庹媛媛， 尚魯俊, 夏海雄, 何志旭，4**， 舒莉萍,,4**

(1.貴州醫(yī)科大學 兒科教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學 免疫學教研室， 貴州 貴陽　550004； 3.貴州醫(yī)科大學 實驗動物中心， 貴州 貴陽　550004； 4.貴州醫(yī)科大學 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州 貴陽　550004)

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band3基因在斑馬魚早期胚胎中的表達*

庹媛媛1， 尚魯俊2, 夏海雄3, 何志旭1，4**， 舒莉萍2,3,4**

(1.貴州醫(yī)科大學 兒科教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學 免疫學教研室， 貴州 貴陽550004； 3.貴州醫(yī)科大學 實驗動物中心， 貴州 貴陽550004； 4.貴州醫(yī)科大學 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 用band3基因的反義mRNA探針進行斑馬魚全胚胎原位雜交，檢測band3基因在野生型Tüebingen斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達。方法： Trizol法提取斑馬魚胚胎總RNA并設計特異性引物，采用RT-PCR法擴增band3基因cDNA編碼區(qū)片段；通過基因重組技術構建PBSK-band3重組質粒，用BamHⅠ酶切得到線性化PBSK-band3；以T7 RNA聚合酶轉錄合成反義地高辛標記的band3 RNA探針，用全胚胎原位雜交法檢測band3基因在斑馬魚胚胎早期的表達情況。結果： 成功克隆band3基因片段，構建PBSK-band3重組質粒；經體外轉錄獲得地高辛標記的反義band3 mRNA探針，原位雜交后檢測證實band3基因在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中間細胞群(ICM)和主動脈性腺中腎區(qū)(AGM)呈現(xiàn)高表達。結論： 地高辛標記的反義band3 mRNA探針可檢測到斑馬魚胚胎中band3基因的定位表達。

[關鍵詞]斑馬魚； 胚胎； band3； 全胚胎原位雜交； 探針

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物野生型Tüebingen斑馬魚品系由上海生命科學院健康研究所劉廷析研究員饋贈，本實驗室繁殖培育。養(yǎng)殖條件：(28±2)℃，帶有過濾系統(tǒng)的循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖，12 h/d光照,予以草履蟲及蝦卵飼養(yǎng)[7]。

1.1.2主要實驗試劑大腸桿菌Elico如DH5α由本課題組保存，PBSK質粒載體由上海生命科學院健康研究所劉廷析饋贈，Trizol試劑、逆轉錄試劑First.strand plus購自Invitrogen公司，高保真KOD-Plus PCR酶購自TOYOBO公司，限制性內切酶EcoR I和BamH I、T4 DNA連接酶以及DNA Marker均購自Fermentas公司，質粒小抽試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，地高辛RNA標記和檢測試劑盒以及NucAwaylM Spin Columns購自Ambion公司，BCIP/NBT購自VECTORLab。測序由北京諾賽公司進行。

1.1.3引物根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫提供的斑馬魚band3基因全長。用Primer Premier 5.0軟件設計特異性擴增編碼區(qū)片段的PCR引物。 PCR引物由京諾賽生物科技有限公司合成。上游引物P1為 5′-CGCGGATCCATTAAACGCCGCTACAAGCATTACC-3′，下游引物P2為5′ -CCGGAATTCGACGATCAGCCACATGCCCAC-3′；上游引物在起始密碼ATG前下游引物在終止密碼TAA前分別加入EcoRI和BamHI酶切位點。

1.2方法

1.2.1斑馬魚胚胎總RNA提取取斑馬魚胚胎,選取受精后0、18、24、36、48、72、96和120 h(hour post fertilization,hpf)的斑馬魚胚胎，各20枚，加入0.15 mL TRlzol試劑，充分勻漿。將斑馬魚8個時相胚胎的TRlzol勻漿室溫放置5 min，4 ℃,12 000 r/min離心10 min后將勻漿并成1管，室溫放置5 min,然后每毫升TRIzol試劑加入0.2 mL氯仿。劇烈振蕩15 s，室溫放置2 min。4 ℃,12 000 r/min離心15 min。轉移上層水相至新的離心管中。加入0.5 mL的預冷的異丙醇，室溫放置15 min沉淀RNA。4 ℃,12 000 r/min離心10 min。棄上清。加入1 mL 75%的乙醇。充分洗滌沉淀，4 ℃,12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入1 mL預冷的75% DEPC無水乙醇，4 ℃,750 g/min離心5 min,棄上清。加入1 mL預冷的75% DEPC 無水乙醇，4 ℃,750 g/min離心5 min,棄上清。4 ℃,750 g/min離心5 min。棄多余的上清液。置空氣中干燥(5～10 min)，沉淀溶于DEPC水中。

1.2.2擴增band3片段參考Thermo試劑盒說明，將總RNA逆轉錄生成cDNA,以此cDNA第一鏈作為模板.進行PCR擴增。PCR反應程序：95 ℃ 8 min(95 ℃ 40 s、56.4 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s)，35個循環(huán)，68 ℃ 延伸10 min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,按北京天根生化科技有限公司的割膠回收試劑盒說明書操作回收300 bp左右的目的條帶。

1.2.3band3表達載體構建及鑒定將割膠回收的band3 PCR產物和PBSK載體分別用EcoRI和BamHI酶酶切。通過T4連接酶將band3和PBSK載體連接重組，并送往北京賽諾公司進行測序鑒定。將測序正確的PBSK-band3重組質粒轉化入DH5α宿主菌。經單克篩選后挑取單克隆，并提取質粒用EcoRI、BamH I進行雙酶切鑒定。見圖1。

圖1　構建PBSK-band3重組質粒示意圖Fig.1　Schematic diagram of PBSK-band3 recombinant plasmid

1.2.4地高辛標記的band3基因反義mRNA的制備將經測序和酶切鑒定正確的PBSK-band3重組質粒經BamHI酶酶切線性化之后，通過T7反義逆轉錄聚合酶制備反義band3基因反義mRNA 探針。用NucAwaylM Spin Columns純化吸附柱回收Band3反義mRNA探針，經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5斑馬魚全胚胎原位雜交(whole mount in situ hybridization，WISH)收集Tuebingen野生型斑馬魚受精后0.75、3.75、6、9、12、18 、24、30、36、48和72 hpf共11個不同時相的胚胎，用3%多聚甲醛固定。用l×PBST溶液洗去多聚甲醛，用甲醇進行梯度脫水后，將胚胎置于68 ℃雜交爐中進行預雜交1 h，加人制備好的地高辛標記的band3反義mRNA探針，于68 ℃雜交爐中過夜，用不同濃度的SSCT將多余的探針洗去，加入地高辛抗體后過夜，用MABT將多余的抗體洗掉，加入BCIP/NBT染液對雜交胚胎進行染色，體視顯微鏡下觀察并記錄，用固定液對雜交胚胎進行再固定并且照相。

2結果

2.1band3基因擴增

可見到一特異性擴增帶，位于200～500 bp，大小與預期的342 bp相符，見圖2。

注： 1為DNA Maker，2為band3 PCR產物，3為空白對照圖2　band3基因擴增Fig.2　hoxd3 gene amplification

2.2PBSK-band3重組質粒酶切鑒定與測序

用EcoR I和Xba I雙酶切得到的band3基因片段約 300 bp，與RT-PCR產物大小一致；另外，得到的另1個DNA片段約3 000 bp，與PBSK質粒大小一致。 PBSK-band3重組質粒測序與band3基因完全一致。見圖3、圖4。

2.3地高辛標記的band3 反義mRNA探針的制備

將經BamH I單酶切的PBSK-band3重組質粒經地高辛標記后經T7逆轉錄成功制備反義mRNA探針，見圖5。

2.4斑馬魚全胚胎原位雜交結果

Tuebingen野生型斑馬魚18～24 hpf胚胎的中中間細胞區(qū)(ICM,藍色箭頭所示)，30～48 hpf主動脈性腺中腎區(qū)(AGM,紅色箭頭所示)有藍黑色陽性雜交信號band3 基因的表達。見圖6。

3討論

本實驗利用斑馬魚這種模式生物研究band3基因，斑馬魚具有體積小，繁殖迅速，胚胎透明，可以實現(xiàn)目的基因的可失蹤觀察等生物學特點，是作為研究血液疾病研究的理想模式生物[8]。

WISH可以整體水平反映特定基因在胚胎發(fā)育過程中的時空表達情況，是研究胚胎發(fā)育過程中調控基因表達的常用技術。該技術成熟，地高辛所標記的探針具有較高靈敏度[9-10]，本實驗通過設計斑馬魚band3基因片段的引物，提取斑馬魚胚胎總RNA，成功通過RT-PCR擴增出band3基因片段，將擴增的band3基因片段通過T4 DNA連接酶與載體PBSK質粒進行定向重組，得到PBSK-band3重組質粒，經過雙酶切以及序列測定確定PBSK-band3重組質粒構建成功，并在此基礎上以PBSK-band3重組質粒為模板進行T7體外轉錄，得到了片段為200 bp～500 bp的地高辛標記的band3反義mRNA探針，并進行斑馬魚全胚胎原位雜交技術觀察band3反義mRNA探針在Tuebingen野生型斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中的時空表達情況。

band3基因表達的蛋白是紅細胞膜上主要的蛋白，由3個亞基組成。是紅細胞膜陰離子通道蛋白，也是Ser/Thr激酶的主要底物。本研究發(fā)現(xiàn)，band3基因在腎臟α-閏細胞和在心肌細胞中有所表達，說明band3基因與紅系造血有關，其作用可能是助于紅細胞提高二氧化碳的運輸和維持形狀。在某些導致紅細胞破壞的疾病中，如地中海貧血、遺傳性球形紅細胞增多癥、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥等[11-12]。Band3蛋白發(fā)生磷酸化的結構變化，破壞整個紅細胞膜的蛋白結構，影響紅細胞的脆性和變形能力，從而發(fā)生一系列病理反應。今后可以進一步研究band3的表達對紅細胞膜結構的影響。

圖3　PBSK-band3重組質粒測序Fig.3　PBSK-band3 recombinant plasmid sequencing

圖4　PBSK-band3質粒的雙酶切結果Fig.4　Results of double enzyme digestion of PBSK-band3 plasmid

注：1、2為反義band3 mRNA圖5　地高辛標記的反義band3 mRNAFig.5　Digoxigenin-labeled antisense band3 mRNA

注：藍色箭頭所示ICM，紅色箭頭所示AGM圖6　band3基因在野生型Tuebingen斑馬魚全胚胎中的表達Fig.6　Expression of band3 gene in wild-type Tüebingen zebrafish embryo

4參考文獻

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(2016-05-03收稿，2016-06-26修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

*[基金項目]國家自然科學基金(31260284； 31360285)； 貴州省科技基礎條件平臺項目[(2009)4005]； 貴州省優(yōu)秀科技省長專項基金(S2008-4)

[中圖分類號]R321-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)07-0760-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.004

Expression Pattern ofBand3 during Zebrafish Early Development

TUO Yuanyuan1, SHANG Lujun2, XIA Haixiong2, HE Zhixu1,3, SHU Liping2,3,4

(1.DepartmentofPediatrics,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.DepartmentofImmunology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.LaboratoryAnimalCenter,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.TissueEngineeringandStemCellResearchCenter,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: The antisense mRNA probe of band3 gene was adopted to conduct Zebrafish whole embryos mount in situ hybridization to detect the expression of band3 gene in wild-type Tüebingen zebrafish embryonic development. Method: Zebrafish embryo total RNA was extracted by Trizol, specific primers was designed and the cDNA coding region fragment band3 was amplified by RT-PCR. The recombinant PBSK/band3 plasmids was constructed by recombination technique and linearized with BamH I enzyme digestion. T7 RNA polymerase was adopted to synthesize antisense band3 RNA probes labeled by digoxigenin. Zebrafish whole embryos mount in situ hybridization was adopted to detect band3 gene expression in early zebrafish embryos. Results: The band3 gene fragments were cloned and PBSK/band3 recombinant plasmid was constructed successfully. The digoxigenin-labeled antisense band3 probe was obtained in vitro transcription. After mount in situ hybridization, it was observed that band3 gene was highly expressed in the middle cell population (ICM) and the renal region (AGM) of the aorta gonad in the early embryonic development of zebrafish. Conclusion: In this study, we prepare the antisense mRNA band3 probe labeled with digoxigenin and detect the expression of band3 gene in zebrafish embryos.

[Key words]zebrafish; embryo; band3; whole embryo mount in situ hybridization; probe

**通信作者 E-mail:gyslp-456@163.com; hzx@gmc.edu.cn

網(wǎng)絡出版時間：2016-07-17網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.052.html