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霍山石斛的組織培養(yǎng)研究

敖靜1陳文2張?jiān)葡?

（1.深圳市雙暉農(nóng)業(yè)科技有限公司 深圳 518000 2.深圳市華盛實(shí)業(yè)股份有限公司 深圳 518000）

以霍山石斛種子為外植體，不同激素為變量，篩選出霍山石斛種子萌發(fā)、增殖培養(yǎng)、生根壯苗培養(yǎng)各階段適宜的培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，霍山石斛種子萌發(fā)適宜的培養(yǎng)基配方為花寶一號(hào)1.5g·L-1+花寶二號(hào)0.5g·L-1+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+ 香蕉 100g·L-1+ 蔗糖 30g·L-1+ 瓊脂 4.75g·L-1+ 碳粉 0.5g·L-1+ 肌醇 100g·L-1+ 牛肉蛋白胨 1g·L-1，種子萌發(fā)狀態(tài)好，顏色翠綠。繼代增殖適宜的培養(yǎng)基配方為MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+瓊脂4.8g/L+6-BA1.5mg/L+KT1.5mg/L，霍山石斛增殖倍數(shù)達(dá)到2.5，增殖苗生長(zhǎng)勢(shì)較好，6-BA對(duì)霍山石斛增殖實(shí)驗(yàn)增殖的影響顯著，NAA、KT對(duì)霍山石斛增殖的影響不顯著。適宜的生根壯苗培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+瓊脂4.8g/L+6-BA1.5mg/L+NAA0.5-1mg/L+IBA1-1.5mg/L?；羯绞嚬苊玳L(zhǎng)勢(shì)較好，莖粗壯，平均生根數(shù)達(dá)到9根以上。6-BA對(duì)霍山石斛生根壯苗培養(yǎng)株高影響極顯著，IBA對(duì)霍山石斛生根壯苗培養(yǎng)株高影響顯著，6-BA對(duì)霍山石斛生根培養(yǎng)莖粗效果極顯著。

霍山石斛；種子萌發(fā)；增殖培養(yǎng)；生根壯苗

1 前言

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng）又名米斛、龍頭鳳尾草，蘭科石斛屬多年生草本植物。性喜陰涼濕潤(rùn)、通風(fēng)多霧的環(huán)境[1]。是中國(guó)蘭科石斛屬藥用植物中最為珍稀名貴的品種，據(jù)本草綱目記載，霍山石斛具有“強(qiáng)陰益精、厚腸胃、補(bǔ)內(nèi)絕不足，輕身延年”等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，霍山石斛含有豐富的石斛堿，多糖等多種活性物質(zhì)，抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力效果顯著[2]。享有“軟黃金”、“千金草”、“中華仙草之最”等美譽(yù)[3]。由于霍山石斛種子極難萌發(fā)，萌發(fā)后生長(zhǎng)極為緩慢以及所需自然環(huán)境苛刻和過度采伐等原因，野生資源已瀕臨滅絕[4]。針對(duì)此類自身繁殖率低的植物，植物組織培養(yǎng)技術(shù)是解決霍山石斛快速擴(kuò)繁難題的重要途徑。本研究以霍山石斛種子為外植體，進(jìn)行了組培技術(shù)的研究，篩選出霍山石斛組織培養(yǎng)各階段的最佳組培配方，建立了種苗快速擴(kuò)繁技術(shù)體系，為霍山石斛的規(guī)?；N植優(yōu)質(zhì)種苗的獲取提供參考。

2 材料與方法

2.1 種子萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選

設(shè)置四種不同的種子萌發(fā)培養(yǎng)基配方，具體配方如：①M(fèi)S；②花寶一號(hào)1.5g/L；③花寶二號(hào)0.5g/L；④花寶一號(hào)1.5g/L+花寶二號(hào) 0.5g/L。添加肌醇 100mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.3mg/L。采摘成熟未開裂無病斑的飽滿霍山石斛蒴果，流水沖洗1h。超凈工作臺(tái)上，先用75％酒精消毒30s，無菌水沖洗3次，再用0.1％的Hg－Cl2溶液消毒20min，無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干蒴果表面水分。在石斛蒴果兩端橫切一刀，用鑷子沿霍山石斛蒴果縱向生長(zhǎng)方向夾住蒴果，輕輕將霍山石斛種子撒入種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種20瓶。培養(yǎng)40d后拍照統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況，生長(zhǎng)勢(shì)，顏色。

2.2 繼代增殖培養(yǎng)基的篩選

以MS為基本培養(yǎng)基，選用L16（43）正交表，共16個(gè)處理（表1），6-BA、KT 設(shè)置 4 個(gè)水平，分別為 0mg·L-1、0.5mg·L-1、1mg·L-1、1.5mg·L-1。NAA 設(shè)置 4 個(gè)水平分別為 0mg·L-1、0.2mg·L-1、0.5mg·L-1、1mg·L-1。外植體選擇高度1cm左右的霍山石斛無菌苗。每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種5棵小苗。培養(yǎng)60d后拍照統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)，生長(zhǎng)勢(shì)。

表1 霍山石斛增殖培養(yǎng)正交實(shí)驗(yàn)方案L16（43）

2.3 生根壯苗培養(yǎng)基的篩選

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，選取選用L16（43）正交表，共16個(gè)處理（表 2），6-BA 設(shè)置 4 個(gè)水平，分別為 0mg·L-1，0.2mg·L-1，0.5mg·L-1，1mg·L-1，NAA 和 IBA 設(shè)置 4 個(gè)水平，分別為 0mg·L-1，0.5mg·L-1，1mg·L-1，1.5mg·L-1。外植體選擇高度達(dá)到 1.5cm 的霍山石斛無菌苗，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種5棵小苗。培養(yǎng)90d后拍照統(tǒng)計(jì)生根數(shù)，株高，莖粗。

2.4 培養(yǎng)條件

表2 霍山石斛生根壯苗正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案L16（43）

試驗(yàn)中所使用的培養(yǎng)基均添加香蕉100g·L-1、蔗糖30g·L-1、碳粉 0.5g·L-1、牛肉蛋白胨 1g·L-1、瓊脂 4.8g·L-1，pH 為 5.8，溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度 2000Lx，光照時(shí)間 10h·d-1條件下培養(yǎng)。

3 結(jié)果分析

3.1 種子萌發(fā)培養(yǎng)基篩選

播種10d后，各個(gè)培養(yǎng)基種子開始萌動(dòng)膨大，剛開始為淡黃色，后期逐漸轉(zhuǎn)綠。處理1種子萌發(fā)狀態(tài)良好，原球莖飽滿，生長(zhǎng)勢(shì)較好，顏色嫩綠，健壯。處理2種子基本萌發(fā)，原球莖較飽滿，生長(zhǎng)勢(shì)一般，顏色黃綠。處理3種子基本萌發(fā)，原球莖細(xì)小，生長(zhǎng)勢(shì)一般，顏色黃綠。處理4種子萌發(fā)狀態(tài)良好，原球莖飽滿，生長(zhǎng)勢(shì)最好，顏色濃綠。處理1和處理4種子萌發(fā)情況普遍高于其他組培養(yǎng)基，培養(yǎng)40d后顏色翠綠，部分還長(zhǎng)出一片嫩葉，其中處理4種子萌發(fā)生長(zhǎng)勢(shì)較優(yōu)，MS培養(yǎng)基培養(yǎng)次之，單獨(dú)加花寶一號(hào)或二號(hào)其種子萌發(fā)狀態(tài)不好，原球莖不夠飽滿，顏色黃綠。綜合分析可得適宜霍山石斛種子萌發(fā)的培養(yǎng)基配方為：花寶一號(hào)1.5g/L+花寶二號(hào)0.5g/L培養(yǎng)基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.3mg/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+瓊脂4.75g/L+碳粉0.5g/L+肌醇100mg/L+牛肉蛋白胨1g/L。培養(yǎng)40d后培養(yǎng)基上充斥了石斛種子，部分種子擠壓在一起而吸收不到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及光照而變黃發(fā)白死亡，40d后需轉(zhuǎn)接一次。

3.2 增殖培養(yǎng)基篩選

繼代增殖培養(yǎng)是植物離體快繁的第二個(gè)重要階段，通過增殖培養(yǎng)，促進(jìn)分蘗數(shù)的增大，提高擴(kuò)繁率。通過將苗高1cm左右的無菌苗接種于各增殖培養(yǎng)基中，60d后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)、生長(zhǎng)勢(shì)。

表3 霍山石斛增殖試驗(yàn)極值分析表

從增殖實(shí)驗(yàn)極值分析表（表3）中可以看出，3個(gè)因素對(duì)其增殖倍數(shù)和生長(zhǎng)勢(shì)的主次關(guān)系為：6-BA對(duì)霍山石斛增殖的影響力最大，其次是NAA，最后是KT。較優(yōu)組合是A4B1C4。繼續(xù)進(jìn)行方差分析，由表4方差分析可知，6-BA對(duì)霍山石斛增殖實(shí)驗(yàn)增殖的影響顯著，NAA、KT對(duì)或霍山石斛增殖實(shí)驗(yàn)增殖的影響不顯著。三種激素對(duì)株高效果的影響均不顯著。

表4 霍山石斛增殖試驗(yàn)方差分析表

不同培養(yǎng)基激素配方，其芽增殖情況各不相同，高濃度的6-BA配合較高濃度的KT及較低濃度的NAA，更容易促進(jìn)霍山石斛芽增殖。在較高濃度的6-BA下，隨著KT濃度的升高和NAA濃度的降低，其增殖倍數(shù)逐漸上升，生長(zhǎng)勢(shì)均保持在較高水平。增殖倍數(shù)最高的是處理13，其平均增殖倍數(shù)達(dá)到3，其次是處理14，其平均增殖倍數(shù)為2.9。處理3和14其6-BA濃度均為1.5mg/L，處理13無添加NAA，KT濃度較高為1.5mg/L，平均增殖倍數(shù)最高。而處理14添加了0.2mg/LNAA配合1mg/LKT，增殖倍數(shù)稍低為2.9，但也處于較高水平。增殖實(shí)驗(yàn)中各個(gè)處理生長(zhǎng)勢(shì)均較好，平均生長(zhǎng)勢(shì)得分達(dá)到3.6以上。其中處理13和14平均生長(zhǎng)勢(shì)最好為4.2，因此較高濃度的6-BA配合較高濃度的NAA和較低濃度的KT更有利于霍山石斛增殖苗的生長(zhǎng)，其霍山石斛增殖苗長(zhǎng)勢(shì)較好，顏色翠綠，健壯。若不添加6-BA，不管NAA濃度和KT濃度怎么變化，霍山石斛增殖苗生長(zhǎng)勢(shì)均較差。綜合以上分析，霍山石斛叢生芽增殖處理以處理13最佳，最佳激素配方為MS+6-BA1.5mg/L+KT1.5mg/L。

3.3 生根壯苗培養(yǎng)基篩選

表5 霍山石斛生根壯苗試驗(yàn)極值分析表

生根壯苗試驗(yàn)是組培苗生產(chǎn)的最后一個(gè)環(huán)節(jié)，通過此步驟，促進(jìn)霍山石斛組培苗生根及枝條的粗壯。將高1.5cm左右的無菌苗接種于各生根培養(yǎng)基中，90d后統(tǒng)計(jì)株高、根數(shù)、莖粗情況。結(jié)果表明：較高濃度的生長(zhǎng)素能促進(jìn)霍山石斛生根。當(dāng)6-BA濃度為0.5mg/L，NAA濃度為0.5mg/L，IBA濃度為1.5mg/L時(shí)，霍山石斛平均生根數(shù)最高，達(dá)到22.1根，當(dāng)6-BA濃度為1mg/L，NAA濃度為1.5mg/L時(shí)，平均生根數(shù)較低是13根。從株高和莖粗來看，當(dāng)6-BA濃度為0.5mg/L時(shí)，IBA濃度在0～1mg/L，NAA濃度在1～1.5mg/L時(shí)，霍山石斛生根壯苗試驗(yàn)中株高最高達(dá)到3.6cm，莖粗達(dá)到3.4～3.5mm。但若6-BA濃度在0.5mg/L時(shí)，IBA濃度為1.5mg/L，NAA濃度為0.5mg/L時(shí)，其株高和莖粗反而更低為3.3cm和3.3mm。而當(dāng)6-BA濃度為1mg/L時(shí)反而不利于霍山石斛株高和莖粗的增高。因此較高濃度的6-BA均不利于霍山石斛株高和莖粗的增高。通過表3極值分析可以看出，6-BA、NAA、KT對(duì)霍山石斛生根壯苗影響的主次關(guān)系為：株高6-BA＞IBA＞NAA，根數(shù)、莖粗6-BA＞NAA＞IBA。各個(gè)指標(biāo)下的較優(yōu)組合為A3B2-3C3-4，各個(gè)激素適宜的濃度為6-BA為0.5mg/L，NAA 0.5～1mg/L，IBA 1～1.5mg/L。由表6方差分析可知，6-BA對(duì)霍山石斛株高影響極顯著，IBA對(duì)霍山石斛株高影響顯著，NAA對(duì)霍山石斛株高影響不顯著。6-BA、NAA、IBA對(duì)霍山石斛生根效果不顯著。6-BA對(duì)霍山石斛莖粗效果極顯著，NAA、IBA對(duì)莖粗影響不顯著（見表6）。

綜合以上分析，霍山石斛生根壯苗的最佳激素配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5～1mg/L+IBA 1～1.5mg/L。培養(yǎng)時(shí)間是90d。當(dāng)霍山石斛株高達(dá)到3cm以上，葉片3片以上，莖粗達(dá)到2mm以上，根數(shù)達(dá)到3根以上即可煉苗后移植室外。

4 討論

以種子為外植體進(jìn)行無菌播種產(chǎn)生種苗或者形成原球莖并增殖，進(jìn)而分化發(fā)育成完整植株是石斛類組培擴(kuò)繁的重要途徑，霍山石斛種子萌發(fā)對(duì)培養(yǎng)基要求不高，MS、花寶均適宜作為霍山石斛種子萌發(fā)培養(yǎng)基。本研究結(jié)果表明，以霍山石斛種子在花寶一號(hào)1.5g/L+花寶二號(hào)0.5g/L培養(yǎng)基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.3mg/L上萌發(fā)效果最好。錢文林[5]發(fā)現(xiàn)霍山石斛在花寶1號(hào)1.0mg/L+花寶2號(hào)1.0g/L能進(jìn)行種子萌發(fā)?；▽?號(hào)+花寶2號(hào)同樣適宜霍山石斛種子萌發(fā)誘導(dǎo)，配合低濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素更有利于促進(jìn)霍山石斛種子萌發(fā)。這與胡萬群[6]發(fā)現(xiàn)適宜的霍山石斛在1/2MS配合低濃度的BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+10％馬鈴薯汁培養(yǎng)基上能促進(jìn)未成熟種胚萌發(fā)相符。霍山石斛增殖培養(yǎng)過程中，不同的培養(yǎng)基配方其增殖效果各不相同。本研究結(jié)果表明，MS+6-BA 1.5mg/L+KT 1.5mg/L上培養(yǎng)增殖倍數(shù)能達(dá)到2.5，高濃度的細(xì)胞分裂素能促進(jìn)霍山石斛增殖，傅玉蘭[7]等研究發(fā)現(xiàn)以MS為基本培養(yǎng)基，添加激素KT3mg/L+2，4-D0.2mg/L，增殖效果最好，KT濃度越高，增殖倍數(shù)越高?；羯绞鶋衙缗囵B(yǎng)過程中，生長(zhǎng)素對(duì)生根壯苗影響較大，周則剛[8]等研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛芽生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/L IBA。而胡萬群[9]發(fā)現(xiàn)霍山石斛在1/2MS+NAA 0.5mg/L中生根效果好，能得到大量整齊一致的霍山石斛種苗。唐英武[9]研究發(fā)現(xiàn)，霍山石斛生根的最適培養(yǎng)基為MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L。而本研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛生根壯苗的最佳激素配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5～1mg/L+IBA 1～1.5mg/L，培養(yǎng)出的試管苗從根數(shù)、株高、莖粗均達(dá)到較高水平。說明高濃度的IBA配合低濃度的NAA更有利于霍山石斛生根。這與劉建美[10]的研究一致。因此細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配合更有利于霍山石斛生根壯苗培養(yǎng)。

5 結(jié)論

霍山石斛種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為花寶一號(hào)1.5g/L+花寶二號(hào)0.5g/L培養(yǎng)基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.3mg/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+瓊脂4.75g/L+碳粉0.5g/L+肌醇100mg/L+牛肉蛋白胨1g/L，40d需轉(zhuǎn)接一次。繼代增殖中，MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+瓊脂 4.8g/L+6-BA 1.5mg/L+KT 1.5mg/L為最佳的增殖培養(yǎng)基配方，增殖倍數(shù)能達(dá)到2.5，培養(yǎng)時(shí)間是60d。生根壯苗培養(yǎng)過程中，適宜的生根壯苗培養(yǎng)基配方為MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+瓊脂4.8g/L+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5-1mg/L+IBA 1～1.5mg/L，培養(yǎng)時(shí)間是90d。通過本試驗(yàn)篩選出了霍山石斛播種-增殖-生根培養(yǎng)各階段適宜的培養(yǎng)基配方，建立了該途徑的種苗快速繁殖體系，對(duì)促進(jìn)霍山石斛種苗工廠化生產(chǎn)和規(guī)?；N植優(yōu)質(zhì)種苗的獲取有重要作用。

目前，霍山石斛組培技術(shù)研究已有一定進(jìn)展，但也存在一些問題，主要有：①未從工廠化生產(chǎn)角度研究既能降低成本，又能培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)試管苗的培養(yǎng)技術(shù)，且工廠化培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程尚未有人研究。②種子萌發(fā)途徑培育出的試管苗性狀參差不齊。③組培生產(chǎn)和大田移栽銜接較少。針對(duì)以上問題，今后的研究可從下方面進(jìn)行研究：①從節(jié)約成本角度改良培育技術(shù)，加強(qiáng)光照、溫度、濕度、切割手法等的研究，縮短培養(yǎng)周期，提高生產(chǎn)效率，形成工廠化生產(chǎn)的技術(shù)規(guī)程。②提高自身育種技術(shù)，培育優(yōu)質(zhì)的種子資源并加強(qiáng)種質(zhì)資源的保存。③探索以莖段、葉片、腋芽等為外植體進(jìn)行組培擴(kuò)繁技術(shù)。④加強(qiáng)大田移植技術(shù)的研究，建立大田種植技術(shù)規(guī)程[11]。

表6 霍山石斛生根壯苗試驗(yàn)方差分析表

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S567.2

：A

：1005-7897（2016）22-0001-04

2016-11-12

敖靜（1989-），女，中級(jí)農(nóng)藝師，碩士，主要從事作物遺傳育種工作。

深圳市技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目（JSGG20141118110444062）。