曾秀玲，田海蓉，王 慧，李 濤，劉祥友

(1.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008;2.貴州省鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)環(huán)境保護(hù)勞動衛(wèi)生管理站，貴州 貴陽 550001)

豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒繼發(fā)細(xì)菌感染病例的實(shí)驗(yàn)室診斷

曾秀玲1，田海蓉1，王 慧1，李 濤1，劉祥友2

(1.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008;2.貴州省鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)環(huán)境保護(hù)勞動衛(wèi)生管理站，貴州 貴陽 550001)

豬繁殖與呼吸障礙綜合征(PRRS)是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病之一。實(shí)驗(yàn)采集臨床疑似豬繁殖與呼吸障礙綜合征病死豬的臟器組織，應(yīng)用分子生物學(xué)和細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確診。經(jīng)熒光RT－PCR檢測，該病例確診為豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染所致;經(jīng)細(xì)菌分離鑒定和耐藥性分析，該病例繼發(fā)革蘭氏陽性球菌感染，頭孢氨噻肟對該致病菌抑制效果較好。

豬繁殖與呼吸障礙綜合征;細(xì)菌;繼發(fā)感染;診斷

豬繁殖與呼吸障礙綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種急性接觸性傳染病，以母豬妊娠后期流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙和仔豬嚴(yán)重呼吸道癥狀為特征［1～4］。1987年該病首發(fā)于美國，隨后 2～3年內(nèi)迅速在北美和歐洲廣泛流行，以后蔓延至全世界范圍的大流行［5，6］。我國于 1995 年首次從疑似PRRS病例中分離到PRRSV，證實(shí)了本病在國內(nèi)的存在［7］，目前該病在我國感染情況較為嚴(yán)重。

2015年4月，貴州省某養(yǎng)豬場所飼豬出現(xiàn)厭食、消瘦、生長發(fā)育遲緩、呼吸困難、母豬流產(chǎn)等類似PRRS癥狀的疾病。為確診病因，對1頭臨床病死母豬內(nèi)臟組織進(jìn)行了分子生物學(xué)和細(xì)菌學(xué)檢測，確診為PRRS繼發(fā)革蘭氏陽性球菌感染，現(xiàn)將病例診斷情況介紹如下，為預(yù)控疫病流行暴發(fā)提供技術(shù)支持和診斷參考。

1 材料與方法

1.1 材料 病料采自貴州省某養(yǎng)豬場1頭疑似PRRS癥狀的病死母豬病變內(nèi)臟組織;PRRSV和豬瘟病毒(CSFV)RNA提取試劑盒及熒光RT－PCR擴(kuò)增試劑盒購自北京世紀(jì)元亨有限公司;細(xì)菌分離培養(yǎng)基及藥敏紙片為貴州省動物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 PRRSV、CSFV核酸檢測 取病死母豬的脾臟、腎臟、肺臟及淋巴結(jié)無菌研磨成組織勻漿液，以13 000 r/min離心3 min，取上清液使用RNA提取試劑盒提取病料總RNA;以針對PRRSV的熒光RTPCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量擴(kuò)增。

1.3 細(xì)菌檢測

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng):無菌采取病死豬肝臟、脾臟、心臟進(jìn)行涂片，染色，鏡檢。同時無菌操作劃線接種血清瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察其特征。

1.3.2 藥敏試驗(yàn):挑取培養(yǎng)基上單個菌落劃線接種到血清瓊脂平板，選擇頭孢氨噻肟、青霉素、多西環(huán)素等10種常用的抗菌素藥敏片放于培養(yǎng)基中進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PRRS病原核酸檢測結(jié)果 以PRRS通用熒光RT－PCR核酸檢測試劑盒對從病死豬組織所提基因組RNA進(jìn)行實(shí)時擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，從病死豬組織所提基因組RNA中出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，CT值為14.588 9。根據(jù)說明書結(jié)果判定CT值＜30且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，為PRRS陽性，初步判定該病死豬為PRRSV感染所致。

圖1 PRRS實(shí)時熒光RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 CSF病原核酸檢測結(jié)果 以CSF通用熒光RT－PCR核酸檢測試劑盒對從病死豬組織所提基因組RNA進(jìn)行實(shí)時擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。

圖2 CSF實(shí)時熒光RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖2可知，從病死豬組織所提基因組RNA中未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，CT值＜40。根據(jù)說明書結(jié)果判定CT值＜40且未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，為CSF陰性，表明病死豬未感染CSFV。

2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 無菌采取病死豬肝臟、脾臟、心臟接種于血清瓊脂培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，可見血清瓊脂培養(yǎng)基上長出乳白色、圓形、邊緣整齊、凸起、半透明的菌落。細(xì)菌經(jīng)染色鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽性球菌，表明病死豬同時繼發(fā)有革蘭氏陽性球菌感染。見圖3。

圖3 細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 取上述血清瓊脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌純培養(yǎng)物，選擇常用的抗菌素進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

由表1可知，頭孢氨噻肟對該致病菌抑制效果較好，多西環(huán)素、青霉素藥敏效果次之。

3 討論

3.1 本試驗(yàn)采用分子生物學(xué)和細(xì)菌學(xué)方法對臨床表現(xiàn)消瘦、呼吸困難、流產(chǎn)等癥狀病死豬進(jìn)行了病因確定性診斷。結(jié)果，從病死豬病變組織中檢測到PRRSV核酸，并從肝臟、脾臟、心臟中分離到革蘭氏陽性球菌，表明病死豬感染PRRSV，并繼發(fā)感染革蘭氏陽性球菌。對分離得到的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果細(xì)菌對10種常用抗生素表現(xiàn)不同的耐藥性，以對頭孢噻呋鈉最為敏感。

3.2 能引起母豬出現(xiàn)繁殖障礙的原因很多，包括環(huán)境應(yīng)激性因素、飼料營養(yǎng)性因素和病原傳染性因素等，而能引起豬呼吸系統(tǒng)癥狀的病原性因素也很多;同時PRRS剖檢病變與CSF等疾病極其相似，這給PRRS的臨床診斷造成了較大困難［8］。因此，若需確診PRRS，必須通過實(shí)驗(yàn)室診斷。本次診斷依照農(nóng)業(yè)部有關(guān)規(guī)定，對臨床疑似PRRS病例進(jìn)行熒光RT－PCR檢測，確診該病例為PRRSV感染所致。

3.3 自PRRS在我國出現(xiàn)，尤其是2006年高致病性毒株出現(xiàn)以來，我國的養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大。PRRSV是引起免疫抑制的主要病毒之一，感染后豬的免疫功能下降，能繼發(fā)感染病毒性和細(xì)菌性疾病，同時免疫抑制病毒會影響疫苗的免疫效果，促進(jìn)其他病毒的感染，導(dǎo)致嚴(yán)重發(fā)病和死亡［9，11］。此次疫情發(fā)生的原因可能為豬群感染PRRSV后繼發(fā)感染革蘭氏陽性球菌。

3.4 針對PRRS常用的措施包括生物安全、疫苗免疫、生產(chǎn)管理(特別是后備母豬)、同群感染、清群、重新引入、封群等，使用疫苗免疫是目前大部分豬場防控PRRS的主要選擇［12］。對于PRRS伴發(fā)豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌及大腸桿菌等細(xì)菌性疾病混合感染時，在感染的高峰期添加抗生素進(jìn)行藥物預(yù)防具有重要意義。此外，體內(nèi)外試驗(yàn)表明替米考星等藥物可間接抑制PRRSV的復(fù)制，從而降低PRRS所造成的影響［13，14］。

［1］蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.233～261.

［2］殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.第2版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.619～625.

［3］農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)司.中國動物疾病志［M］.北京:科學(xué)出版社，1993.

［4］母安雄，劉生偉，蔣建一，等.豬繁殖與呼吸障礙綜合征的診斷方法［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2003，30(6):35～37.

［5］石忠博，高云龍，李艷芝.豬繁殖與呼吸綜合征的研究進(jìn)展［J］.養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2008，(6):140～141.

［6］Wensvoort G，Terpstra C，Pol JM，et al.Mystery swine disease in the Netherlands;the isolation of Lelystad virus［J］.J Vet Q，1991，13(3):121～130.

［7］李希友，呂桂霞.山羊傳染性胸膜肺炎的診斷與治療試驗(yàn)［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2005，24(5):129～131.

［8］洪猛，周碧君，王開功，等.豬繁殖與呼吸綜合征疑似病例實(shí)驗(yàn)室診斷［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34(10):122～127.

［9］鄧博文，黎江.PRRS引起豬免疫抑制的作用機(jī)理及其防制［J］.畜禽業(yè)，2007，(1):31.

［10］孫龍，劉宇，黃震，等.2株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離、堅(jiān)定及遺傳進(jìn)化分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41(3):33～38.

［11］馬琳，付薇，易春華.一例豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬鏈球菌混合感染病例的診斷［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2010，35(5):24～25.

［12］薛平，曲向陽.我國高致病性藍(lán)耳病研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(5):1 389～1 392.

［13］Du YJ，Yoo DW，Marie AP，et al.Antiviral activity of tilmicosin for Type 1 and Type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus in cultured porcine alvcolar macrophages［J］.Antivir Antiretrovir，2011，(3):28～33.

［14］Molttor TW，Bautista E，Shin J，et al.Tilimicosin affects porcine reprodutive and respiratory syndrome virus replication［C］.Leman Swine Conference，2011.31.

Laboratory Diagnosis of Secondary Bacterial Infection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Zeng Xiuling1，Tian Hairong1，Wang Hui1，Li Tao1，Liu Xiangyou2
(1.Guizhou Province Animal Disease Control Center，Guiyang Guizhou 550008，China;2.Guizhou Province Township Enterprise Environmental Protection Labor Health Management Station，Guiyang Guizhou 550001，China)

Porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)is one of an important the viral infectious diseases in swine industry worldwide.This experiment collected clinical suspected porcine reproductive and respiratory syndrome tissues of pig mortality，application of molecular biological and bacteriological methods of laboratory diagnosis.By fluorescence RT－PCR detection，the case was confirmed to be infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus;bacterial isolation and drug resistance analysis，the case of gram positive bacteria infection，and the inhibition effect of the bacteria on the pathogenic bacteria.

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome;Bacteria;Secondary Infection;Diagnosis

S858.28

A

1007－1474(2016)01－0020－03

2015－10－27

曾秀玲(1972—)，女，主要從事動物疫病病原學(xué)研究。E －mail:250433375@qq.com