唐太峰, 伍國(guó)鋒

(1.貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 貴州 貴陽(yáng)　550081； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 神經(jīng)內(nèi)科, 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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低頻電刺激對(duì)耐藥癲癇大鼠海馬細(xì)胞外液谷氨酸及γ-氨基丁酸的影響*

唐太峰1, 伍國(guó)鋒2

(1.貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 貴州 貴陽(yáng)550081； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 神經(jīng)內(nèi)科, 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 觀(guān)察低頻電刺激(LFS)海馬對(duì)杏仁核電點(diǎn)燃耐藥癲癇模型大鼠腦內(nèi)谷氨酸(Glu)及γ-氨基丁酸(GABA)的影響。方法： 選取60只雄性健康SD大鼠制作杏仁核點(diǎn)燃模型，采用苯妥英鈉(PHT)和苯巴比妥(PB)對(duì)杏仁核點(diǎn)燃癲癇鼠進(jìn)行耐藥篩選，對(duì)明確耐藥大鼠給予海馬LFS治療，收集電刺激海馬治療前后腦組織微透析液，采用高效液相色譜法(HPLC)觀(guān)察治療前后Glu及GABA含量。結(jié)果： 篩選出的耐藥癲癇模型大鼠7只，海馬刺激前GABA濃度為(29.114 0±7.236 2)mg/L，刺激后為(37.130 0±7.622 5)mg/L，刺激前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Glu刺激前濃度為(2 527.742 0±514.831 1)mg/L，刺激后為(2 243.906 0±329.277 8)mg/L，有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，GABA/Glu刺激前為0.011 63±0.002 34，刺激后為0.016 50±0.002 36，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 耐藥癲癇大鼠海馬LFS可增加刺激部位腦組織透析液中GABA水平，提高GABA/Glu比值，這可能是LFS抑制癲癇發(fā)作的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]癲癇; 耐藥； 電刺激療法； 海馬； 谷氨酸； γ-氨基丁酸； 微透析； 色譜法，高壓液相

1987年Velasco等[1]首次報(bào)道用雙側(cè)丘腦中央中核電刺激治療人類(lèi)耐藥癲癇控制發(fā)作后，多項(xiàng)相關(guān)研究在世界各地相繼展開(kāi)。目前認(rèn)為電刺激治療時(shí)的刺激部位通常選擇在癲癇觸發(fā)點(diǎn)或癇性放電神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角色的結(jié)構(gòu)，如丘腦底核、尾狀核、丘腦前核、丘腦正中核、黑質(zhì)、海馬、小腦等。腦深部電刺激(DBS)治療被證實(shí)是治療各類(lèi)成人和青少年癲癇發(fā)作的有效方法[2]，但尚不清楚其確切機(jī)制。本研究利用杏仁核電刺激點(diǎn)燃大鼠模型，予抗癲癇藥物篩選建立耐藥癲癇模型，通過(guò)低頻電刺激(LFS)海馬，觀(guān)察耐藥癲癇模型大鼠腦內(nèi)的γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)的變化，探討LFS海馬控制耐藥大鼠癲癇發(fā)作的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1動(dòng)物及設(shè)備

200～250 g的雄性SD大鼠60只單籠標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。 主要儀器：BL-420E生物技能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，江灣Ⅱ型腦立體定位儀，微量恒速灌流泵(美國(guó)Bioanalytical systems.Inc)，微透析套管(美國(guó)Bioanalytical systems.Inc)，微透析探針(美國(guó)Bioanalytical systems.Inc)，0.22 μm無(wú)菌濾膜(美國(guó)Millipore公司)，AGILENT 1100高效液相色譜儀(美國(guó)AGILENT公司)。人工腦脊液(138mmol/L NaCl,11 mmol/L Na2HCO3,5 mmol/L KCl,1 mmol/L CaCl2,1 mmol/L MgCl2,1mmol/L NaH2PO4,使用雙蒸餾水配制，其中CaCl2單獨(dú)溶解)實(shí)驗(yàn)時(shí)與其他溶液混合，并通入95%O2和5%CO2混合氣體，待pH 7.4時(shí)停止通氣，0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，4 ℃冰箱保存,2周內(nèi)用于微透析實(shí)驗(yàn)。

1.2癲癇動(dòng)物模型制作

予4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后，固定于腦立體定位儀，暴露顱骨及前囟，按Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠左側(cè)杏仁基底外側(cè)核(前囟后2.0 mm，矢狀縫旁開(kāi)5.0 mm，深度8.5 mm)，選擇右側(cè)杏仁基底外側(cè)核的顱骨表面投影點(diǎn)鉆孔，植入雙極螺旋鎳鉻電極并固定于顱骨表面。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉(10萬(wàn)U/d)預(yù)防感染，一周后開(kāi)始電刺激點(diǎn)燃，每日1次(細(xì)電流，串刺激，波寬1 ms，頻率60 Hz，持續(xù)時(shí)間1 s，電流強(qiáng)度0.450 mA)。發(fā)作強(qiáng)度按Racine法分級(jí)[3]，連續(xù)3次4～5級(jí)以上發(fā)作則記為完全點(diǎn)燃。點(diǎn)燃24 h記錄后放電閾值(ADT,ADT為引起腦電圖出現(xiàn)后發(fā)放時(shí)的最小電流強(qiáng)度;起始電流強(qiáng)度為0.02 mA,此后按每次疊加20%刺激，每5 min記錄1次，直至測(cè)出ADT)。

1.3藥物篩選耐藥癲癇模型

ADT 測(cè)定完畢24 h,癲癇模型大鼠予生理鹽水(與篩選藥物同體積)腹腔注射，1 h后測(cè)ADT。24 h后腹腔注射苯妥英鈉(PHT，75 mg/kg)，1 h后測(cè)ADT(起始電流強(qiáng)度為生理鹽水組ADT值的20%，此后按每次疊加20%刺激，每5 min 1次)。將注射PHT與注射生理鹽水后所測(cè)得ADT進(jìn)行對(duì)比，若波動(dòng)范圍在±20%內(nèi)，則一周后再進(jìn)行PHT篩選一次，3次均通過(guò)的大鼠，考慮對(duì)PHT耐藥；并于一周以后進(jìn)行苯巴比妥(PB，25 mg/kg)篩選，方法同前。所有PHT及PB篩選均通過(guò)的大鼠即為耐藥癲癇大鼠模型，納入微透析實(shí)驗(yàn)。

1.4檢測(cè)海馬腦組織液GABA和Glu

1.4.1電極及微透析套管的植入4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀，拔除原有左側(cè)杏仁核刺激電極，創(chuàng)面止血消毒，清潔顱骨表面，按Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜，選擇右側(cè)海馬，坐標(biāo)為前囟后4.8 mm，矢狀縫旁開(kāi)5.0 mm，深度4.0 mm。鉆開(kāi)顱骨，將連接有刺激電極的微透析套管沿坐標(biāo)點(diǎn)緩慢植入(保證電極與微透析套管平行并緊貼于微透析套管，雙極電極末端超出引導(dǎo)管末端1.5 mm)，植入深度為4.0 mm，牙托粉和502膠水固定。術(shù)后大鼠置于較大的籠中，單籠飼養(yǎng)，防止大鼠將套管及電極撞脫。連續(xù)3日注射青霉素預(yù)防感染，單籠靜養(yǎng)24 h后用于微透析實(shí)驗(yàn)。

1.4.2海馬電刺激前微透析液的收集植入電極24 h后移去微透析套管針芯，植入微透析探針，輸入端接微量恒速灌流泵，輸出端用EP管收集微透析液。用人工微透析液以2 μL/min速率持續(xù)灌注2 h平衡，大鼠清醒后，開(kāi)始收集，每管15 min，連續(xù)收集2管并立即置-20 ℃冰箱保存，并在透析結(jié)束后轉(zhuǎn)存-80 ℃冰箱，擇日測(cè)定。每只實(shí)驗(yàn)大鼠實(shí)驗(yàn)前均取2管作為基礎(chǔ)值。

1.4.3海馬電刺激后微透析液的收集 按該參數(shù)予海馬低頻電刺激治療：頻率1 Hz、持續(xù)15 min、波寬0.1 ms、電流強(qiáng)度100 mA，連續(xù)單刺激，延時(shí)0.05 ms，每日一次(09∶00～11∶00時(shí))，連續(xù)14 d。第14日刺激結(jié)束24 h后，按照1.4.2項(xiàng)下方法再次收集微透析液。

1.4.4檢測(cè)海馬組織液中的Glu、GABA含量檢測(cè)系統(tǒng)為Waters 2475 Multi Fluorescence Detector，Nova-pak C18(150 mm×3.9 mm，粒徑5 μm)反相色譜柱，利用單泵恒流洗脫，設(shè)定柱溫30 ℃，流速0.9 mL/min，熒光檢測(cè)器設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為Ex330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為Em420 nm。取微透析樣品中的某一成分峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品中相應(yīng)峰的保留時(shí)間相一致者作為其Glu、GABA峰。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1造模結(jié)果

60只大鼠，7只術(shù)后死亡，余下53只給予電點(diǎn)燃刺激。成功點(diǎn)燃24只，平均發(fā)作天數(shù)15 d。24只點(diǎn)燃大鼠，其中7只通過(guò)PHT及PB篩選，視為耐藥癲癇大鼠模型，耐藥率29.17%。

2.2海馬微透析液中Glu和GABA量

予海馬LFS治療14 d之后，各鼠GABA濃度較電刺激治療前升高，而GABA/Glu比值升高趨勢(shì)更為顯著，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Glu濃度較電刺激治療前降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

3討論

對(duì)于耐藥癲癇患者，外科手術(shù)切除病灶可作為藥物治療之外的另一個(gè)選擇，但部分患者癲癇灶無(wú)法定位，或病灶位于語(yǔ)言、感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)區(qū)等不宜手術(shù)部位，因此只有部分患者可外科手術(shù)控制發(fā)作[4]。對(duì)于藥物控制不佳又不適宜手術(shù)的癲癇患者來(lái)說(shuō)，神經(jīng)電刺激或可成為較好的治療手段，其中DBS這種新的治療手段，由于其療效讓人鼓舞，已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注，但其機(jī)制尚不明確。本研究使用兩種不同作用機(jī)制的抗癲癇藥物(AEDs)對(duì)癲癇模型進(jìn)行耐藥篩選，建立耐藥癲癇模型，探索DBS治療機(jī)制。

表1　耐藥癲癇大鼠海馬LFS前后Glu、GABA及

DBS治療耐藥癲癇根據(jù)刺激參數(shù)的不同，可分為低頻率電刺激(LFS，≤10 Hz)和高頻率電刺激(HFS，>60 Hz)兩種類(lèi)型，均有抗癲癇作用，具體機(jī)制尚不明確，但隨著電刺激強(qiáng)度的增大，不良反應(yīng)也隨之增加[5]。本研究選擇LFS作為治療手段。對(duì)于刺激靶點(diǎn)的選擇，目前尚存爭(zhēng)議，針對(duì)不同的癲癇類(lèi)型，刺激靶點(diǎn)選擇可能亦有所不同。在耐藥癲癇患者中，大部分為顳葉癲癇，而海馬與顳葉癲癇密切相關(guān)[6]，故本研究將刺激靶點(diǎn)定于海馬，且已有人將其運(yùn)用于臨床[7],但未闡明其機(jī)制。目前對(duì)于目前DBS治療癲癇可能的機(jī)制尚不明確，但與Papez環(huán)路、 皮質(zhì)-丘腦網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)[6],而Glu和GABA作為重要的興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)代表，成為研究的熱點(diǎn)。因?yàn)榕d奮性遞質(zhì)增加和抑制性遞質(zhì)減少均可改變神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮-抑制平衡，這是癇性電活動(dòng)的分子學(xué)基礎(chǔ)。因而以Glu/ GABA來(lái)研究癲癇的發(fā)生或許比單純測(cè)定Glu或GABA的絕對(duì)濃度更有意義。但目前尚沒(méi)有合適的藥物對(duì)兩者的平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)，而采用DBS進(jìn)行神經(jīng)調(diào)節(jié)的方式則有可能達(dá)到此目的。

在本實(shí)驗(yàn)中，GABA濃度和GABA/Glu比值治療后均升高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以GABA/Glu比值升高趨勢(shì)最為顯著，Glu濃度有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，推測(cè)可能與樣本量較小有關(guān)，又或者因Glu升高并非LFS治療的主要機(jī)制，提示相對(duì)于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu的變化，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA可能在電刺激海馬抗癲癇的機(jī)制中扮演著更為重要的角色，故由此可推測(cè)LFS海馬可選擇性調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而使GABA濃度相對(duì)升高更為明顯，致使GABA、Glu之間的平衡發(fā)生變化，抑制性作用增強(qiáng)，從而抑制腦電的異常發(fā)放達(dá)到控制癲癇發(fā)作的治療效果。而癲癇發(fā)作時(shí)已證實(shí)尚伴有其他神經(jīng)遞質(zhì)的改變，如去甲腎上腺素、5-HT、多巴胺、乙酰膽堿等，是否電刺激也會(huì)引起這些神經(jīng)遞質(zhì)的相應(yīng)變化，尚需進(jìn)一步研究。

LFS海馬可增加刺激局部的GABA水平，調(diào)節(jié)GABA/Glu比值，使之升高，可能是LFS控制癲癇發(fā)作的作用機(jī)制之一。

4參考文獻(xiàn)

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(2016-02-07收稿，2016-05-21修回)

中文編輯： 潘婭； 英文編輯： 劉華

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81241129/H0913)； 長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(TRT13058)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R742.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)07-0793-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.012

Influence of Low Frequency Electrical Stimulation on Glutamate and Gama-Aminobutyric Acid in Hippocampal Extracellular Fuid of Rats with Drug Resistant Epilepsy

TANG Taifeng1, WU Guofeng2

(1.DepartmentofNeurology,theSecondPeople'sHospitalofGuiyangCity,Guiyang550081,Guizhou,China; 2.DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the influence of low frequency electrical stimulation (LFS) of hippocampus on glutamate(Glu) and Gama-Aminobutyric Acid (GABA) in brain tissues of amygdala kindling epilepsy rat model. Methods: 60 healthy male SD rats were selected to make the amygdala kindling epilepsy model. Amygdala kindling rats were screened by Pheytoin sodium and Phenobarbital for their drug resistance. The rats with clear drug resistance received LFS treatment. Hippocampal brain microdialysate liquid was collected before and after LFS treatment and HPLC was adopted to detect Glu and GABA content. Results: 7 amygdale kindling rats with drug resistance were obtained through screening. Among the 7 selected rats with drug resistance, GABA concentration was (29.114±7.236 2) mg/L before LFS compared with (37.13±7.622 5) mg/L after LFS, and the differences were statistically significant (P<0.05). Glu concentration was (2 527.742 0±514.831 1) mg/L before LFS compared with (2 243.906 0±329.277 8) mg/L after LFS, with Glu concentration showing a reducing trend but no significant differences(P>0.05). However, the ratio of GABA/Glu was 0.011 63±0.002 34 before LFS compared with 0.016 50±0.002 36 after LFS, and the differences were statistically significant(P<0.05). Conclusions: LFS on hippocampus can increase the level of GABA and ratio of GABA to Glu, which may be one of mechanisms to suppress the epileptic seizure.

[Key words]epilepsy; drug resistance; electric stimulation therapy; hippocampus; glutamate; gama-aminobutyric acid; microdialysis; chromatography; HLPC，high pressure liquid

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-07-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.024.html