臧金鳳，趙丕文，趙俊云，陶仕英，孫麗萍，牛建昭

北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京 100029

丹參酮ⅡA抗宮頸癌鱗癌細胞增殖效應及其雌激素受體亞型介導機制的研究

臧金鳳，趙丕文，趙俊云，陶仕英，孫麗萍，牛建昭

北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京 100029

目的觀察丹參酮ⅡA對宮頸癌鱗癌Siha細胞增殖的影響，探討其作用機制。方法不同濃度丹參酮ⅡA作用人宮頸癌鱗癌Siha細胞，MTT法和流式細胞術測定Siha細胞增殖速率和增殖周期分布，Western blot測定Siha細胞磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶（p-ERK）、細胞周期蛋白（Cyclin）D表達。結果1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7mol/L丹參酮ⅡA顯著抑制宮頸癌鱗癌Siha細胞增殖，該抑制作用可被雌激素受體（ER）α拮抗劑MPP增強、可被ERβ拮抗劑PHTPP減弱；1×10-5、5×10-6、1×10-6mol/L丹參酮ⅡA干預后Siha細胞增殖指數(shù)顯著下降；1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7mol/L丹參酮ⅡA干預后Siha細胞p-ERK、Cyclin D蛋白表達水平顯著降低。結論丹參酮ⅡA抑制宮頸癌鱗癌Siha細胞增殖是通過靶細胞ER途徑實現(xiàn)的，并通過降低p-ERK、Cyclin D表達量發(fā)揮抗增殖作用。

丹參酮ⅡA；宮頸癌鱗癌Siha細胞；雌激素受體；細胞增殖；細胞周期；磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶；細胞周期蛋白D

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，具有活血調經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩、養(yǎng)血安神等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有保護心血管、增強機體免疫功能、抗菌、抗炎、抗氧化等作用［1-2］；特別是在多個靶器官均具有抗腫瘤功效［3-4］。丹參酮ⅡA是從丹參中提取的重要脂溶性活性成分，是丹參發(fā)揮抗腫瘤作用的主要藥效成分［5］。本實驗前期研究表明，丹參酮ⅡA具有抗乳腺癌T47D細胞增殖的作用［6］，且經(jīng)經(jīng)典核雌激素受體（ER）α和β介導。近年來，宮頸癌的發(fā)生率在婦科腫瘤中明顯上升［7］，丹參酮ⅡA是否具有抗宮頸癌的作用？該作用是否經(jīng)ER介導？2種ER亞型在介導過程中的作用是否有差異？為了驗證上述假設，本研究選取人宮頸癌鱗癌Siha細胞，探討丹參酮ⅡA對其增殖過程的影響及其ER亞型介導途徑。

1 實驗材料

1.1 藥物和細胞株

丹參酮ⅡA，中國食品藥品檢定研究院，純度98%。人宮頸癌鱗癌Siha細胞，北京協(xié)和醫(yī)學院細胞中心。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM（高糖）、無酚紅DMEM（高糖）、胎牛血清、活性炭-葡聚糖處理胎牛血清，Hyclone公司；雌二醇（E2）、MTT、DMSO、RNase、碘化丙啶、甲醇，Sigma公司；β-肌動蛋白抗體，中杉金橋公司；磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶（p-ERK）、細胞周期蛋白（Cyclin）D抗體，Santa Cruz公司；ERα、ERβ特異性拮抗劑 MPP、PHTPP，Tocris公司；甘氨酸、Tween20，Am resco公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、濃縮膠緩沖液、分離膠緩沖液、蛋白相對分子質量 Marker、ECL超敏發(fā)光液，普利萊基因有限公司；二抗 Anti-Rabbit IgG/HRP 和 Anti-Goat IgG/HRP，北京康為世紀生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱（Binder），酶聯(lián)免疫檢測儀（Epson LX-800），倒置顯微鏡（Olympus），凝膠成像分析儀（Pharmacia），流式細胞儀（BD）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

人宮頸癌鱗癌Siha細胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的 DMEM 高糖溶液中，培養(yǎng)條件為 37 ℃、5%CO2及相對飽和濕度。實驗開始前4 d PBS洗滌細胞2次后，改為在無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）中培養(yǎng)，以耗盡細胞內儲存的雌激素。

2.2 MTT法測定細胞增殖速率

Siha細胞傳代 3次，經(jīng)無酚紅 DMEM（含5%CDT-FBS）培養(yǎng)4 d后，選取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌 2次，加無血清DMEM，以細胞密度3×l03個/孔接種于96孔板，每孔培養(yǎng)液總體積為200 μL。培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，換為含1×l0-8mol/L E2和1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7mol/L丹參酮ⅡA的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，拮抗組同時加入1×l0-8mol/L MPP或PHTPP，

每種受試物均設7個復孔。48 h后加MTT（5 mg/mL、 15 μL/孔），繼續(xù)孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL。以DMSO調零，于酶標儀570 nm處測定各孔吸光度（A）值，取其平均值，計算細胞增殖速率（實驗組A值÷對照組A值）。

2.3 細胞周期測定

取經(jīng)無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）培養(yǎng)4 d的Siha細胞，以5×105個/瓶密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，以無血清DMEM接種24 h待細胞貼壁后，換為含1×l0-8mol/L E2和1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7mol/L丹參酮ⅡA DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后終止，獲得細胞用70%冷乙醇4 ℃固定過夜，RNase處理，碘化丙啶染色，2 h內流式細胞儀檢測細胞周期分布，計算細胞增殖指數(shù)［（S+G2/M）÷（G0/G1+S+G2/M）×100%］。

2.4 Western blot檢測細胞磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶、細胞周期蛋白D蛋白表達

細胞預處理過程同“2.3”項。藥物作用48 h后，收集細胞，加入細胞裂解液，12 000×g離心5 min，將上清液進行蛋白含量測定后用于分析。蛋白變性后上樣，SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V，分離膠120 V），半干電轉膜儀轉膜（80 V，75 min）。5%脫脂奶粉37 ℃振搖1 h將膜封閉；分別加p-ERK、Cyclin D、β-肌動蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。HRP標記的二抗37 ℃振搖1 h后，將PVDF膜置ECL混合液中室溫下振蕩孵育5 min，X膠片曝光，顯影、定影、掃描后，以β-actin表達量為對照觀察結果。

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1 丹參酮ⅡA對Siha細胞增殖的影響

MTT法檢測顯示，48 h 時1×l0-8mol/L E2可使Siha細胞增殖速率明顯增加（P＜0.01），加入MPP或PHTPP后其促增殖作用均受到抑制。而1×10-5、5× 10-6、1×10-6、5×10-7mol/L丹參酮ⅡA對Siha細胞增殖均具有抑制作用；加入MPP可增強其增殖抑制作用，而加入PHTPP拮抗其增殖抑制作用，見表1。

4.2 丹參酮ⅡA對Siha細胞增殖指數(shù)的影響

48h時，1×10-8mol/L E2使Siha細胞增殖指數(shù)升高（P＜0.01），1×10-5、5×10-6、1×10-6mol/L丹參酮ⅡA使 Siha細胞增殖指數(shù)降低（P＜0.05，P＜0.01），與E2作用趨勢相反，主要表現(xiàn)在S期細胞比例降低，而G0/G1期細胞比例增加，見表2、圖1。

表1 各組448 h Siha細胞增殖速率比較（±s）

表1 各組448 h Siha細胞增殖速率比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與同組無拮抗劑比較，△P＜00.05，△△P＜0.001

組別n 劑量 無拮抗劑MPP拮抗劑PHTPP對照組7 E2組丹參酮ⅡA組7 7777 0.2% 1×10-1×10-5×10-1×10-5×10-8mol/L5mol/L6mol/L6mol/L7mol/L 0.879±0.017 0.912±0.00 0.139±0.00 0.239±0.03 0.375±0.02 0.592±0.06 6**7**0**2**8**0.861±0.035 0.873±0.010△△0.119±0.004△0.156±0.008△△0.200±0.001△△0.468±0.084△△0.8867±0.017 0.8 0.1 0.2 0.3 0.6 92±0.013△△62±0.003△67±0.001△85±0.041 10±0.059

表2 各組48 hh Siha細胞增殖指數(shù)比較（±s，%%）

表2 各組48 hh Siha細胞增殖指數(shù)比較（±s，%%）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別n 劑量G0/G1S GG2/M增殖指數(shù)對照組40.2%722.47±7.1025.01±4.072.522±1.0827.53±2.20 E2組丹參酮ⅡA組4 4444 1×10-8m1×10-5m5×10-6m1×10-6m5×10-7mol/L 61 ol/L 78 ol/L 76 ol/L 73 ol/L 72 .63±6.20**.05±2.00**.08±3.32**.73±2.63 .12±3.65 30.24±2.02*16.35±2.02*18.07±5.05*20.01±8.38*23.21±6.13* 8.13* 5.60* 5.85* 6.26 4.67 ±1.54 ±0.48 ±0.20 ±1.07 ±0.31 38.37±4.15**21.95±3.07**23.92±4.09**26.27±6.91*27.88±7.17

圖1 各組Siha 細胞增殖周期流式細胞圖

4.3 丹參酮ⅡA對Siha細胞磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶、細胞周期蛋白D蛋白表達的影響

Western blot檢測顯示，藥物作用448 h后，1×100-5、5×10-6、1×100-6、5×10-7mmol/L丹參酮ⅡA可使SSiha細胞 p-ERK和 Cyclin DD表達水平顯著降低（P＜0.001），且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，見圖2。

圖2 各組Siha細胞p-EERK和Cyclin D蛋白表達

5 討論

據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內宮頸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌，在女性惡性腫瘤中居第2位，占所有女性惡性腫瘤患者的13%，且近年來宮頸癌的發(fā)病人群呈現(xiàn)出年輕化趨勢［7］。據(jù)報道，宮頸鱗狀上皮癌變是篩查后宮頸活檢中最常見的病變［8］，占宮頸癌的 95%［9］。本研究針對宮頸癌鱗癌Siha細胞，探討丹參酮ⅡA對該細胞增殖活性的影響及其可能的分子途徑與機制，以期為婦科腫瘤的臨床治療提供依據(jù)。

本實驗結果顯示，丹參酮ⅡA具有明顯的抑制Siha細胞增殖作用，并使細胞增殖指數(shù)顯著降低。值得注意的是，在 Siha細胞增殖實驗體系中加入 ERα特異性拮抗劑后，丹參酮ⅡA抑制Siha細胞增殖作用明顯增強；而加入ERβ特異性拮抗劑后，丹參酮ⅡA抗Siha細胞增殖作用顯著減弱。這一方面說明在Siha細胞中，作用于ER是丹參酮ⅡA發(fā)揮增殖抑制作用的重要靶點和途徑；另一方面也進一步表明，ERα和ERβ在介導丹參酮ⅡA影響細胞增殖效應中所起的作用不同，丹參酮ⅡA抑制Siha細胞增殖的效應主要機制是經(jīng)ERβ介導，拮抗ERβ后其抑癌作用明顯減弱；而經(jīng)ERα介導的效應則相反，故加入ERα拮抗劑后其抑癌作用可進一步增強。另有研究顯示，ERα與ERβ在介導轉錄活性方面的作用有所不同，ERβ在抑制基因轉錄活性方面的作用比ERα更強［10-11］。本研究細胞增殖實驗中 ERβ被拮抗后丹參酮ⅡA的抑癌作用有所減弱的結果與此一致。

影響癌細胞增殖調控通路是抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的主要途徑。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是與細胞增生和凋亡調節(jié)過程密切相關的關鍵信號轉導途徑之一。作為MAPK家族成員，ERK活化后在細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡及惡性轉化等過程中均可發(fā)揮作用。當來自細胞內外的各種絲裂原刺激激活ERK使其磷酸化為p-ERK后，即可活化由該因子介導的增殖相關信號轉導通路，并進一步影響細胞增殖、凋亡與侵襲行為［12-13］。萬氏等［14］研究表明，ERK/MAPK信號轉導通路的異常激活與乳腺癌的浸潤性生長有關，表皮生長因子即可通過異常激活ERK/MAPK信號轉導通路刺激乳腺癌細胞浸潤性生長。Tzu-Ping等［15］也發(fā)現(xiàn)，p-ERK隨著正常宮頸組織向宮頸癌的進展，表達逐漸增強，表明ERK信號轉導通路在正常宮頸組織向宮頸內瘤變的演變過程中起重要作用。齊氏等［16］采用免疫組化SP法觀察114例宮頸鱗癌組織和 50例正常宮頸組織石蠟標本中p-ERK蛋白表達情況時發(fā)現(xiàn)，該蛋白在子宮頸鱗癌中陽性表達率（84.2%）顯著高于正常宮頸組織（16.0%）。本實驗結果表明，丹參酮ⅡA可降低p-ERK表達，從而抑制 p-ERK介導的細胞增殖信號傳導通路，下調細胞增殖速率。該結論與章氏等［17］提出的 p-ERK在宮頸癌中過量表達的特征是宮頸癌演進過程重要特征的觀點相一致。

同時，細胞周期中G1期到S期是其中的關鍵調控點。Cyclin D作為G1期細胞周期素［18］，可促進細胞G1-S期時相的轉換［19］，現(xiàn)已被公認為是原癌基因。Cyclin D基因激活并持續(xù)高表達，可使G1期縮短，使細胞提前進入S期，從而加速細胞增殖，最終形成腫瘤［20］。宋氏等［21］通過免疫組化 SP法觀察比較Cyclin D在正常宮頸組織和宮頸鱗狀細胞癌（CSCC）中表達情況時發(fā)現(xiàn)，Cyclin D高表達與CSCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移等過程均有密切關系。陳氏［22］也發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中 Cyclin D的表達顯著高于正常宮頸組織，且其表達與宮頸癌的分化程度及淋巴結轉移有關。本研究結果顯示，Cyclin D蛋白表達量與對照組比較明顯降低，提示丹參酮ⅡA可通過降低周期相關蛋白表達、下調Siha細胞增殖指數(shù)發(fā)揮抗癌作用。

總之，丹參酮ⅡA能明顯抑制宮頸癌Siha細胞增殖，其作用機制與經(jīng)典 ER途徑有關，并通過抑制p-ERK、Cyclin D表達水平的升高發(fā)揮細胞增殖阻滯作用。該結果為全面揭示丹參酮ⅡA通過ER途徑發(fā)揮抗婦科腫瘤活性的藥理機制補充了直接的實驗依據(jù)，也為婦科腫瘤、特別是宮頸癌鱗癌的臨床治療提供了參考。

［1］ WANG X， WEI Y， Yuan S， et al. Potential anticancer activity of tanshinoneⅡA against human breast cancer［J］. Int J Cancer，2005，116（5）：799-807.

［2］ WANG A M， SHA S H， LESNIAK W， et al. Tanshinone （Salviae mi l tior rhizae extract） preparations at tenuate aminoglycoside induced f ree radical formation in vit ro and ototoxicity in vivo［J］. Antimicrob Agents Chemother，2003，47（6）：1836-1841.

［3］ 李光強，李濟洋，張玉杰，等.丹參酮抗腫瘤研究新進展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（8）：1160-1165.

［4］ 孫兆卿，王壽福.丹參酮ⅡA抗腫瘤作用研究進展［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2010，31（7）：70-72.

［5］ 孟爽，陸曉媛.丹參酮ⅡA對HeLa宮頸癌細胞凋亡的影響［J］.齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2011，32（2）：175-177.

［6］ 趙丕文，牛建昭，王繼峰，等.丹參酮ⅡA抗乳腺癌細胞增殖作用研究［J］.中國藥理學通報，2010，26（7）：903-906.

［7］ 李霓，鄭榮壽，張思維，等.2003～2007年中國宮頸癌發(fā)病與死亡分析［J］.中國腫瘤，2012，21（11）：801-804.

［8］ 沈丹華.解讀第4版WHO（2014）女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類中宮頸癌前期病變的命名及分級變化［J］.診斷病理學雜志，2015，22（3）：129-132.

［9］ 賈美群，陳曾燕，李海波.雌激素和孕激素對人宮頸癌細胞體外生長影響的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2009，16（6）：431-433，442.

［10］ 李江濤，王麗巖.中藥聯(lián)合白藜蘆醇制劑在宮頸癌術后放療中的應用［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（3）：75-76.

［11］ AN J， RIBEIRO R C， WEBB P， et al. Est radiol repression of tumor necrosis factor-alpha transcription requires estrogen receptor activation function-2 and is enhanced by coactivators［J］. Proc Nat l Acad Sci USA，1999，96：15161.

［12］ 李剛，姚珍薇.ERK1/2信號轉導通路在宮頸癌發(fā)病中的作用［J］.山東醫(yī)藥，2007，47（24）：118-119.

［13］ KRUEGER J S， KESHAMOUNI V G， ATANASKOVA N， et al. Temporal and quantitative regulation of mitogen-activated protein kinase（MAPK） modulatescel l moti lity and invasion［J］. Oncogene，2001，20（31）：4209-4218.

［14］ 萬芳，鐘剛，何福仙，等.ERK/MAPK信號通路激活與乳腺癌細胞浸潤性生長的關系［J］.醫(yī)學研究生學報，2004，17（6）：490-492.

［15］ TZU-PING C， CHIEN-MING C， HSUEH-WEN C， et al. Increased expression of SKV2 and phospho-MAPK/ERK1/2 and decreased expression of p27 during tumor progression of cervical neoplasms［J］. Gynecol Oncol，2007，104（3）：516-523.

［16］ 齊潔敏，馬衛(wèi)軍，白連宏.宮頸鱗癌PTEN和p-ERK的表達及其臨床意義［J］.中國婦幼保健，2007，22（9）：1213-1214．

［17］ 章麗霞，劉鈞，黃一凡，等.ERK2和p-ERK1/2蛋白在宮頸癌中的表達和意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2012，20（2）：353-356.

［18］ LUKASZEWICZ A I， ANDERSON D J. Cyclin D1 promotes neurogenesis in the developing spinal cord in a cel l cycle-independent manner［J］. Proc Nat l Acad Sci USA，2011，108（28）：11632-11637.

［19］ LAINEH， SULG M， KIRJAVAINEN A， et al. Cel l cycle regulation in the inner ear sensory epithelia：role of cyclin D1 and cycl in dependent kinase inhibitors［J］. Dev Biol，2010，337（1）：134-146.

［20］ PESTELL R G. New roles of cycl in D1［J］. Am J Pathol，2013，183（1）：3-9.

［21］ 宋明芮，成慧，張曉云，等.宮頸鱗狀細胞癌中DLC-1和cyclin D1的表達及其臨床意義［J］.診斷病理學雜志，2014，21（10）：633-636.

［22］ 陳曉燕.DLC-1和cycl in D1在宮頸鱗狀細胞癌中的表達及意義［J］.中外醫(yī)療，2015，34（22）：14-16.

Anti-proliferative Effect of TanshinoneA on Cervical Squamous Cancer Cells and Its Estrogen Receptor Subtype Mediated Mechanism

ZANG Jin-feng， ZHAO Pi-wen， ZHAO Jun-yun，TAO Shi-ying， SUN Li-ping， NIU Jian-zhao
（School of Preclinical Medicine， Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029， China）

ObjectiveTo study the effects of tanshinone ⅡA on proliferation of cervical squamous cancer Siha cells； To discuss its possible molecular mechanism.MethodsCervical squamous cancer Siha cells were treated with different doses of tanshinone ⅡA. The effects of tanshinone ⅡA on proliferation of Siha cells were measured by MTT assay and flow cytometry analysis. The effects of tanshinone ⅡA on expression levels of phospho-extracellular regulate kinase （p-ERK） and Cyclin D in Siha cells were measured by Western blot.Results1×10-5， 5×10-6， 1×10-6，5×10-7mol/L tanshinone ⅡA significantly inhibited Siha cell proliferation and such effect could be enhanced by ERα antagonist MPP and attenuated by ERβ antagonist PHTPP. 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6tanshinone ⅡA could significantly decrease the proliferation index of Siha cells. 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6， 5×10-7mol/L tanshinone ⅡA could significantly reduce the protein expression levels of p-ERK and Cyclin D of Siha cells.ConclusionTanshinone ⅡA can inhibit cervical squamous cancer Siha cell proliferation and such effect is realized via estrogen receptor pathway. TanshinoneⅡA plays anti-proliferation roles by reducing the expression levels of p-ERK and Cyclin D.

Tanshinone ⅡA； cervical squamous cancer Siha cell； estrogen receptor； cell proliferation； cell cycle； phospho-extracellular regulate kinase； Cyclin D

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.014

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0051-05

2015-11-01）

（

2015-11-19；編輯：華強）

國家自然科學基金（81273887）；高等學校創(chuàng)新引智計劃（B07007）；北京中醫(yī)藥大學自主選題項目（JYBZZ-JS014）

趙丕文，E-mai l：pwzhao@263.net