻(xiàn)：

[2]陳季武, 鄭麗娜, 王幫正, 等. 泛素化介導(dǎo)的非蛋白質(zhì)降解功能. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2012, (7): 613-621.

[5]楊玖霞, 張浩, 王志龍, 等. E3泛素連接酶調(diào)控植物抗病分子機(jī)理研究進(jìn)展. 植物保護(hù), 2015, 4: 1-8, 28.

[10]魯玉清, 關(guān)寧, 李聰. 擬南芥U-box蛋白的研究進(jìn)展. 分子植物育種, 2008, 6: 941-948.

[12]鄭興偉, 邵麟惠, 李聰. 蒺藜苜蓿全基因組中U-box基因家族的篩選與特征分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(8): 130-141.

[15]魏臻武, 蓋鈞鎰. 豆科模式植物-蒺藜苜蓿. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 17(1): 114-120.

[16]鄒雪, 張燁, 吳明陽, 等. 馬鈴薯和擬南芥GAPC酶基因的克隆及分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(1): 239-247.

[27]牛繼平, 張金文, 王旺田, 等. 馬鈴薯SGAs合成代謝途徑末端SGT酶基因克隆及序列分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21(3): 106-116.

DOI：10.11686/cyxb2016073

*收稿日期：2016-03-02；改回日期：2016-04-01

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31372362)項(xiàng)目和“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD17B01)資助。

作者簡介：邵麟惠(1981-)，女，甘肅合水人，在讀博士。E-mail:shaolinhui@126.com *通信作者Corresponding author. E-mail:licong0520@sina.com

* 1Cloning and expression analysis of a U-box gene of E3 ubiquitin ligase fromMedicagotruncatula

SHAO Lin-Hui, ZHENG Xing-Wei, LI Cong*

InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China

Abstract:The E3 ubiquitin ligase is essential for the specific recognition of target proteins of ubiquitin, and therefore, it plays an important role in plant growth and development. The U-box family of E3 ubiquitin ligases function in regulating plant immune responses and stress resistance. To the best of our knowledge, there have been no reports on U-box family genes in Medicago truncatula. In this study, a U-box gene (MtPUB4), consisting of a 2448-bp cDNA encoding a putative protein of 815 amino acids, was cloned from M. truncatula. A sequence alignment analysis revealed that the MtPUB4 protein contains a U-box domain (C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H) and two ARM (Armadillo) regions. Therefore, it was classified as a U-box/ARM E3 ubiquitin-ligase. We constructed a prokaryotic expression vector (pET-MtPUB4), and an SDS-PAGE analysis confirmed that the MtPUB4 protein was successfully expressed in prokaryotic cells. Real-time polymerase chain reaction analyses showed that the transcript levels of MtPUB4 were higher in flowers and lower in roots. Abiotic stresses such as NaCl, polyethylene glycol, and abscisic acid resulted in increased transcript levels of MtPUB4, with higher transcript levels after longer induction times. The transcript levels of MtPUB4 decreased slightly under low-temperature stress. These results indicated that MtPUB4 may be involved in regulating growth, development, and stress resistance in M. truncatula. The construction of the pBI121-MtPUB4 vector has laid the foundation for transformation of Arabidopsis in future studies.

Key words:Medicago truncatula; E3 ubiquitin-ligase enzyme; U-box; gene cloning; expressing analysis

http://cyxb.lzu.edu.cn

邵麟惠， 鄭興衛(wèi)， 李聰. 蒺藜苜蓿E3泛素連接酶U-box基因克隆及表達(dá)分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(7): 62-72.

SHAO Lin-Hui, ZHENG Xing-Wei, LI Cong. Cloning and expression analysis of a U-box gene of E3 ubiquitin ligase fromMedicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(7): 62-72.