侯大海，劉云國(guó)，張　亮，徐云峰，劉凌霄

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊　830046；2.廣東產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)督研究院，廣東廣州　510330；3.青州榮美爾生物科技有限公司，山東青州　262500；4.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島　266000）

食品微生物DNA能力驗(yàn)證樣品的均勻性和穩(wěn)定性研究

侯大海1，2，*劉云國(guó)1，3，張亮3，徐云峰4，劉凌霄3

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046；2.廣東產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)督研究院，廣東廣州510330；3.青州榮美爾生物科技有限公司，山東青州262500；4.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266000）

食品微生物DNA能力驗(yàn)證，是利用DNA檢測(cè)方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間微生物檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)來(lái)確定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的活動(dòng)。以沙門(mén)氏菌（Salmonella）基因組DNA為測(cè)試目標(biāo)，開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)室間食品微生物DNA檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品的制備，研究了DNA檢測(cè)能力驗(yàn)證中樣品的均勻性和穩(wěn)定性，以期為食品微生物DNA能力驗(yàn)證的運(yùn)作提供指導(dǎo)。

食品微生物；DNA能力驗(yàn)證；均勻性；穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證，是通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)來(lái)確定實(shí)驗(yàn)室能力的活動(dòng)。通過(guò)持續(xù)地開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證活動(dòng)，可以有效地提高實(shí)驗(yàn)室的品質(zhì)控制能力和檢測(cè)水平，并提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性和權(quán)威性［1］。同時(shí)，為科研工作以及政府管理工作提供科學(xué)、客觀(guān)的信息。常規(guī)微生物能力驗(yàn)證，通常指寄送含或不含目標(biāo)測(cè)試菌盲樣時(shí)的驗(yàn)證能力。由于可能存在致病微生物，常規(guī)微生物能力驗(yàn)證方式在檢測(cè)樣品的運(yùn)輸、儲(chǔ)存、檢測(cè)時(shí)，存在較大的生物安全隱患。實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證活動(dòng)中采用滅活的微生物，通過(guò)提取DNA進(jìn)行檢測(cè)的方法可消除這種危險(xiǎn)。因而研究食源性致病微生物時(shí)，DNA檢測(cè)能力驗(yàn)證的運(yùn)作極其重要。能力驗(yàn)證計(jì)劃中的樣品制備不同于一般檢測(cè)樣品的制備，除保證樣品具有代表性和可靠性外，還應(yīng)考慮樣品的均一性和穩(wěn)定性［2］。基于以上能力驗(yàn)證規(guī)則的要求，本文研究了沙門(mén)氏菌（Salmonella）DNA樣品能力驗(yàn)證中的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)。

1　材料與方法

1.1沙門(mén)氏菌的培養(yǎng)和制備

沙門(mén)氏菌菌株，來(lái)源于美國(guó)典型微生物菌種保藏中心（ATCC）。沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 49416）經(jīng)活化后，挑取單菌落接種到含有200 mL的TSBYE三角瓶中大量培養(yǎng)，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min收集沉淀，加入雙蒸水重新懸浮，水浴滅活后，分裝到Eppendorf管中凍干制樣［3］。

1.2均勻性試驗(yàn)

若F＜自由度為（v1，v2） 及給定顯著性水平α（通常α=0.05）的臨界值 Fα（v1，v2），則表明樣品內(nèi)和樣品間無(wú)顯著性差異，因而樣品是均勻的。

1.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

采用室溫條件下的儲(chǔ)存溫度（20℃），進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。樣品制備完畢后間隔15 d，從沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品中各隨機(jī)抽取6份樣品，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。采用2個(gè)樣本均數(shù)顯著性檢驗(yàn)-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

自由度df=2（n-1）

若|t|＜自由度為2（n-1）給定顯著性水平α（α= 0.05）的臨界值t0.05［2（n-1）］，則表明2次檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，因而樣品是穩(wěn)定的。

2　結(jié)果與分析

2.1均勻性試驗(yàn)

（1）樣品A為沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品。隨機(jī)選取A樣品6個(gè)，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果與已知本底結(jié)果相吻合，說(shuō)明均為陽(yáng)性。CT值的平均值為14.75。

（2）樣品B為沙門(mén)氏菌陰性樣品。經(jīng)隨機(jī)選取B樣品6個(gè)，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果與已知本底結(jié)果相吻合，說(shuō)明結(jié)果均為陰性。

沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品的均勻性試驗(yàn)結(jié)果（熒光定量PCR CT值）見(jiàn)表1，沙門(mén)氏菌樣品均勻性試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品的均勻性試驗(yàn)結(jié)果（熒光定量PCR CT值）

表2　沙門(mén)氏菌樣品均勻性試驗(yàn)方差分析結(jié)果

F臨界值F0.05（5，6）=4.387，計(jì)算的F值為0.106 4，該值＜F臨界值，無(wú)顯著性差異，這表明樣品中沙門(mén)氏菌含量均勻。

沙門(mén)氏菌均勻性試驗(yàn)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1　沙門(mén)氏菌均勻性試驗(yàn)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（熒光定量PCR CT值）見(jiàn)表3。

表3　沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（熒光定量PCR CT值）

由表3可知，沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品第1次檢測(cè)的平均值結(jié)果為14.73，室溫條件下放置15 d后第2次檢測(cè)的平均值結(jié)果為14.93。

沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

t臨界值t0.05（10）=2.228，計(jì)算所得|t|值＜t臨界值，無(wú)顯著性差異，這表明沙門(mén)氏菌樣品的穩(wěn)定性良好。

沙門(mén)氏菌穩(wěn)定性試驗(yàn)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。

圖2　沙門(mén)氏菌穩(wěn)定性試驗(yàn)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

3　結(jié)論與討論

本次沙門(mén)氏菌DNA能力驗(yàn)證要求利用基于DNA技術(shù)的分子生物學(xué)手段進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明DNA樣品符合均勻性和穩(wěn)定性的要求。實(shí)驗(yàn)室間食源致病微生物DNA檢測(cè)能力驗(yàn)證提供的沙門(mén)氏菌檢測(cè)樣品已經(jīng)滅活，目的是消除能力驗(yàn)證活動(dòng)中食源致病微生物在運(yùn)輸、儲(chǔ)存、檢測(cè)過(guò)程中的生物安全隱患。本次能力驗(yàn)證活動(dòng)的樣品在制備、保存、運(yùn)輸、安全性等技術(shù)指標(biāo)上均能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。本研究以CNAS-RL02∶2011能力驗(yàn)證規(guī)則、CNASPD21∶2011能力驗(yàn)證工作程序、CNAS-CL03∶2010能力驗(yàn)證計(jì)劃提供者認(rèn)可準(zhǔn)則、ISO/IEC導(dǎo)則43-1∶1997利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的能力驗(yàn)證-能力驗(yàn)證計(jì)劃的建立和運(yùn)作、CNAS-CL04∶2010標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認(rèn)可準(zhǔn)則等規(guī)則為基礎(chǔ)，結(jié)合食源致病微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)樣品均勻性、穩(wěn)定性等關(guān)鍵技術(shù)的研究，旨在建立一個(gè)與國(guó)際規(guī)范接軌、操作性強(qiáng)的食品微生物能力驗(yàn)證關(guān)鍵技術(shù)規(guī)范。

［1］中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).ISO/IEC 17025∶2005檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求 ［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

［2］中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS-GL02∶2014能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南 ［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

［3］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 4789.4—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn) ［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.◇

Study on Uniformity and Stability of Food Micro-organism DNA Proficiency Testing

HOU Dahai1，2，*LIU Yunguo1，3，ZHANG Liang3，XU Yunfeng4，LIU Lingxiao3
（1.College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi，Xinjiang 830046，China；2.Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision，Guangzhou，Guangdong 510330，China 3.Qingzhou Ronmer Biology Technology Co.，Ltd.，Qingzhou，Shandong 262500，China；4.Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266000，China）

Food micro-organism DNA proficiency testing is to determine the testing capacity by inter-laboratory testing results using DNA testing method.This study organized DNA proficiency testing of food micro-organism using genomic DNA of Salmonella as the test objective.The uniformity and stability of food micro-organism DNA samples are studied in order to provide guidance for the operation of DNA proficiency testing.

food micro-organism；DNA proficiency testing；uniformity；stability

R378

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.06.033

1671-9646（2016）06b-0022-03

2016-05-08

新疆大學(xué)自治區(qū)天山學(xué)者科研啟動(dòng)金資金項(xiàng)目（45030）；新疆自治區(qū)高層次人才引進(jìn)工程專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（45049）。

侯大海（1976— ），男，碩士，質(zhì)量工程師，研究方向?yàn)槭称芳庸ぁ?br/>*

劉云國(guó)（1977— ），男，博士，教授級(jí)高級(jí)工程師，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。