林蘭，王秋虹，易泳鑫

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053

·實(shí)驗(yàn)研究·

siRNA沉默細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2基因協(xié)同甲亢寧膠囊對(duì)大鼠甲狀腺細(xì)胞-5細(xì)胞增殖的影響

林蘭，王秋虹，易泳鑫

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053

目的通過(guò)甲亢寧膠囊（以下簡(jiǎn)稱“甲亢寧”）協(xié)同siRNA干擾大鼠甲狀腺細(xì)胞-5（fisher rat thyroid cell line-5，F(xiàn)RTL-5）中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2基因，觀察并探討甲亢寧對(duì)FRTL-5細(xì)胞RNA干擾ERK1/2基因表達(dá)及對(duì)FRTL-5細(xì)胞增殖的影響。方法將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的FRTL-5細(xì)胞分為空白組、陰性對(duì)照組、甲亢寧組、siRNA組、甲亢寧協(xié)同組。利用siRNA沉默及甲亢寧協(xié)同干擾FRTL-5細(xì)胞的ERK1/2基因，RT-PCR檢測(cè)ERK1/2 mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組和陰性對(duì)照組ERK1/2的mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與空白組比較，siRNA組和甲亢寧組FRTL-5細(xì)胞ERK1/2 mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01）；與空白組、陰性對(duì)照組比較，甲亢寧協(xié)同組ERK1/2 mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01）；Western blott檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組、陰性對(duì)照組比較，甲亢寧組、siRNA組、甲亢寧協(xié)同組p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)相對(duì)量明顯下降（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染24、48 h后，CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，甲亢寧組、siRNA組、甲亢寧協(xié)同組細(xì)胞增殖受抑制，與空白組、陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論甲亢寧對(duì)ERK1/2磷酸化起阻斷作用，ERK1/2基因被沉默后，對(duì)甲狀腺細(xì)胞增殖有抑制作用，甲亢寧可協(xié)同ERK1/2-siRNA抑制FRTL-5細(xì)胞增殖。

甲狀腺細(xì)胞；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2；甲亢寧膠囊；RNA干擾；增殖

Graves病（Graves disease，GD）是當(dāng)前常見(jiàn)的甲狀腺疾病之一，臨床典型表現(xiàn)為甲狀腺腫大、Graves眼病和高代謝癥候群等。GD是甲狀腺功能亢進(jìn)癥的最常見(jiàn)病因［1］。但臨床中應(yīng)用抗甲狀腺藥物治療普遍存在復(fù)發(fā)率高、治療周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)［2-3］。目前，臨床上對(duì)GD發(fā)病過(guò)程中“甲狀腺細(xì)胞異常過(guò)度增殖”這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，尚缺乏針對(duì)性的治療藥物［4］。本研究以細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2基因?yàn)榘悬c(diǎn)，針對(duì)ERK1/2基因的siRNA特異性片段，采用 Lipofectam ine RNAiMAX Reagent轉(zhuǎn)染試劑將其有效地轉(zhuǎn)染入Fisher大鼠甲狀腺細(xì)胞-5（fisher rat thyroid cell line-5，F(xiàn)RTL-5）細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)ERK1/2基因沉默，從而研究RNAi效應(yīng)對(duì)FRTL-5細(xì)胞 ERK1/2基因表達(dá)的抑制作用及其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，探討GD的治療新策略。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

FRTL-5細(xì)胞（CRL1468）來(lái)源于ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物及制備

甲亢寧膠囊（以下簡(jiǎn)稱“甲亢寧”），中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，京藥制字 Z20063194，批號(hào)20151203。將1粒甲亢寧（0.45g）溶于14.265mL純水中，配制成100 mg/mL甲亢寧母液，用0.22 μm濾器過(guò)濾至離心管，4 ℃保存。依據(jù)前期研究，用F12完全培養(yǎng)液將甲亢寧母液稀釋成3 mg/mL［5］。

1.3 主要試劑與儀器

ERK1/2 siRNA由上海吉瑪公司合成，序列參照文獻(xiàn)［6］。ERK1/2siRNA序列：5'-GCCGCCGCCGCC GCCAT-3'，與MAPKmRNA翻譯起始部位的17個(gè)堿基序列互補(bǔ)；隨機(jī)核苷酸序列：5'-CGCGCGCTCGCG CACCC-3' Lipofectamine RNAiMAX Reagent，Invitrogen公司；Trizol reagent RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒及BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，康為世紀(jì)生物公司；CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑，日本同仁公司；p-ERK1/2、ERK1/2抗體，美國(guó)CST公司；F12完全培養(yǎng)基（GIBCO），0.25%胰酶細(xì)胞消化液（杭州吉諾），胎牛血清、緩沖液（Hyclone）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），LP400型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（法國(guó)巴斯德公司），96孔板（CORNING公司），微量加樣器（Eppendorff公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種細(xì)胞5×104個(gè)。實(shí)驗(yàn)分為空白組、甲亢寧組、甲亢寧協(xié)同組（甲亢寧+ERK1/2-siRNA）、陰性對(duì)照組（NC組）、siRNA組，其中甲亢寧組、甲亢寧協(xié)同組、siRNA組為干預(yù)組?？瞻捉M、NC組、siRNA組加F12完全培養(yǎng)基3mL，其余組加甲亢寧培養(yǎng)液 3mL。參照 Lipofectamine RNAiMAX Reagent說(shuō)明書分別對(duì)甲亢寧協(xié)同組、NC組、siRNA組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

ERK1/2 mRNA序列從 genebank查詢，應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物，在BLAST上進(jìn)行同源性分析。引物序列如下：ERK1-F，5'-CATCCGAGACATCCTC AGAGC-3'；ERK1-R，5'-GGTCGCAGGTGGTGTTGA TA-3'；ERK2-F，5'-AGGTTGTTCCCAAACGCTGA-3'；ERK2-R，5'-AGGTAAGTCGTCCAGCTCCA-3'；內(nèi)參β-actin-F，5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'；內(nèi)參β-actin-R，5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。

2.3 RT-PCR反應(yīng)

首先配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將上述20 μL反應(yīng)溶液65 ℃保溫5 min，37 ℃ 保溫40 min，70 ℃保溫10 min。然后配制PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，58 ℃、60 s讀板，共45個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔct表示相對(duì)樣品初始模板量。

2.4 Western blot檢測(cè)大鼠甲狀腺細(xì)胞-5細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉2 h。分別加入p-ERK1/2、ERK1/2一抗，4 ℃溫育過(guò)夜，再加二抗37 ℃溫育1 h后，膠片曝光，定影，凝膠成像系統(tǒng)分析。

2.5 CCK8法檢測(cè)大鼠甲狀腺細(xì)胞-5細(xì)胞增殖

調(diào)整FRTL-5細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL（每孔接種細(xì)胞約2×104個(gè)），轉(zhuǎn)染方法同前。轉(zhuǎn)染2 h后，吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入F12完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染24、48 h的細(xì)胞，每個(gè)時(shí)點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加CCK8檢測(cè)試劑10 μL，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度（OD）值，按CCK8試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 甲亢寧對(duì)大鼠甲狀腺細(xì)胞-5細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2基因表達(dá)的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組和NC組ERK1/2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異；與空白組比較，siRNA組和甲亢寧組能夠抑制FRTL-5細(xì)胞ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01）；與空白組、NC組比較，甲亢寧協(xié)同組ERK1/2 mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞-5 ERK1、ERK2基因相對(duì)表達(dá)量比較（±s，2-ΔΔct值））

表1 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞-5 ERK1、ERK2基因相對(duì)表達(dá)量比較（±s，2-ΔΔct值））

注：與空白組比較，**P＜0.01；與NC組比較，##P＜0.01

組別 n ERK1 ERK2空白組 3 1.00±0.00 1.00±0.00 NC組 3 0.99±0.07 0.86±0.16甲亢寧組 3 0.41±0.05**## 0.34±0.07**##siRNA組 3 0.28±0.03**## 0.29±0.05**##甲亢寧協(xié)同組 3 0.17±0.02**## 0.18±0.06**##

4.2 甲亢寧對(duì)大鼠甲狀腺細(xì)胞-5細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組、NC組比較，甲亢寧組、siRNA組p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）；與空白組、NC組比較，甲亢寧協(xié)同組p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

4.3 甲亢寧對(duì)大鼠甲狀腺細(xì)胞-5細(xì)胞增殖的影響

CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組、NC組比較，甲亢寧組、siRNA組、甲亢寧協(xié)同組OD值下降，存活細(xì)胞較少，F(xiàn)RTL-5細(xì)胞增殖較慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明通過(guò)下調(diào)ERK1/2 mRNA表達(dá)，可抑制FRTL-5細(xì)胞增殖。在24、48 h檢測(cè)點(diǎn)時(shí)，與siRNA組比較，甲亢寧組OD值較大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在48 h檢測(cè)點(diǎn)時(shí)，與空白組比較，NC組OD值較小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這可能是陰性序列對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用所致。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞-5 p-ERK12、ERK1/2蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞-5 p-ERK12、ERK1/2蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與NC組比較，##P＜0.01；與siRNA組，▲▲P＜0.01

組別 n p-ERK1/2/ERK1/2空白組 3 0.83±0.04 NC組 3 0.78±0.07甲亢寧組 3 0.42±0.02**##▲▲siRNA組 3 0.36±0.02**##甲亢寧協(xié)同組 3 0.19±0.02**##▲▲

圖1 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞-5 ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)免疫印跡電泳圖

表3 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞-5不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖比較（±s，OD值）

表3 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞-5不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖比較（±s，OD值）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與NC組比較，##P＜0.01

組別 n 24 h 48 h空白組 6 0.938±0.039 1.878±0.068 NC組 6 0.925±0.037 1.548±0.079*甲亢寧組 6 0.555±0.031**## 0.955±0.058**##siRNA組 6 0.484±0.025**## 0.838±0.071**##甲亢寧協(xié)同組 6 0.373±0.007**## 0.713±0.058**##

5 討論

FRTL-5是體外研究甲狀腺生理病理機(jī)制的常用模型。FRTL-5細(xì)胞的增殖是一個(gè)多因素共同作用的復(fù)雜過(guò)程。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)ERK1/2是促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑［7-8］，ERK1/2自身在細(xì)胞增殖中起著重要作用，ERK通路的抑制對(duì)于改善甲狀腺細(xì)胞過(guò)度增殖至關(guān)重要。我院于 1978年開(kāi)始，通過(guò)對(duì)大量甲亢患者系統(tǒng)的辨證研究發(fā)現(xiàn)甲亢病程中往往出現(xiàn)陰虛陽(yáng)亢之象，陰虛陽(yáng)亢證型為甲亢的基本證型，而后制備了具有滋陰潛陽(yáng)化痰散結(jié)功效的甲亢寧。方中牡蠣滋陰潛陽(yáng)、軟堅(jiān)散結(jié)為君；玄參滋陰清熱生津，佐牡蠣散結(jié)為臣；甲狀腺腫為痰凝所致，當(dāng)化痰、軟堅(jiān)散結(jié)，以連翹、山慈菇加強(qiáng)散結(jié)之力。諸藥合用，共奏滋陰潛陽(yáng)、化痰散結(jié)之功。30余年的臨床實(shí)踐表明，該藥在甲狀腺功能亢進(jìn)治療方面具有良好的療效［9］。課題組既往研究表明，ERK1/2是甲亢寧的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，調(diào)控ERK1/2蛋白表達(dá)可能是甲亢寧調(diào)控 FRTL-5細(xì)胞增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［5］。尋找一種可高效抑制ERK1/2通路并有效抑制其增殖的方法將大大改善GD患者的預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)將文獻(xiàn)已報(bào)道的針對(duì)ERK1 mRNA、ERK2 mRNA的共同的siRNA 片段轉(zhuǎn)染入FRTL-5細(xì)胞，利用 RNAi 技術(shù)在基因轉(zhuǎn)錄水平阻斷ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路。上述結(jié)果表明，甲亢寧對(duì)ERK1/2的磷酸化起阻斷作用，ERK1/2基因被沉默后，對(duì)甲狀腺細(xì)胞的增殖有抑制作用，甲亢寧可以協(xié)同ERK1/2-siRNA抑制FRTL-5細(xì)胞增殖。

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)《中國(guó)甲狀腺疾病診治指南編寫組》.中國(guó)甲狀腺疾病診治指南-甲狀腺功能亢進(jìn)癥［J］.中華內(nèi)科雜志，2007，46（10）：876-882.

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［5］ 孟淑華.中藥甲亢寧膠囊對(duì)FRTL-5細(xì)胞TSHR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制研究［D］.北京：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，2014.

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Effects of siRNA Silenced ERK 1/2 Gene Collaborated with Jiakangning Capsules on FRTL-5 Proliferation

LIN Lan， WANG Qiu-hong， YI Yong-xin
（Guang'anmen Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）

ObjectiveTo observe and explore the effects ofJiakangningCapsules on the expression of ERK1/2 gene and proliferation of FRTL-5 by studying the effects ofJiakangningCapsules collaborated with siRNA on interfering ERK1/2 gene in FRTL-5.MethodsFRTL-5 cells in good conditions were divided into control group，negative control group，JiakangningCapsules collaborated with siRNA group， siRNA interference group， andJiakangningCapsules group. RT-PCR was performed to detect the expression of ERK1/2 gene in mRNA levels in FRTL-5； Western blotting was performed to detect the expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2； CCK8 method was used to detect cell proliferation.ResultsRT-PCR results showed that the ERK1/2 mRNA expression of the control group and negative control group were of no significant difference （P＞0.05）； compared with the control group， siRNA interference group andJiakangningCapsules group could inhibit ERK1/2 gene mRNA expression in FRTL-5（P＜0.01）. Compared with the control group and negative control group， the ERK 1/2 mRNA expression ofJiakangningCapsules collaborated with siRNA group decreased obviously （P＜0.01）. Compared with the control group and negative control group， the expression of p-ERK1/2， ERK1/2 ofJiakangningCapsules group，JiakangningCapsules collaborated with siRNA group， and siRNA interference group decreased obviously （P＜0.01）. At the time of 24 h and 48 h after transfection， according to the results of CCK8， compared with the control group and negative control group， the cell proliferation ofJiakangningCapsules group，JiakangningCapsules collaborated with siRNA group， and siRNA interference group was inhibited （P＜0.01）.ConclusionJiakangningCapsules have blocking effect on the phosphorylation of ERK1/2. After ERK1/2 gene was silenced， the thyroid cell proliferation was inhibited.JiakangningCapsules can collaborate with ERK1/2-siRNA to inhibit FRTL-5 cell proliferation.

∶ thyroid cell； ERK1/2；JiakangningCapsules； RNA interference； proliferation

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0043-04

2015-12-29）

（

2016-01-27；編輯：華強(qiáng)）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81173260）

王秋虹，E-mai l：qiuhongfor tune@126.com

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.012