王少清，毛楠，周萍，汪力△，高芳，衛(wèi)怡勛，樊均明，付平

利拉魯肽對(duì)2型糖尿病大鼠降血壓、利水鹽的作用機(jī)制探討

王少清1，毛楠1，周萍1，汪力1△，高芳1，衛(wèi)怡勛1，樊均明2，付平3

摘要：目的通過觀察胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物利拉魯肽對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟內(nèi)髓一氧化氮合酶（NOS）、環(huán)加氧酶2（COX2）表達(dá)的影響，探討利拉魯肽降血壓和利水鹽的作用機(jī)制。方法30只雄性SD大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，自由攝水，8周后空腹注射鏈脲佐菌素（STZ），成功建立2型糖尿病大鼠模型18只，選取12只隨機(jī)分為利拉魯肽處理2型糖尿病模型（DMT）組和2型糖尿病模型（DM）組，另取12只正常大鼠隨機(jī)分為利拉魯肽處理野生型大鼠（WTT）組和野生型大鼠對(duì)照（WT）組，每組6只。DMT和WTT組每天予以利拉魯肽（200 μg/kg體質(zhì)量）皮下注射，DM和WT組每天予以等量生理鹽水皮下注射，各組分別在給藥后0、2、4、6周檢測(cè)血糖和血壓，給藥后6周收集尿液檢測(cè)K、Na、Cl離子濃度，然后處死大鼠，收集血液檢測(cè)血K、Na、Cl離子濃度，取腎組織通過Real-time PCR和Western blot檢測(cè)腎臟內(nèi)髓NOS和COX2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果利拉魯肽干預(yù)后，DMT組大鼠血糖（F=5.933，P<0.05）及血壓（F=22.070，P<0.05）隨時(shí)間變化逐漸降低。在干預(yù)6周后，DMT組大鼠血糖（mmol/ L：12.78±3.82 vs.18.75±1.68）和血壓（mmHg：119.98±4.43 vs.136.42±4.48）較DM組均明顯降低（P<0.05），血液中K、Na、Cl離子濃度與DM組相比無明顯差異，但尿液中K（mmol/L：46.55±6.43 vs.33.13±9.71）、Na（mmol/L：56.33±8.83 vs.41.20±7.25）、Cl（mmol/L：159.81±25.06 vs.71.44±12.99）離子濃度高于DM組大鼠（P<0.05），且腎臟內(nèi)髓NOS、COX2的mRNA和蛋白表達(dá)均高于DM組大鼠（P<0.05）。結(jié)論利拉魯肽可能通過NOS誘導(dǎo)COX2的表達(dá)增強(qiáng)，發(fā)揮利水鹽、降血壓的作用。

關(guān)鍵詞：胰高血糖素樣肽-1；利拉魯肽；腎臟內(nèi)髓；糖尿病，2型；一氧化氮合酶；環(huán)加氧酶2

基金項(xiàng)目：四川省教育廳2013年科研資助重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZA0213）；四川省衛(wèi)生廳2013年科研資助項(xiàng)目（130386）；成都醫(yī)學(xué)院駝鳥計(jì)劃2012年專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（CYX12-024）；2014校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（CXXS201422）

作者單位：1成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病科（郵編610500）；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院腎臟內(nèi)科；3四川大學(xué)華西醫(yī)院腎臟內(nèi)科

作者簡(jiǎn)介：王少清（1976），男，副主任醫(yī)師，副教授，博士，主要從事慢性病腎損害機(jī)制及干預(yù)研究

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通訊作者E-mail：93331524@qq.com

胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）由胃腸道內(nèi)的L細(xì)胞分泌，是一種重要的腸促胰島素，其類似物是目前臨床上治療2型糖尿病的一類新藥。研究證實(shí)，GLP-1除了具有降血糖、降體質(zhì)量的作用外，還具有降脂、降血壓和調(diào)節(jié)水鹽代謝等心腎保護(hù)功能［1-3］，但具體作用機(jī)制尚不明確。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1擴(kuò)張血管的作用與一氧化氮（NO）有關(guān)［4-6］。腎臟內(nèi)髓作為腎臟重要的功能區(qū)域，其間質(zhì)壓力可調(diào)節(jié)腎小管水、鈉重吸收，是腎臟產(chǎn)生壓力性利尿的基礎(chǔ)，也是參與系統(tǒng)血壓調(diào)節(jié)的重要機(jī)制［7］。腎臟內(nèi)髓的環(huán)加氧酶2（COX2）與水鹽代謝和血壓調(diào)節(jié)有關(guān)，NO參與了其調(diào)節(jié)過程［8-10］。因此，筆者推測(cè)GLP-1可能通過一氧化氮合酶（NOS）而誘導(dǎo)COX2表達(dá)，發(fā)揮調(diào)節(jié)水鹽和降血壓的作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)GLP-1類似物利拉魯肽對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟內(nèi)髓NOS和COX2表達(dá)的影響，探討利拉魯肽調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠腎臟水鹽和降血壓的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（230±20）g，購于成都達(dá)碩生物科技有限公司，自由攝食攝水，除實(shí)驗(yàn)應(yīng)激外無其他不良刺激。高糖高脂飼料（10%豬油，20%糖，10%蛋白粉，1%膽固醇，59%基礎(chǔ)飼料）由重慶騰鑫生物科技有限公司生產(chǎn)。鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma；利拉魯肽，丹麥諾和諾德公司；NOS和COX2抗體，Bioworld公司。無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量系統(tǒng)購于安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.12型糖尿病大鼠模型的建立30只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，自由攝水。8周后，空腹注射STZ（溶于0.1 mmol/L的檸檬酸緩沖液，pH 4.4，注射劑量：35 mg/kg），5 d后檢測(cè)空腹血糖，共18只大鼠血糖值≥16.7 mmol/L，確定2型糖尿病大鼠造模成功。

1.2.2動(dòng)物分組及藥物處理取12只2型糖尿病大鼠，隨機(jī)分為2組：利拉魯肽處理2型糖尿病模型（DMT）組和2型糖尿病模型（DM）組，另取正常大鼠12只，隨機(jī)分為利拉魯肽處理野生型大鼠（WTT）組和野生型對(duì)照（WT）組，每組6只。DMT組和WTT組每天皮下注射利拉魯肽（200 μg/kg），DM組和WT組每天皮下注射等量生理鹽水。

1.2.3數(shù)據(jù)與標(biāo)本采集藥物處理的0、2、4、6周，分別測(cè)量各組大鼠的血糖和血壓。第6周時(shí)采集24 h尿液樣本后處死大鼠，并取血液及腎臟組織標(biāo)本，血液和尿液樣本用日立7170A全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)K、Na、Cl離子濃度，腎組織標(biāo)本凍存于液氮中以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4大鼠血糖及血壓檢測(cè)血糖檢測(cè)：采用強(qiáng)生全自動(dòng)血糖儀檢測(cè)。血壓檢測(cè)：將大鼠置于固定器內(nèi)5 min，同時(shí)加熱大鼠尾部，待其安靜后將感應(yīng)器放入加壓氣囊內(nèi)并套在大鼠尾巴接近尾根的1/3處，并調(diào)整感應(yīng)器位置直至獲得穩(wěn)定清晰的脈搏圖像，向加壓氣囊內(nèi)施加壓力，觀察并記錄加壓后出現(xiàn)的第1個(gè)波峰所處的血壓值。

1.2.5Real-time PCR檢測(cè)NOS和COX2的mRNA水平引物由上海生物工程有限公司合成。NOS引物序列：上游5′-GACCGATTACACGACATTGAG-3′，下游5′-TCTTAGGGCT?GCCAGGAT-3′，產(chǎn)物大小178 bp；COX2引物序列：上游5′-ACGGACTTGCTCACTTTG-3′，下游 5′-AGCGTTTGCGG?TACTCAT-3′，產(chǎn)物大小159 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5′-TCCCTCAAGATrGTCAGCAA-3′，下游5′-AGATCCA?CAACCGGATACATF-3′，產(chǎn)物大小308 bp。按照標(biāo)準(zhǔn)方法提取總mRNA，實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)和熔解曲線分析，計(jì)算NOS和COX2的mRNA水平。

1.2.6Western blot檢測(cè)NOS和COX2的蛋白表達(dá)水平取大鼠腎臟髓質(zhì)加入RIPA裂解液，4℃下勻漿提取總蛋白，BCA法測(cè)濃度，每孔蛋白上樣總量為20 μg，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后濕轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，Gel-Pro analyzer 4.0軟件對(duì)得到的圖像進(jìn)行條帶灰度分析，計(jì)算目的蛋白NOS、COX2與內(nèi)參GAPDH的灰度比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，行方差齊性檢驗(yàn)及重復(fù)測(cè)量資料F檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1利拉魯肽處理對(duì)血糖及血壓的影響DMT組在給予利拉魯肽處理0～6周時(shí)，血糖逐漸下降（F= 5.933，P<0.05），處理6周后的血糖明顯低于0周（P<0.05）；而DM、WTT和WT組的血糖沒有隨時(shí)間變化而發(fā)生明顯變化（F分別為2.969、0.880、1.963，P>0.05）。相同時(shí)間點(diǎn)不同組間的血糖比較，6周時(shí)，4組的血糖差異明顯（F=28.143，P< 0.05），其中DM組高于其他3組（P<0.05），見圖1。血壓的變化趨勢(shì)與血糖基本一致，即利拉魯肽處理DMT組0～6周時(shí)，血壓出現(xiàn)逐漸下降（F=22.070，P<0.05），處理4周和6周后的血壓明顯低于0周（P<0.05）；而DM、WTT和WT組則在處理0～6周時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)間的差異不明顯（F分別為2.934、0.358、0.370，P>0.05）。相同時(shí)間點(diǎn)不同組間的血壓比較，6周時(shí)，4組的血壓差異明顯（F=39.252，P< 0.05），其中DM組高于其他3組（P<0.05），見圖2。

a與DMT組0周時(shí)比較，b與DM組6周時(shí)比較，P<0.05Fig.1　Changes of blood glucose levels after treating with liraglutide for 0-6 weeks圖1　利拉魯肽處理不同時(shí)間后對(duì)血糖的影響

a與DMT組0周時(shí)比較，b與 DM組 6周時(shí)比較，P<0.05；1 mmHg=0.133 kPaFig.2　Changes of blood pressure levels after treating with liraglutide for 0-6 weeks圖2　利拉魯肽處理不同時(shí)間后對(duì)血壓的影響

2.2利拉魯肽處理后對(duì)血液和尿液離子濃度的影響各組血液中的K、Na、Cl離子濃度并差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為1.786、3.609、2.113，P>0.05），見圖3；而尿液中的K、Na、Cl離子濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為 19.323、31.561、158.174，P< 0.05），DMT組高于DM組（P<0.05），其他3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖4。

2.3利拉魯肽處理后對(duì)NOS和COX2 mRNA表達(dá)變化利拉魯肽處理6周后，各組大鼠腎臟內(nèi)髓NOS和COX2的mRNA水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為128.659、255.644，P<0.05），其中DMT組高于DM組（P<0.05），其他3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

Fig.3　Changes of the blood concentrations of ion after treating with liraglutide for 6 weeks圖3　利拉魯肽處理6周后對(duì)血液離子濃度的影響

a與DM組比較，P<0.05Fig.4　Changes of the urine concentrations of ion after treating with liraglutide for 6 weeks圖4　利拉魯肽處理6周后對(duì)尿液離子濃度的影響

a與DM組比較，P<0.05Fig.5　Changes of the mRNA expressions of NOS and COS2 after treating with liraglutide for 6 weeks圖5 利拉魯肽處理6周后NOS和COX2的mRNA表達(dá)情況

2.4利拉魯肽處理后NOS和COX2的蛋白表達(dá)變化利拉魯肽處理6周后，各組NOS和COX2蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為71.587、153.176，P<0.05），DM組NOS表達(dá)量明顯低于其他3組（P<0.05），DM組COX2表達(dá)量明顯低于DMT和WTT組（P<0.05），但與WT組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖6。

3　討論

GLP-1降血壓和調(diào)節(jié)水鹽代謝的機(jī)制目前仍不明確。有報(bào)道表明，GLP-1通過G蛋白偶聯(lián)受體GLP-1受體（GLP-1R）發(fā)揮功效，如在2型糖尿病和冠狀動(dòng)脈疾病的患者中，激活GLP-1R會(huì)使冠狀動(dòng)脈舒張，同時(shí)GLP-1R拮抗劑能完全拮抗GLP-1的作用［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)嚙齒類動(dòng)物中GLP-1呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性擴(kuò)張肺動(dòng)脈，是因?yàn)閮?nèi)皮系統(tǒng)合成NO的緣故［5］，且GLP-1通過NO/cGMP通路發(fā)揮擴(kuò)血管作用，并不依賴于相應(yīng)的GLP-1R［6］。值得注意的是，鹽負(fù)荷時(shí)腎臟內(nèi)髓NOS的表達(dá)增高［8］，且誘導(dǎo)腎臟內(nèi)髓COX2的表達(dá)，NOS阻滯劑則抑制COX2的表達(dá)［9］。給予高鹽飲食后，其腎臟內(nèi)髓COX2表達(dá)顯著升高［10］，而在腎臟內(nèi)髓注射COX2抑制劑后，接受高鹽飲食的大鼠血壓升高［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可能通過調(diào)節(jié)NOS，誘導(dǎo)COX2表達(dá)來發(fā)揮調(diào)節(jié)水鹽和降血壓的作用。本研究使用利拉魯肽對(duì)2型糖尿病大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示利拉魯肽具有明顯的降血糖和降血壓作用，尤其是尿液中的K、Na、Cl離子濃度均顯著高于DM組，而血液中的K、Na、Cl離子濃度并無明顯差異，提示利拉魯肽可能促進(jìn)了2型糖尿病大鼠腎臟的水鹽代謝，調(diào)節(jié)了由于高血糖導(dǎo)致的滲透壓升高，起到對(duì)腎臟的保護(hù)作用。筆者先前的研究還發(fā)現(xiàn)GLP-1可降低糖尿病伴高血壓患者的血壓和血壓變異性，尤其是白晝收縮壓、24 h收縮壓變異性、白晝收縮壓變異性等指標(biāo)［3］。GLP-1通過增加大鼠尿鈉等離子排泄，減輕體內(nèi)鈉潴留以降低血壓，這一機(jī)制或許也是GLP-1降低血壓變異性的生理基礎(chǔ)。

正常腎臟中COX2主要表達(dá)在腎臟髓質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞（renal medullary interstitial cells，RMICs）中，少部分表達(dá)于皮質(zhì)致密斑［12］。RMICs沿著髓質(zhì)血管和腎小管構(gòu)成特殊的梯度結(jié)構(gòu)，并與直小血管和腎小管的基底膜相毗鄰，通過旁分泌作用產(chǎn)生某些介質(zhì)直接影響髓質(zhì)血流量和腎小管轉(zhuǎn)運(yùn)功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)腎小管水、鈉重吸收［7］。因此，位于RMICs中的COX2極有可能催化產(chǎn)生某些前列腺素，通過旁分泌作用影響髓質(zhì)血流量和腎小管轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而參與水鹽代謝和血壓的調(diào)節(jié)。如前所述，COX2在腎臟內(nèi)髓的表達(dá)與NOS誘導(dǎo)調(diào)控有關(guān)。NO是一種重要的血管擴(kuò)張因子，由3種類型的NO合成酶合成：內(nèi)皮型NOS （eNOS），神經(jīng)型NOS（nNOS）和誘導(dǎo)NOS（iNOS）。有研究報(bào)道，GLP-1通過NO發(fā)揮血管擴(kuò)張功能［5］。因此，筆者推測(cè)NOS通過誘導(dǎo)髓內(nèi)COX2表達(dá)，促進(jìn)水鈉排泄而降低腎臟內(nèi)髓滲透壓，以發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。本實(shí)驗(yàn)中利DMT組中NOS和COX2的表達(dá)均明顯高于DM組，提示糖尿病患者長期血糖濃度升高，腎臟內(nèi)髓滲透壓隨之升高，腎臟NOS和COX2表達(dá)降低，使用GLP-1類似物利拉魯肽可有效提高內(nèi)髓NOS和COX2的表達(dá)，加強(qiáng)腎臟利水鈉作用。

綜上所述，GLP-1類似物利拉魯肽可能通過促進(jìn)2型糖尿病大鼠腎臟內(nèi)髓NOS和COX2的表達(dá)來調(diào)節(jié)滲透壓，進(jìn)而產(chǎn)生降壓和利水鹽作用，今后的研究有必要對(duì)其進(jìn)一步的分子機(jī)制深入探討，為GLP-1類似物的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

A：Western blot結(jié)果；B：蛋白相對(duì)定量；a與DM組比較，P<0.05Fig.6　Changes of the protein expressions of NOS and COS2 after treating with liraglutide for 6 weeks圖6　利拉魯肽處理6周后NOS和COX2的蛋白表達(dá)情況

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（2015-10-22收稿2016-02-05修回）

（本文編輯閆娟）

中圖分類號(hào)：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150245

Liraglutide promotes the reduction of blood pressure and drives the water and salt through in renal medulla of type 2 diabetes rats

WANG Shaoqing1,MAO Nan1,ZHOU Ping1,WANG Li1△,GAO Fang1,WEI Yixun1,FAN Junming2,FU Ping3
1 Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China；
2 Department of Nephrology,the Affiliated Traditional Medicine Hospital of Southwest Medical University；
3 Department of Nephrology,West China Hospital,Sichuan University
△Corresponding AuthorE-mail:93331524@qq.com

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of glucagon like peptide-1(GLP-1)analogues liraglutide on expressions of nitric oxide synthase(NOS)and cyclo-oxygen-ase(COX)2 in renal medulla of type 2 diabetes rats,and the mechanism of its lowering blood pressure and promoting excretion of water and salt in kidney.MethodsType 2 diabetes model rats were generated by high-fat and high-sugar feeding for 8 weeks followed by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ).Subse?quently,eighteen type 2 diabetes rats were divided into two groups:liraglutide treatment group(DMT)and diabetes group (DM).Twelve normal rats were divided into two groups:liraglutide treatment wild type group(WTT)and wild type group (WT).DMT and WTT groups were given liraglutide(200 μg/kg)by subcutaneous injection,DM and WT groups were given equivalent normal saline by the same way.The levels of blood glucose and blood pressure were detected at 0,2,4 and 6 weeks after treatment in groups of rats.Samples of urine were collected for detecting ion concentrations(K+,Na+and Cl-)af?ter treatment for six weeks.Rats were sacrificed and blood samples were collected for detecting ion concentrations(K+,Na+and Cl-).The expression levels of NOS and COX2 mRNA and protein in renal medulla were detected by real-time PCR and Western blot assay.ResultsAfter treating with liraglutide,the values of blood glucose(F=5.933,P<0.05)and blood pres?sure(F=22.070,P<0.05)were gradually decreased in DMT group.After treatment with liraglutide for 6 weeks,the values of blood glucose(mmol/L:12.78±3.82 vs.18.75±1.68)and blood pressure(mmHg:119.98±4.43 vs.136.42±4.48)were signifi?cantly decreased(P<0.05)in DMT group than those of DM group(P<0.05).There were no significant differences in the concentrations of K+,Na+and Cl-between the two groups.There were higher levels of K+(mmol/L:46.55±6.43 vs.33.13± 9.71),Na+(mmol/L:56.33±8.83 vs.41.20±7.25)and Cl-(mmol/L:159.81±25.06 vs.71.44±12.99)in urine in DMT group than those of DM group(P<0.05).The mRNA levels and protein expressions of NOS and COX2 in renal medulla were significant?ly increased in DMT group than those of DM group(P<0.05).ConclusionGLP-1 analogues liraglutide may enhance the expression of COX2 by increasing the expression of NOS to excrete water and salt,and decrease blood pressure.

Key words：glucagon-like peptide-1;liraglutide;renal medulla;diabetes mellitus，type 2;nitric oxide synthase;cyclo?oxygenase 2