吳春濤，苑威，劉鐵楠，張晉冀，李長(zhǎng)仔，胡寶山

蝦青素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤放療敏感性的影響

吳春濤1，苑威2，劉鐵楠3，張晉冀1，李長(zhǎng)仔1，胡寶山1

摘要：目的探討蝦青素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤放射治療敏感性的影響。方法20只BALB/c Nude裸鼠隨機(jī)均分為4組：對(duì)照組（小鼠灌胃10%DMSO的超純水），蝦青素組（小鼠灌胃10%DMSO的蝦青素懸液，劑量為50 mg/kg，每隔1 d給藥1次，共給藥7次），照射組（小鼠灌胃10%DMSO的超純水，腫瘤生長(zhǎng)部位使用加速器局部照射，5 Gy/次，總劑量15 Gy）及聯(lián)合組（同時(shí)進(jìn)行蝦青素灌胃和局部照射處理）。腫瘤最短直徑達(dá)到5 mm以上開始實(shí)驗(yàn)，每隔1 d測(cè)量移植瘤長(zhǎng)短直徑計(jì)算腫瘤體積并繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線，末次給藥后第2天處死小鼠，取腫瘤塊稱質(zhì)量并將其制成石蠟切片。免疫組化方法檢測(cè)石蠟切片內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖抗原Ki-67、磷酸化STAT3（p-STAT3）表達(dá)及細(xì)胞凋亡（Tunnel染色）情況。結(jié)果與對(duì)照組比較，蝦青素組、照射組及聯(lián)合組瘤體生長(zhǎng)速度減慢（P<0.05），以聯(lián)合組瘤體生長(zhǎng)速度最慢。對(duì)照組、蝦青素組、照射組和聯(lián)合組瘤體質(zhì)量、Ki-67、p-STAT3表達(dá)水平均依次降低，抑瘤率、細(xì)胞凋亡率均依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論蝦青素能夠通過(guò)抑制p-STAT3表達(dá)增加肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的放療敏感性。

關(guān)鍵詞：肺腫瘤；癌；輻射耐受性；放射療法；小鼠,裸；蝦青素；肺癌A549細(xì)胞

基金項(xiàng)目：中國(guó)煤炭工業(yè)協(xié)會(huì)指導(dǎo)性課題（MTKJ2014-286）

作者單位：1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科（郵編063000），2藥學(xué)部，3心內(nèi)科

作者簡(jiǎn)介：吳春濤（1976），男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主要從事腫瘤治療學(xué)方面的研究

肺癌是一類高發(fā)病率腫瘤，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第1位［1］。在肺癌的治療過(guò)程中，放射治療是一種重要的治療方法，不同分型的肺癌對(duì)放射治療的敏感性存在差異。蝦青素是一種天然的類胡蘿卜素，廣泛的存在于自然界中，有研究顯示其具有抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防癌癥、增強(qiáng)免疫力、改善視力等作用［2-3］。研究表明，蝦青素能夠通過(guò)阻斷酪氨酸激酶1（Janus activedkinase，JAK1）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（Signal transducers and activators of transcription，STAT3）通路來(lái)抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。此外，蝦青素能夠通過(guò)作用于JAK/STAT3信號(hào)通路來(lái)抑制口腔癌及克隆性結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡［4-5］，提示蝦青素能夠通過(guò)影響STAT3表達(dá)發(fā)揮體外抗腫瘤作用。STAT3是一種轉(zhuǎn)錄活化因子，通過(guò)與細(xì)胞中多種功能調(diào)節(jié)蛋白相互結(jié)合在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究顯示應(yīng)用STAT3抑制劑能夠增加包括非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞在內(nèi)的多種肺癌細(xì)胞的放療敏感性［6-7］，而具有抑制STAT3表達(dá)且不良反應(yīng)低的蝦青素是否能夠增加A549細(xì)胞放療敏感性尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立裸鼠移植瘤模型，從動(dòng)物水平觀察蝦青素對(duì)裸鼠肺癌A549細(xì)胞移植瘤放射治療的協(xié)同作用，為肺癌的臨床治療提供理論支持及實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器肺癌A549細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究所；蝦青素購(gòu)自日本Santa Cruz公司，每10 mg粉末溶解于100 μL DMSO后加入超純水配置濃度為10 g/L的蝦青素懸液備用；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；Ki-67抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，Tunnel檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司；磷酸化STAT3（p-STAT3）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB/c Nude裸鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)條件為RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)加入10%胎牛血清和青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L，細(xì)胞培養(yǎng)于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行裸鼠接種實(shí)驗(yàn)。

1.4裸鼠移植瘤模型建立選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，使用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞懸液到15 mL離心管內(nèi)，以離心半徑25 cm，1 500 r/min，離心5 min。棄上清后加入200 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)占95%以上。調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×107/mL，于裸鼠左前腋下及右前腋下接種，每只小鼠接種100 μL細(xì)胞懸液，共接種5只小鼠，接種1周左右開始形成腫瘤，3只小鼠腫瘤接種成功。接種后1個(gè)月將形成腫瘤的小鼠處死，取出腫瘤組織，去除包膜用剪刀剪成約100 mm3大小的瘤塊，用穿刺針將瘤塊接種至新的25只裸鼠左前腋下，待腫瘤最短直徑＞5 mm后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本次造模22只裸鼠腫瘤接種成功，取20只腫瘤組織大小均勻的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5實(shí)驗(yàn)分組20只BALB/c裸鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法均分為4組（n=5）。對(duì)照組，灌胃10%DMSO的超純水；蝦青素組，灌胃蝦青素懸液，給藥劑量為50 mg/kg，每隔1 d給藥1次，共7次；照射組，每只小鼠灌胃含10%DMSO的超純水，同時(shí)用直線加速器進(jìn)行局部照射腫瘤，每次照射劑量為5 Gy，每隔3 d照射1次，照射總劑量為15 Gy；聯(lián)合組，同時(shí)給予蝦青素組和照射組的處理方法。

1.6移植瘤生長(zhǎng)情況每隔1天測(cè)量移植瘤裸鼠體質(zhì)量，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)直徑（a）及最短直徑（b），按照公式V= a×b2/2計(jì)算移植瘤體積并繪制生長(zhǎng)曲線。給藥結(jié)束后第2天脫臼處死小鼠，分離瘤塊，稱質(zhì)量后計(jì)算抑瘤率=（對(duì)照組瘤質(zhì)量-處理組瘤質(zhì)量）/對(duì)照組瘤質(zhì)量。

1.7免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ki-67、p-STAT3表達(dá)水平及肺癌細(xì)胞凋亡率將獲取的腫瘤組織迅速放入4%中性甲醛內(nèi)，固定24 h以上做脫水、浸蠟處理后進(jìn)行瘤塊石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。增殖細(xì)胞表面抗原Ki-67及p-STAT3抗體染色步驟如下：常規(guī)脫蠟水化處理后進(jìn)行抗原修復(fù)、內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶滅活，抗原封閉后，分別加入Ki-67抗體（1∶800）和p-STAT3抗體（1∶500），4℃隔夜孵育，洗去多余未結(jié)合的抗體，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色后進(jìn)行常規(guī)水化透明步驟，加入封片劑封片后顯微鏡下觀察結(jié)果。細(xì)胞凋亡采用Tunnel染色參照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行，染色結(jié)束后進(jìn)行水化透明封片處理后觀察結(jié)果。任意讀取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)鏡下100個(gè)細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率即細(xì)胞凋亡率。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1蝦青素對(duì)裸鼠移植瘤放療后瘤體生長(zhǎng)速度的影響未做任何處理的對(duì)照組瘤體生長(zhǎng)速度很快，與對(duì)照組比較，蝦青素組、照射組及聯(lián)合組瘤體生長(zhǎng)速度減慢，以聯(lián)合組瘤體生長(zhǎng)速度最慢，經(jīng)放療和蝦青素同時(shí)處理后的聯(lián)合組瘤體幾乎未增長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

2.2蝦青素對(duì)裸鼠移植瘤放療后瘤體質(zhì)量的影響對(duì)照組、蝦青素組、照射組和聯(lián)合組瘤體質(zhì)量依次降低，抑瘤率依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

Fig.1　Astaxanthin slowed down the growth rates of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy圖1　蝦青素降低裸鼠移植瘤的放療后瘤體生長(zhǎng)速度

Tab.1　Astaxanthin decreased weight of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表1　蝦青素降低裸鼠移植瘤的放療后瘤體質(zhì)量（n=5，±s）

Tab.1　Astaxanthin decreased weight of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表1　蝦青素降低裸鼠移植瘤的放療后瘤體質(zhì)量（n=5，±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與蝦青素組比較，c與照射組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組蝦青素組照射組聯(lián)合組F瘤體質(zhì)量（g）1.53±0.07 1.29±0.10a0.82±0.09ab0.29±0.03abc48.435＊抑瘤率（%）-15.7±7.0 46.1±6.6b81.0±1.9bc126.400＊

2.3蝦青素對(duì)裸鼠移植瘤放療后癌細(xì)胞凋亡及p-STAT3表達(dá)的影響對(duì)照組、蝦青素組、照射組和聯(lián)合組Ki-67、p-STAT3表達(dá)水平均依次降低，細(xì)胞凋亡率依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2、圖2。

Tab.2　Effects of astaxanthin on expressions of Ki-67 and p-STAT3，and apoptotic rates of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表2　蝦青素對(duì)裸鼠移植瘤放療后Ki-67、p-STAT3表達(dá)及細(xì)胞凋亡率的影響　?。╪=5，%±s）

Tab.2　Effects of astaxanthin on expressions of Ki-67 and p-STAT3，and apoptotic rates of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表2　蝦青素對(duì)裸鼠移植瘤放療后Ki-67、p-STAT3表達(dá)及細(xì)胞凋亡率的影響　?。╪=5，%±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與蝦青素組比較，c與照射組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組蝦青素組照射組聯(lián)合組F Ki-67 74.2±5.2 65.0±3.8a49.0±5.0ab35.2±4.1abc70.600＊p-STAT3 40.4±7.2 33.0±3.8a25.4±5.4ab5.0±2.2abc46.008＊細(xì)胞凋亡率0 13.2±4.4a51.4±7.9ab80.4±6.2abc221.166＊

Fig.2　Staining image of Ki-67，p-STAT3 in transplanted tumor after radiotherapy圖2　各組Ki-67、p-STAT3表達(dá)及Tunnel染色結(jié)果（Ki-67，×100；Tunnel，×400；p-STAT3，×100）

3　討論

放射治療是利用放射線包括X射線、電子線、中子束、質(zhì)子束及其他粒子束等治療惡性腫瘤的一種重要方法，但是許多惡性腫瘤在放療后出現(xiàn)了不同程度的輻射耐受。非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌的5年生存率分別為16%和6%，臨床治療肺癌預(yù)后差的主要原因是肺癌容易出現(xiàn)放療和化療的耐受性［7］，因此，如何提高肺癌的放療敏感性至關(guān)重要。有研究報(bào)道，腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的耐受性及敏感性與STAT3的激活有關(guān)，抑制STAT3信號(hào)通路能夠降低胰腺癌［8］、乳腺癌［9］、肺癌［6-7］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［10］等多種腫瘤細(xì)胞的輻射耐受性，STAT3在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞輻射耐受過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究顯示氯硝柳胺和CK2抑制劑能夠通過(guò)抑制STAT3增加肺癌細(xì)胞的放療及化療敏感性，但是以上研究只限于體外肺癌細(xì)胞的研究，而無(wú)裸鼠移植瘤模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［6-7］。蝦青素能夠通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路發(fā)揮體外抗腫瘤作用，而其是否具有增加肺癌放療敏感性的作用尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)迅速，蝦青素組移植瘤體積及質(zhì)量均低于對(duì)照組，但是抑瘤率低于30%，未達(dá)到《現(xiàn)代腫瘤治療藥物學(xué)》中抗腫瘤藥物有效標(biāo)準(zhǔn)［11］，提示單純應(yīng)用蝦青素進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤作用并不理想，這與既往報(bào)道的蝦青素能夠體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)果并不一致［5］，提示蝦青素的抗腫瘤作用可能存在組織器官的差異性。本研究中聯(lián)合組瘤體幾乎未增長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束之時(shí)無(wú)論是腫瘤體積還是腫瘤質(zhì)量都遠(yuǎn)低于其他3組，說(shuō)明在放療同時(shí)給予裸鼠蝦青素干預(yù)能夠有效抑制肺癌生長(zhǎng)。

Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，可以通過(guò)對(duì)Ki-67檢測(cè)判斷腫瘤細(xì)胞的增殖活性，腫瘤細(xì)胞增殖旺盛則Ki-67表達(dá)水平高。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，蝦青素組、照射組及聯(lián)合組Ki-67表達(dá)水平不同程度下調(diào)，以聯(lián)合組Ki-67表達(dá)水平最低，提示放療同時(shí)給予蝦青素干預(yù)能夠有效降低腫瘤細(xì)胞增殖。脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，Tunnel）技術(shù)是目前原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡最敏感、快速、特異的方法。本研究采用Tunnel技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞幾乎沒(méi)有凋亡發(fā)生，蝦青素組、照射組及聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，以聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率最高，說(shuō)明放療同時(shí)給予蝦青素能夠增加腫瘤細(xì)胞凋亡。

為驗(yàn)證蝦青素是否通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路來(lái)增加肺癌放療敏感性，本研究對(duì)腫瘤組織活化狀態(tài)的STAT3——p-STAT3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，p-STAT3在對(duì)照組中表達(dá)水平較高，蝦青素組、照射組及聯(lián)合組p-STAT3表達(dá)均較對(duì)照組降低，以聯(lián)合組p-STAT3表達(dá)水平最低，提示蝦青素可能通過(guò)下調(diào)p-STAT3表達(dá)起到增加放療敏感性的作用，與之前多項(xiàng)研究結(jié)果一致［6-7］。

綜上所述，蝦青素能夠通過(guò)調(diào)控p-STAT3表達(dá)水平來(lái)增加肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤放療敏感性，下一步需要深入研究蝦青素對(duì)p-STAT3上游及下游信號(hào)分子的調(diào)控作用。

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（2015-11-25收稿2016-03-22修回）

（本文編輯陳麗潔）

中圖分類號(hào)：R730.52，R730.55

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150340

Astaxanthin enhanced radiotherapy sensitivity of human lung cancer A549 cells transplanted in nude mice

WU Chuntao1,YUAN Wei2,LIU Tienan3,ZHANG Jinji1,LI Changzai1,HU Baoshan1
1 Department of Oncological Surgery,2 Department of Pharmaceutical,3 Department of Cardiology,North China University of Science and Technology Affiliated Hospital,Tangshan 063000,China

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of astaxanthin on radiotherapy sensitivity of lung cancer A549 cells transplanted in nude mice.MethodsTwenty BALB/c nude mice were divided into four groups:control group(mice were gavaged with pure water containing with 10%DMSO),astaxanthin group(mice were gavaged with astaxanthin suspension containing with 10%DMSO,astaxanthin was given to mice with the dose of 50 mg/kg on the first day,and every other day in the following days with a total of 7 times),radiotherapy group(mice were gavaged with pure water containing with 10% DMSO,the tumor site was given local radiotherapy with a dose of 5 Gy per time and the total dose was 15 Gy)and combination group(mice were given 50 mg/kg astaxanthin and radiotherapy with 15 Gy total irradiated dose).When the minor axis of the tumor reached 5 mm we began experiment.Tumor growth curve was measured by detecting the line of apsides every other day.Mice were killed on the second day after the last time of astaxanthin administration.Weights of tumor were measured by a balance and then tumor mass was processed into paraffin sections.Expressions of proliferating tumor cell antigen Ki-67,phosphorylated-signal transducers and activators of transcription(p-STAT3),and cell apoptosis (measured by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling,Tunnel)were detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with control group,the transplanted tumor growth rate slowed down in other three groups(P<0.05),and tumor growth was the most slowly in the combination group.Tumor weight,Ki-67 and p-STAT3 expressions were decreased gradually in turn in control group,astaxanthin group,radiotherapy group and combination group. The anti-tumor rate and percentage of cell apoptosis were increased gradually in turn.There was significant difference between groups by multiple comparison statistics(P<0.05).ConclusionAstaxanthin enhances radiotherapy sensitivity of human lung cancer A549 cells in nude mice by down-regulating the expression of p-STAT3.

Key words:lung neoplasms;carcinoma;radiation tolerance;radiotherapy;mice,nude;Astaxanthin;lung cancer A549 cell