劉映玲　鄭艷萍　黃慧芳　鄭　敏　許雙虹　深圳市中醫(yī)院　518033　廣東深圳市福華路1號

·實驗研究·

小兒止咳顆粒對哮喘大鼠氣道炎癥的免疫調(diào)控作用研究

劉映玲鄭艷萍黃慧芳鄭敏許雙虹深圳市中醫(yī)院518033廣東深圳市福華路1號

摘要目的：觀察小兒止咳顆粒對哮喘模型大鼠血清與肺泡灌洗液中白三烯C4（LTC-4）、干擾素-γ （IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）的影響，從而探討其治療咳嗽變異性哮喘的作用機制。方法：36只SD雌性大鼠隨機分為6組：空白對照組，模型組，地塞米松組，小兒止咳顆粒低、中、高劑量組，每組6只。除空白對照組外，余組均采用雞卵白蛋白（OVA）致敏并反復(fù)多次激發(fā)的方法建立大鼠哮喘模型。從腹腔注射OVA氫氧化鋁懸液致敏第15天起行霧化激發(fā)，在霧化激發(fā)前模型組以10 ml/kg生理鹽水灌胃，地塞米松組以0.3 mg/kg地塞米松溶液灌胃，小兒止咳顆粒低、中、高劑量組分別以12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg小兒止咳顆粒溶液灌胃?？瞻讓φ战M以10 ml/kg生理鹽水灌胃。治療結(jié)束后收集血清及肺泡灌洗液（BALF），運用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測各組血清及肺泡灌洗液中LTC-4以及IFN-γ、IL-4、IL-5的含量。結(jié)果：①與空白對照組比較，模型組大鼠體重明顯下降（P＜0.01）；而地塞米松組及小兒止咳顆粒各劑量組大鼠體重均較模型組有顯著提升（P＜0.01）。②與空白對照組比較，模型組大鼠中血清LTC-4水平顯著升高，IFN-γ水平顯著降低（均P＜0.01），而血清IL-4與IL-5無明顯變化；地塞米松與小兒止咳顆粒各劑量均可降低模型大鼠血清中LTC-4水平（P＜0.01），高劑量組改善程度優(yōu)于地塞米松組（P＜0.01）；高劑量組可明顯提升模型大鼠血清中IFN-γ水平，與模型組、地塞米松組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。③與空白對照組比較，模型組大鼠BALF中LTC-4、IL-4與IL-5水平顯著升高（P＜0.01），IFN-γ水平顯著下降（P＜0.01）；地塞米松與小兒止咳顆粒各劑量均可下調(diào)LTC-4、IL-4水平（P＜0.05或P＜0.01），小兒止咳顆粒各劑量組均可上調(diào)模型大鼠BALF中的INF-γ水平（P＜0.01）；地塞米松與小兒止咳顆粒中、高劑量可下調(diào)BALF中IL-5水平（P＜0.01）。結(jié)論：小兒止咳顆粒治療咳嗽變異性哮喘可能是通過下調(diào)炎癥介質(zhì)表達，改善免疫紊亂，從而減輕氣道炎癥而實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞哮喘大鼠；氣道炎癥；免疫調(diào)控；小兒止咳顆粒；中醫(yī)藥療法

咳嗽變異性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA）為學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童常見的呼吸系統(tǒng)疾病，又稱咳嗽型哮喘，是指以慢性咳嗽為主要或唯一臨床表現(xiàn)的一種特殊類型支氣管哮喘，其主要發(fā)病機制與細胞免疫失衡、氣道慢性炎癥形成密切相關(guān)［1-2］。小兒止咳顆粒是我院兒科治療小兒咳嗽變異性哮喘的常用中藥制劑，臨床療效顯著。本實驗通過觀察小兒止咳顆粒對哮喘模型大鼠血清與肺泡灌洗液中炎癥介質(zhì)白三烯C4（LTC-4）以及細胞因子干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）的影響，來探討小兒止咳顆粒對咳嗽變異性哮喘氣道炎癥的免疫調(diào)控作用?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1動物健康SD雌性大鼠36只，體重180～200 g，SPF級，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：0074582。

1.2藥物與試劑小兒止咳顆粒（百部、紫菀、款冬花、桔梗、荊芥、牛蒡子、枳殼、陳皮、茯苓、甘草等），由深圳市中醫(yī)院制劑室制備（粵藥制字011220），每包10 g。地塞米松溶液購自南京森貝伽生物科技有限公司，批號：100016-201216。雞卵白蛋白（OVA）為美國Sigma公司產(chǎn)品，批號：A5503。ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，LTC-4批號：CSBE08534r；IFN-γ批號：CSB-E04579r；IL-4批號：CSB-E04635r；IL-5批號：CSB-E07435r。

1.3動物模型制備36只大鼠隨機分為6組：空白對照組，模型組，地塞米松組，小兒止咳顆粒低、中、高劑量組，每組6只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后參考Palmans等［3］方法，采用OVA致敏并反復(fù)多次激發(fā)的方法建立大鼠哮喘模型。除空白對照組外，其余造模大鼠分別于第1天、第8天腹腔注射新鮮配制的OVA氫氧化鋁懸液，自第15天起將大鼠置于半封閉的有機玻璃箱內(nèi)進行超聲霧化以激發(fā)哮喘，每次吸入1%OVA混懸液，霧化時間為30 min。哮喘激發(fā)每日1次，連續(xù)4周。以大鼠腹肌明顯收縮，呼吸加深加快，急促、咳嗽，嚴重者呈深、慢呼吸或呼吸節(jié)律不整，行動遲滯或俯伏不動等表現(xiàn)為激發(fā)成功，提示造模成功［4］?？瞻讓φ战M以等量生理鹽水代替OVA氫氧化鋁溶液腹腔注射及OVA溶液霧化吸入。

基金項目：深圳市科技創(chuàng)新委員會項目（編號：JCYJ20140408153413103）

1.4給藥方法從腹腔注射OVA氫氧化鋁懸液致敏第15天，霧化激發(fā)開始前2小時給予各組干預(yù)措施。小兒止咳顆粒以生理鹽水溶解，高、中、低劑量組分別以50 g/kg、25 g/kg、12.5 g/kg（以原藥計算）灌胃，灌胃容量為10 ml/kg；地塞米松組以0.3 mg/kg灌胃，灌胃容量為10 ml/kg；空白對照組和模型組以10 ml/kg生理鹽水灌胃。每天1次，共給藥40 d。

1.5標本采集與處理最后一次給藥2 h后，摘除眼球取血，離心取上清液。取血完畢后大鼠行氣管插管至右肺并結(jié)扎，用4℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，每次3 ml，反復(fù)灌洗3次，回收率均大于50%。采用ELISA方法，按試劑盒操作，測定血清及肺泡灌洗液中LTC-4、IFN-γ、IL-4、IL-5水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)檢測重復(fù)3次取均值，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗水平α=0.05。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　實驗結(jié)果

2.1大鼠的一般情況空白對照組大鼠表現(xiàn)活潑好動，飲食如常，動作靈敏，毛色光滑，呼吸平穩(wěn)。模型組大鼠造模后開始出現(xiàn)躁動不安、搔抓、舔肢體、打噴嚏等癥狀，繼而出現(xiàn)不同程度的呼吸困難癥狀，如張口呼吸頻率及幅度增加，嚴重者紫紺，煩躁，同時毛色晦暗無光澤，甚至脫落，提示大鼠哮喘模型制備成功。與模型組比較，小兒止咳顆粒高、中劑量組大鼠癥狀明顯減輕，無呼吸急促，無紫紺，大鼠毛色光澤較好，精神也較好，與地塞米松組癥狀緩解相當。小兒止咳顆粒的低劑量組大鼠與哮喘模型組相比較，癥狀稍有減輕。提示地塞米松與小兒止咳顆粒對哮喘模型大鼠的癥狀均有改善作用。

2.2大鼠的體重變化見表1。

表1干預(yù)前后各組大鼠體重變化情況　　（g±s）

表1干預(yù)前后各組大鼠體重變化情況　?。╣±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與地塞米松組比較，③P＜0.01

組別　　干預(yù)前體重　　干預(yù)后體重　　干預(yù)前后體重差n　　劑量（g/kg）空白對照組　189.5±6.66　289.7±5.09　100.2±5.42模型組　188.8±5.91　248.7±4.76　59.8±6.31①地塞米松組　188.0±5.18　268.0±7.54　80.0±5.22②小兒止咳顆粒低劑量組　188.3±6.80　277.2±5.19　88.8±4.26②③小兒止咳顆粒中劑量組　188.8±6.43　283.8±10.93　95.0±4.82②③66666 --5 0 0.003 12.5 25小兒止咳顆粒高劑量組　189.8±4.36　288.0±8.15　98.2±6.21②③6

表1顯示，40d后模型組大鼠體重明顯下降，顯著低于空白對照組（P＜0.01）。而地塞米松組以及小兒止咳顆粒低、中、高劑量組大鼠干預(yù)后體重增加值均明顯高于模型組（均P＜0.01）；小兒止咳顆粒低、中、高劑量組大鼠體重增長均優(yōu)于地塞米松組（均P＜0.01）。提示了哮喘可導(dǎo)致大鼠體重增加緩慢，而予地塞米松與小兒止咳顆粒治療后可改善這種狀況。

2.3小兒止咳顆粒對哮喘大鼠血清細胞因子的影響見表2。

表2　各組大鼠血清中細胞因子的水平比較　　（pg/ml，±s）

表2　各組大鼠血清中細胞因子的水平比較　?。╬g/ml，±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與地塞米松組比較，③P＜0.01

組別　LTC-4　IFN-γ　IL-4　IL-5空白對照組　1264.32±230.36　182.33±6.60　89.53±7.47　67.70±2.60模型組　2103.79±123.26①　65.05±8.85①　84.48±6.02　73.30±1.96地塞米松組　1632.11±83.54②　59.67±4.29　77.08±6.78　68.40±1.11小兒止咳顆粒低劑量組　1784.48±209.29②　65.78±11.30　79.75±7.13　72.80±3.45小兒止咳顆粒中劑量組　1878.77±97.23②　70.63±10.82　76.24±6.96　68.43±1.94小兒止咳顆粒高劑量組　1086.28±23.91②③　151.83±11.40②③　78.65±6.81　67.53±2.80 n　　劑量（g/kg）6-6 -6　0.003 6　12.5 6　25 6　50

表2顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠的血清LTC-4水平顯著升高（P＜0.01）；而經(jīng)地塞米松以及小兒止咳顆粒低、中、高劑量干預(yù)后，模型大鼠血清LTC-4水平均明顯下降（P＜0.01），其中小兒止咳顆粒高劑量組的下降水平最顯著，與地塞米松組比較有顯著性差異（P＜0.01），接近空白對照組水平（P＞0.05）。造模后模型組的血清IFN-γ水平較空白對照組急劇下降（P＜0.01）；地塞米松及小兒止咳顆粒中、低劑量干預(yù)對模型大鼠血清IFN-γ水平無明顯影響（P＞ 0.05）；而小兒止咳顆粒高劑量組的血清IFN-γ水平顯著高于模型組和地塞米松組（均P＜0.01）。各組間血清IL-4、IL-5水平比較無明顯差異（均P＞0.05）。提示哮喘模型大鼠的血清LTC-4水平顯著升高，IFN-γ水平顯著降低，而血清IL-4與IL-5水平無明顯變化；地塞米松干預(yù)可下調(diào)哮喘大鼠的血清LTC-4水平，但對血清IFN-γ水平無作用；而小兒止咳顆粒既可下調(diào)血清LTC-4水平，又可提升血清IFN-γ水平，作用強度與劑量呈正相關(guān)趨勢。值得注意的是，模型組哮喘大鼠血清IL-4、IL-5水平與空白對照組比較無顯著差異，推測這可能由于哮喘大鼠模型是用OVA先腹腔致敏，然后霧化吸入卵蛋白激發(fā)，其激發(fā)的免疫反應(yīng)主要發(fā)生在肺組織局部，而細胞因子主要由激活的免疫細胞所分泌，在肺外組織炎癥可能并不突出，故而血清中的細胞因子無顯著變化。這也說明了動物哮喘模型與人類哮喘疾病仍存在較大區(qū)別。

2.4小兒止咳顆粒對哮喘大鼠肺泡灌洗液中細胞因子的影響見表3。

表3　各組大鼠BALF中細胞因子的水平比較?。╬g/ml±s）

表3　各組大鼠BALF中細胞因子的水平比較?。╬g/ml±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01；與地塞米松組比較，④P＜0.01

組別　LTC-4　IFN-γ　IL-4　IL-5空白對照組　381.22±65.97　34.19±5.00　23.64±1.86　68.49±4.46模型組　970.45±10.86①　18.19±4.34①　46.62±6.35①　170.45±10.86①地塞米松組　485.08±58.22③　19.48±0.73　38.98±0.45②　115.08±3.54③小兒止咳顆粒低劑量組　856.89±24.14③　33.48±2.62③④　33.32±2.63③④　176.33±6.00小兒止咳顆粒中劑量組　713.00±80.45③　36.74±1.15③④　30.83±0.78③④　132.23±10.01③小兒止咳顆粒高劑量組　349.27±74.52③④　42.57±3.74③④　27.80±2.12③④　89.63±6.01③④n　　劑量（g/kg）6-6-6　0.003 6　12.5 6　25 6　50

表3顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠BALF中LTC-4水平明顯升高（P＜0.01）；而經(jīng)地塞米松以及小兒止咳顆粒低、中、高劑量干預(yù)后則顯著降低（P＜0.01），LTC-4下降幅度與小兒止咳顆粒的劑量呈正相關(guān)趨勢，劑量越大LTC-4水平下降越顯著，其中高劑量組與地塞米松組比較有顯著性差異（P＜0.01），并接近空白對照組水平（P＞0.05）。模型組BALF中IFN-γ水平較空白對照組顯著下降（P＜0.01），但地塞米松對模型大鼠BALF中IFN-γ水平無改善作用（P＞0.05）；小兒止咳顆粒低、中、高各劑量干預(yù)均可明顯升高模型大鼠BALF中的IFN-γ水平（P＜0.01），均顯著優(yōu)于地塞米松組（P＜0.01），并呈劑量依賴趨勢。模型組大鼠BALF中IL-4水平較空白對照組顯著升高（P＜0.01）；經(jīng)地塞米松和小兒止咳顆粒各劑量干預(yù)后則有顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），IL-4下降幅度與劑量呈正相關(guān)趨勢，低、中、高各劑量組均優(yōu)于地塞米松組（P＜0.01）。在IL-5水平方面，模型組IL-5水平明顯高于空白對照組（P＜0.01），經(jīng)地塞米松和小兒止咳顆粒中、高劑量組干預(yù)后下降明顯（均P＜0.01）；其中高劑量組優(yōu)于地塞米松組（P＜0.01）。提示哮喘模型大鼠的BALF中LTC-4、IL-4與 IL-5水平顯著升高，而IFN-γ水平顯著降低；地塞米松干預(yù)可下調(diào)哮喘大鼠 BALF中的LTC-4、IL-4與IL-5水平，但對IFN-γ無作用；而小兒止咳顆粒既可下調(diào)哮喘大鼠BALF中的LTC-4、IL-4與IL-5水平，又可提升IFN-γ水平，作用強度與劑量呈正相關(guān)趨勢。

3　討論

CVA一般情況下無支氣管哮喘常見的喘息、氣促等呼吸困難癥狀，而多以持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的咳嗽為主要表現(xiàn)，但CVA可發(fā)展為典型哮喘。諸多研究證實了CVA與支氣管哮喘有類似的病理生理特征［1-2，5］。支氣管哮喘是一種由多種細胞和細胞因子參與的氣道慢性炎癥［6］。白三烯已經(jīng)被證實是參與哮喘發(fā)病最重要的炎癥介質(zhì)之一，能直接引起支氣管平滑肌強烈收縮，導(dǎo)致炎癥細胞在氣道大量聚集［7］。而白三烯C4（LTC-4）是體內(nèi)白三烯的主要組成部分，參與哮喘發(fā)病過程的多個環(huán)節(jié)［8］。因此，通過LTC-4可推斷氣道炎癥情況。Th1/Th2失衡是支氣管哮喘的重要發(fā)病機制［5，9］。Th1主要介導(dǎo)細胞免疫和炎癥反應(yīng)，通過釋放IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF-β等細胞因子產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抑制哮喘病理過程；Th2主要參與B細胞增殖、抗體產(chǎn)生與速發(fā)型超敏反應(yīng)，分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-13和GM-CSF等細胞因子，影響T細胞分化，參與哮喘的氣道炎癥的形成［10］。由此可見，Th1占優(yōu)勢時，炎癥局限，預(yù)后良好；Th2占優(yōu)勢時，炎癥擴散，預(yù)后不良［11］。在哮喘發(fā)病時，Th1細胞因子免疫反應(yīng)減弱，Th2細胞因子免疫反應(yīng)則異常增強。

CVA可歸屬于中醫(yī)“咳嗽”范疇，其咳嗽癥狀呈陣發(fā)性、忽發(fā)忽止、反復(fù)性發(fā)作、受風(fēng)加劇、多伴咽癢等特點?？紤]到患兒稚陰稚陽之體，我們主張CVA的用藥宜溫潤平和，重在理肺止咳，復(fù)其肅降，略兼疏散風(fēng)邪，因而采用小兒止咳顆粒治療。方中以百部、紫菀為君，兩藥均溫潤，不寒不熱，藥性溫和，符合小兒稚陰稚陽的體質(zhì)特點，有較好的止咳化痰功效，為常用止咳藥物；款冬花化痰降氣止咳，桔梗宣肺利咽化痰，二者一宣一降，以正肺氣，增強化痰止咳之功，為臣藥；荊芥疏風(fēng)解表利咽，牛蒡子疏風(fēng)宣肺利咽，枳殼降氣，陳皮理氣化痰，茯苓滲濕健脾以絕痰之化源，均為佐藥；甘草緩急和中，調(diào)和諸藥，又合桔梗利咽，為佐使之用。全方共奏化痰止咳、疏風(fēng)利咽之效。經(jīng)我院臨床應(yīng)用多年，療效顯著。

本實驗研究結(jié)果提示：小兒止咳顆粒可顯著下調(diào)哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液（BALF）中LTC-4的表達，從而直接減輕氣道炎癥；顯著上調(diào)血清和肺泡灌洗液（BALF）中Th1型細胞因子IFN-γ的表達，同時下調(diào)BALF中的Th2型細胞因子IL-4和IL-5的表達，從而改善Th1/Th2失衡狀態(tài)；其作用強度與劑量呈正相關(guān)趨勢。提示小兒止咳顆粒治療咳嗽變異性哮喘的作用可能是通過下調(diào)炎癥介質(zhì)表達，改善免疫紊亂，從而減輕氣道炎癥等機制實現(xiàn)的。

參考文獻

［1］胡儀吉.咳嗽變異型哮喘的治療［J］.實用兒科臨床雜志，2009，18（10）: 778.

［2］Takemura M，Niimi A，Matsumoto H，et al.Clinical，physiological and anti-inflammatoryeffectofmontelukast in patients with cough variant asthma［J］.Respiration，2011，83（4）: 308-315.

［3］Palmans E，Kips J C，Pauwels R A，et al.Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats［J］.Am J Respir Crit Care Med，2000，161（21）:627-635．

［4］蔡黎，畢小利，王憶勤，等．咳嗽變異性哮喘豚鼠模型的構(gòu)建［J］．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，38（12）:1070－1073．

［5］Lloyd C M，Hawrylowicz C M.Regulatory T cells in asthma［J］.Immunity，2009，31（3）:438-449.

［6］張川林，陳志斌，李希.厚樸麻黃湯對哮喘大鼠氣道炎癥的影響［J］.廣西中醫(yī)藥，2016，39（1）：66-68.

［7］Samitas K，Chorianopoulos D，Vittorakis S，et al.Exhaled cysteinylleukotrienes and 8-isoprostane in patients with asthma and their relation to clinical severity［J］.Rsepir Med，2009，103（5）:750-756.

［8］劉玉春，徐繼慶，董惠翔.哮喘患者外周血白三烯C4水平的臨床意義［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，6（6）: 76-77.

［9］李學(xué)良，許朝霞.支氣管哮喘發(fā)病機制的研究進展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（9）:1960-1963.

［10］鄧禎，譚玉萍，李瑞祥，等.銀杏葉提取物治療哮喘的基礎(chǔ)研究進展［J］.廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，18 （4）：71-74.

［11］Kim H B，Jin H S，Lee S Y，et al. The effect of rush immunotherapy with house dust mite in the production of IL-5 and IFN-gamma from the peripheral blood T cells of asthmatic children［J］.J Korean Med Sci，2009，24（3）:392-397.

（2016-03-03收稿/編輯陳明偉）

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1003-0719（2016）03-0067-04