許秀蘭，張巖，楊春琳，袁川，劉應(yīng)高*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 成都 611130；2.西藏林業(yè)調(diào)查規(guī)劃研究院，西藏 拉薩850032；3.四川省廣安市林業(yè)局，四川 廣安 638550）

云杉葉疫病根球殼孢菌的分子檢測

許秀蘭1，張巖2，楊春琳1，袁川3，劉應(yīng)高1*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 成都 611130；2.西藏林業(yè)調(diào)查規(guī)劃研究院，西藏 拉薩850032；3.四川省廣安市林業(yè)局，四川 廣安 638550）

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摘 要：從四川二郎山人工云杉林分離得到云杉葉疫病病原菌，采用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增得到的序列與NCBI中的根球殼孢菌（Rhizosphaera kalkhoffi）相似度達99%。比較分析了NCBI及四川二郎山分離到的根球殼孢菌ITS區(qū)序列，采用軟件primer5.0設(shè)計20個引物。通過對32株菌株DNA進行PCR擴增及產(chǎn)物測序，篩選得到3個特異性引物對ZYZ6、ZYZ7、ZYZ8。改變DNA模板濃度進行擴增檢測，在25 μL PCR反應(yīng)體系中，引物對ZYZ6F/ZYZ6R檢測靈敏度最高，可達到0.1 pg/μL。利用ZYZ6F/ZYZ6R對四川二郎山人工云杉針葉DNA進行檢測，擴增得到310 bp左右的條帶，測序結(jié)果與GenBank中根球殼孢菌相似度達99%。

關(guān) 鍵 詞：云杉葉疫??；根球殼孢菌；分子檢測

云杉（Picea asperata Mast）屬于松科（Pinaceae）云杉屬（Picea）植物。中國云杉林主要分布在東北、華北、西北、西南及臺灣省的高山地帶［1-2］。云杉的落針現(xiàn)象主要由云杉散斑殼菌（Lophodermium piceae）［3-4］和根球殼孢菌（Rhizosphaera kalkhoffii Bubak）［5-6］引起。云杉葉疫病是一種廣泛分布［3-5］的病害。云杉葉疫病病原菌（Rhizosphaera kalkhoffii）可在多種云杉屬、冷杉屬、松屬植物針葉中寄生［6］，在挪

1 材料與方法

1.1 材料

云杉葉疫病病原菌和球殼孢目真菌以及從2年生感病云杉針葉中分離得到的內(nèi)生真菌，共32株，其中2株根球殼孢菌分離自二郎山云杉病株，1株分離自二郎山華山松針葉，23株云杉針葉內(nèi)生真菌，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護實驗室提供。6株球殼孢目真菌由中國林科院森環(huán)森保所提供。

植物樣品為二郎山云杉發(fā)病區(qū)域的發(fā)病針葉與疑似發(fā)病針葉，以健康林區(qū)的云杉針葉作對照。植物基因組DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA Extraction Kit，DP305）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌DNA的提取與擴增

將供試菌株轉(zhuǎn)至 PDA固體培養(yǎng)基［10］（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，加水定容至1 L）平板上，25 ℃培養(yǎng)5 d后，從菌落邊緣切取5塊2 mm×2 mm菌落塊，轉(zhuǎn)至PD液體培養(yǎng)基，25 ℃振蕩培養(yǎng)5～7 d，過濾收集菌絲，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)均在杭州朗基科學(xué)儀器有限公司的A200儀器上完成。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃永久保存。PCR 擴增采用 25 μL體系：DNA模板3 μL，10 μmol/L濃度上、下游引物每對各取0.5 μL混合于一管，Premix 12.5 μL，加ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳（含EB），凝膠自動成像儀上檢測拍照。最后選取條帶清晰的瓊脂糖電泳的PCR產(chǎn)物，送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行測序。

1.2.2 特異引物的設(shè)計與篩選

用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增測序得到根球殼孢菌的ITS序列。根據(jù)測序所得的病原菌DNA序列和在GeneBank中登錄的病原菌的DNA序列進行比對，找出根球殼孢菌rDNA-ITS區(qū)的一段特異基因序列，用軟件Primer 5.0針對這段序列設(shè)計引物，用Oligo 6進行分析。篩選出20個引物（表1），由上海生工生物工程有限公司完成合成。

以供試菌株的DNA為模板，用20個特異引物進行PCR擴增，以雙蒸水為對照。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

采用濃度梯度稀釋法，將病原菌DNA分別稀釋為8×105、4×105、1×105、1×104、1×103、1×102、10、1、1×10-1、1×10-2pg/μL，以雙蒸水為對照，將特異性引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

表1 篩選出的20個根球殼孢菌特異性引物Table 1 Twenty pairs of the primers specific for Rhizosphaera kalkhoffii

表1(續(xù))

1.2.3 云杉針葉的病原菌檢測

分別稱取0.3 g植物針葉樣品，無菌條件下剪碎放入研缽中，按照植物基因組DNA提取試劑盒的步驟提取植物基因組DNA，-20 ℃中保存?zhèn)溆?。采用篩選出的特異引物對提取的云杉DNA樣品進行PCR擴增，以雙蒸水作對照。最終反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異引物的篩選結(jié)果

用設(shè)計的 20個特異引物擴增所有參試菌株的基因組DNA，其中只有引物ZYZ6、ZYZ7和ZYZ8可以從致病菌 Rhizosphaera kalkhoffii中擴增出穩(wěn)定、清晰的條帶，擴增出的基因組大小分別約為310、384、334 bp。其他參試菌株基因組DNA和雙蒸水對照均不能擴增出此條帶（圖1）。引物ZYZ6、YSY2和ZYZ8即為檢測云杉落針病病菌的特異引物，將擴增產(chǎn)物的序列在NCBI中進行BLAST比對，結(jié)果顯示與庫中Rhizosphaera kalkhoffii的相似性達到99%。

圖1 特異引物ZYZ6、YSY2、ZYZ8擴增所有菌株P(guān)CR圖譜Fig. 1 PCR profiles of the products amplified from all strains with specific primers ZYZ6F/ZYZ6R, YSY2F/YSY2R and ZYZ8F/ZYZ8R

2.2 引物靈敏度的檢測結(jié)果

用特異性引物ZYZ6、YSY2和ZYZ8對不同濃度的云杉葉疫病菌基因組DNA進行PCR擴增。結(jié)果顯示，只有引物ZYZ6能從質(zhì)量濃度為0.1 pg/μL以上的模板中擴增出1條約310 bp的特異性條帶，未能在稀釋至100 fg/μL及以下的模板DNA及對照中擴增到特異性條帶（圖2）。YSY2和ZYZ8靈敏度較ZYZ6差，只能從質(zhì)量濃度為10 pg/μL以上的模板中擴增出特異性條帶來，所以選用靈敏度最高的引物ZYZ6作為最終的特異性引物。

圖2 特異引物ZYZ6F/ZYZ6R、YSY2F/YSY2R、ZYZ8F/ZYZ8R的靈敏度檢測結(jié)果Fig. 2 Sensitivity of the PCR with specific primers ZYZ6F/ZYZ6R, YSY2F/YSY2R and ZYZ8F/ZYZ8R

2.3 云杉針葉中病原菌的檢測結(jié)果

選取最佳引物對ZYZ6F/ZYZ6R對四川二郎山人工云杉針葉進行分子檢測，結(jié)果顯示，從發(fā)病區(qū)云杉針葉中能擴增出1條約310 bp的特異性條帶，該特異條帶經(jīng)回收測序，進行BLAST比對，顯示二者相似性達到99%，健康針葉及雙蒸水對照均無特異性條帶產(chǎn)生（圖3），表明引物對ZYZ6F/ZYZ6R能有效檢測出云杉針葉中寄生的病原菌，同時對于疑似發(fā)病的植物組織也有很好的檢測效果。

圖3 特異引物ZYZ6F/ZYZ6R對樣品的擴增結(jié)果Fig.3 Results of PCR amplification from samples with specific primer ZYZ6F/ZYZ6R

3 討論

云杉葉疫病和云杉落針病為云杉葉部病害［11-13］，均可導(dǎo)致云杉針葉枯死脫落。Livsey等［14］認為，云杉葉疫病菌是一種普遍的針葉真菌，相比云杉散斑殼菌（L. piceae）對挪威云杉更具有致病力；Diamandis［4］則認為，云杉葉疫病菌只有當(dāng)針葉受到非生物損傷后才從傷口侵入。許秀蘭等［15］前期研究發(fā)現(xiàn)，云杉葉疫病菌在二郎山活體針葉中存在。筆者通過野外觀察，在土壤潮濕的環(huán)境下，二郎山云杉凋落針葉長出大量子囊果，后鑒定為云杉散斑殼菌，說明這2種病原菌在該地區(qū)人工云杉林中并存。

Müller等［16］利用SCAR標(biāo)記對芬蘭云杉散斑殼菌進行了遺傳多樣性研究，篩選出可專一擴增云杉散斑殼菌的引物L(fēng)P2，實現(xiàn)了對病原菌云杉散斑殼的快速分子檢測。Diamandis［17］早期對云杉葉疫病菌的最適生長條件作了研究。Kumi等［6］描述了該病原菌的室內(nèi)培養(yǎng)特性。為了從分子生物學(xué)水平對云杉葉疫病菌進行研究，筆者設(shè)計并篩選出一對特異引物 ZYZ6F/ZYZ6R，它可以有效地檢測出云杉葉疫病病原菌。改變病原菌濃度梯度，云杉葉疫病病原菌DNA基因組濃度最低達到100 fg/μL水平時仍能檢測。

病原菌在活體植物中常具有潛伏性，一定時間內(nèi)對寄主可能不會產(chǎn)生傷害。通過對二郎山林區(qū)的云杉葉疫病菌進行分子檢測，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)部分云杉林受到該菌的侵染，未表現(xiàn)病癥的針葉中也可檢測到病原菌。近年來發(fā)展起來的實時熒光定量PCR已經(jīng)應(yīng)用于寄主抗性評價［19］。結(jié)合該技術(shù)的應(yīng)用，將有利于云杉抗病品種的篩選。

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責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

中圖分類號：S763.11

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-1032（2016）01-0070-05

收稿日期：2015-10-15 修回日期：2015-11-30

基金項目：四川省教育廳項目（09ZA068）

作者簡介：許秀蘭（1986—），女，四川內(nèi)江人，博士研究生，主要從事林木病理學(xué)研究，xuxiulanxxl@126.com；*通信作者，劉應(yīng)高，博士，教授，主要從事林木病理學(xué)研究，lyg927@263.com威云杉（Picea abies （Linn.）H. Karsten）上報道較多。中國云杉葉疫病首次在云南西北部和四川西部的麗江云杉（Picealikiangensis （Franch） Pritz）上被發(fā)現(xiàn)［7］。2013年，由該病原菌引起的樟子松病害在中國大興安嶺林區(qū)被發(fā)現(xiàn)［8］。在四川瀘定二郎山地區(qū)約有 1 334 hm2人工云杉幼林，筆者在近年的野外觀察和室內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)，二郎山云杉針葉凋落后，在潮濕的環(huán)境下后期會出現(xiàn)云杉散斑殼菌的子囊果，同時，活體針葉的組織分離試驗得到了根球殼孢菌。說明這2種病原菌在該地區(qū)人工云杉林中并存。利用云杉葉疫病病原菌ITS［9］區(qū)序列設(shè)計引物，采集二郎山云杉針葉作為檢測對象，建立了云杉葉疫病病原菌的快速分子檢測體系，并利用該體系對四川二郎山云杉林進行云杉葉疫病的檢測。

Rapid molecular detection of spruce needle blight caused by Rhizosphaera kalkhoffii

Xu Xiulan1， Zhang Yan2， Yang Chunlin1， Yuan Chuan3， Liu Yinggao1*
（1.College of Forestry， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China； 2.Institute of Forestry Investigation and Planning in Tibet Autonomous Region， Lasha 850032， China； 3.Forestry Bureau of Guang'an City Sichuan Province，Guang'an， Sichuan， 638550， China）

Abstract：Pathogen causing spruce needle blight was isolated from the artificial spruce forest on Erlang Moutain， and the amplification sequence from the pathogen using fungus general primers ITS1 and ITS4 showed 99% similarity with the Rhizosphaera kalkhoffii in NCBI. Internal transcribed spacer （ITS） sequences of the isolated pathogen and Rhizosphaera kalkhoffii （R. kalkhoffii） in NCBI were compared and analyzed， and 20 pairs of primers were designed with softwareprimer5.0. The amplification results for 32 strains combined with sequencing results showed that 3 primer pairs ZYZ6， ZYZ7 and ZYZ8 specific for R. kalkhoffii were obtained. The sensitivity of the 3 specific primers was tested by changing their concentration. The results showed primer pair ZYZ6F/ZYZ6R had the highest sensitivity which can detect the pathogen at genomic DNA concentration of 0.1 pg/μL in 25 μL PCR reaction system. Primer pair ZYZ6F/ZYZ6R was used to detect the pathogen from the DNA of the plant leaves of spruce. Sequencing results showed the sequence of the 310 bp amplified bands showed 99% similarity with the recorded sequence of strain Rhizosphaera kalkhoffii in GenBank.

Keywords：spruce needle blight； Rhizosphaera kalkhoffii； molecular detection