王　紅，張斯亮，關海霞中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科、內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點實驗室，遼寧 沈陽 110001

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胰高糖素樣肽-1受體激動劑對人甲狀腺髓樣癌細胞生長和能量代謝的影響

王紅，張斯亮，關海霞
中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科、內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點實驗室，遼寧 沈陽 110001

［摘要］背景與目的：胰高糖素樣肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）受體激動劑是一種新型降糖藥。在研發(fā)過程中，發(fā)現(xiàn)其可增加嚙齒類動物患甲狀腺C細胞腫瘤的風險。因此，該藥物對人類甲狀腺的影響引人關注。本研究旨在探討GLP-1受體激動劑對人甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer，MTC）細胞增殖、降鈣素的分泌和能量代謝的影響。方法：體外培養(yǎng)人MTC細胞系（TT）。分別以0、1、10和100 nmol/L艾塞那肽和利拉魯肽處理細胞24、48和72 h后，采用細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測GLP-1受體激動劑艾塞那肽和利拉魯肽處理后細胞增殖情況；采用降鈣素試劑盒測定細胞培養(yǎng)上清液中降鈣素水平的變化；采用Seahorse能量代謝分析儀檢測細胞糖酵解及線粒體呼吸的變化。結(jié)果：實驗組細胞增殖率與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），降鈣素的量與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），不同濃度艾塞那肽和利拉魯肽處理細胞24 h后，與對照組相比，實驗組艾塞那肽和利拉魯肽對MTC細胞能量代謝并無明顯影響（P＞0.05），隨著艾塞那肽和利拉魯肽處理時間延長，TT細胞糖酵解和線粒體呼吸并無明顯改變（P＞0.05）。結(jié)論：GLP-1受體激動劑對人MTC發(fā)生、發(fā)展無明顯促進作用，未來仍需大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)進一步證實GLP-1受體激動劑的安全性。

［關鍵詞］甲狀腺髓樣癌；艾塞那肽；利拉魯肽；能量代謝

甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer，MTC）占所有甲狀腺癌的5%～10%。與其他類型的甲狀腺癌相比，MTC在臨床癥狀、診斷及治療方面的特征均不相同。MTC起源于甲狀腺濾泡旁C細胞，過度分泌降鈣素，且惡性程度高、預后差，嚴重威脅患者的生存質(zhì)量和壽命［1］。新一類降糖藥物胰高糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受體激動劑利拉魯肽在研發(fā)過程中，曾發(fā)現(xiàn)其可激活嚙齒類動物甲狀腺濾泡旁C細胞的GLP-1受體，引起C細胞異常增生，有潛在的致MTC的風險［2-3］。但目前為止，GLP-1受體激動劑是否會促進人MTC生長和增殖尚未明確。本研究觀察GLP-1受體激動劑對MTC細胞增殖和降鈣素的分泌的作用，并從能量代謝角度探討GLP-1受體激動劑對MTC細胞的影響。

1　.1 材料和方法

1.1材料

人MTC細胞系TT購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。細胞培養(yǎng)基F12、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素和鏈霉素均購自美國Hyclone公司。艾塞那肽購自美國禮來公司，利拉魯肽購自丹麥諾和諾德公司。細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁公司。降鈣素測定試劑盒購自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學工程股份有限公司。XF糖酵解壓力測試試劑盒、XF細胞線粒體壓力測試試劑盒和XF基礎培養(yǎng)液均購自美國Seahorse Bioscience公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

TT細胞培養(yǎng)于F12培養(yǎng)基，其中青霉素終濃度為100 U/mL，鏈霉素終質(zhì)量濃度為100 mg/ L，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈單層貼壁生長，0.25%胰蛋白酶消化傳代，實驗時取對數(shù)生長期細胞。

1.2.2CCK-8法檢測細胞生長和增殖

將處于對數(shù)生長期的細胞胰酶消化，在培養(yǎng)基中調(diào)整細胞密度為1×104/mL，接種于96孔板，每孔200 μL。貼壁24 h后用含不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24、48和72 h，實驗結(jié)束時每孔加10 μL CCK-8，待結(jié)晶溶解后用酶標儀測定450 nm波長處各個孔的吸光度（D）值。最后計算不同濃度和作用時間下細胞的增殖率。細胞增殖率=（實驗組D值-空白組D值）/（對照組D值-空白組D值）。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.2.3降鈣素實驗測定細胞降鈣素

取生長狀態(tài)良好的細胞胰酶消化，將細胞以1×104/mL接種于24孔板，待細胞貼壁后，分別用含不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24、48和72 h，實驗結(jié)束后，收取細胞培養(yǎng)基，應用降鈣素試劑盒測定降鈣素水平。

1.2.4Seahorse能量代謝分析儀檢測細胞能量代謝的改變

將生長狀態(tài)良好的細胞消化、計數(shù)，用含不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽的培養(yǎng)基制成密度為1.5×105個/mL的細胞懸液，每孔80 μL接種于Seahorse專用96孔板（12 000個細胞/孔）。處理24 h組，室溫靜置1 h，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)23 h；處理時間為48 h組，細胞先種入6孔板，培養(yǎng)24 h后胰酶消化，再種入Seahorse專用96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。同時水化探針板過夜。糖酵解壓力測試試驗：分別向探針板A、B和C孔加入葡萄糖、寡霉素和2-脫氧葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）；線粒體壓力測試試驗：分別向探針板A、B和C孔加入寡霉素、羰基-氰-對-三氟甲氧基苯腙（carbonyl cyanide p-trifuormethoxyphenylhydrazo ne，F(xiàn)CCP）、抗霉素和魚藤酮。校正探針板后，加入細胞培養(yǎng)板檢測。

1.3統(tǒng)計學處理

2　結(jié) 果

2.1GLP-1受體激動劑對TT細胞增殖的影響

CCK-8法檢測不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽處理TT細胞后的增殖情況，結(jié)果顯示，與對照組相比較，不同濃度的艾塞那肽和利拉魯肽處理TT 24、48 和72 h后，實驗組活細胞相對數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，且隨著處理時間延長，仍未見實驗組活細胞相對數(shù)出現(xiàn)明顯變化（P＞0.05，圖1）。

2.2GLP-1受體激動劑對TT細胞分泌降鈣素的影響

測定不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽處理TT細胞后培養(yǎng)基中降鈣素水平的變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著艾塞那肽和利拉魯肽處理濃度增加，實驗組細胞降鈣素分泌水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且隨著處理時間延長，實驗組細胞降鈣素濃度與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2）。

2.3GLP-1受體激動劑對TT細胞糖酵解和線粒體呼吸的影響

采用Seahorse能量代謝分析儀檢測不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽處理TT后細胞糖酵解和線粒體呼吸水平的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度的艾塞那肽和利拉魯肽處理TT細胞24 h后，實驗組細胞糖酵解和線粒體呼吸水平未見明顯改變；隨著處理時間延長，實驗組細胞與對照組相比，糖酵解和線粒體呼吸水平仍無明顯變化（圖3）。

圖1　艾塞那肽和利拉魯肽對TT細胞生長和增殖的影響Fig.1 Efects of exenatide and liraglutide on cell proliferation in TT cells

圖2　艾塞那肽和利拉魯肽對TT細胞降鈣素分泌的影響Fig.2 Efects of exenatide and liraglutide on the secretion of calcitonin in TT cells

圖3　艾塞那肽和利拉魯肽對TT細胞能量代謝影響Fig.3 Efects of exenatide and liraglutide on energy metabolism of TT cells

3　討 論

GLP-1受體激動劑可以在體內(nèi)模擬GLP-1的作用，與GLP-1受體結(jié)合，激活胰島素信號通路促進胰島素合成并有助于胰島細胞的修復和再生，是治療2型糖尿病的新型降糖藥之一。但在該類藥物研發(fā)的過程中，曾發(fā)現(xiàn)在嚙齒類動物中，利拉魯肽有潛在致MTC的風險，艾塞那肽可增加甲狀腺C細胞腺瘤的風險［2-3］。因此，GLP-1受體激動劑對人類甲狀腺癌是否存在影響受到了極大的關注。我們的前期體外研究顯示，人類甲狀腺乳頭狀癌中存在GLP-1受體表達，但艾塞那肽和利拉魯肽沒有促進甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖［4］。在Gier等［5］的研究中發(fā)現(xiàn)，與嚙齒類動物甲狀腺C細胞具有豐富GLP-1受體表達不同，人類MTC細胞系中雖有GLP-1受體的表達，但其表達量低。GLP-1受體激動劑臨床上市后，目前尚沒有發(fā)布艾塞那肽和利拉魯肽治療會增加人類患MTC的警示［6］。盡管如此，在完全確認GLP-1受體激動劑的甲狀腺安全性之前，還需要更多的體外、體內(nèi)試驗數(shù)據(jù)。因此，本研究利用人類MTC細胞系，探討GLP-1受體激動劑對嚙齒類動物甲狀腺濾泡旁細胞的負面作用是否也存在于人類MTC細胞上。

對于利拉魯肽和艾塞那肽對MTC細胞的影響，首先從細胞增殖和降鈣素分泌角度進行了探討。細胞增殖是經(jīng)典的反映腫瘤細胞生長的指標。降鈣素由濾泡旁C細胞分泌，是MTC的特異性腫瘤標志物。已有研究明確血清降鈣素篩查可作為甲狀腺結(jié)節(jié)患者術前診斷MTC的敏感指標［7-8］。Trimboli等［9］在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，與甲狀腺細針穿刺細胞學檢查相比，通過測定細針穿刺針洗脫液中的降鈣素水平診斷MTC的靈敏度更高。此外，MTC患者聯(lián)合檢測血清降鈣素和癌胚抗原可以提高診斷的敏感性，有助于MTC的早期診斷和治療，并且術后動態(tài)觀察血清降鈣素和癌胚抗原，對于判斷手術效果和腫瘤復發(fā)有重要意義［10］。美國甲狀腺學會的指南也建議MTC術后患者隨訪期間行血清降鈣素檢測以預測復發(fā)，并可依據(jù)降鈣素水平?jīng)Q定進一步治療策略［1］?？梢?，降鈣素是評估MTC發(fā)生、發(fā)展的重要指標。本研究結(jié)果顯示，艾塞那肽和利拉魯肽對MTC細胞的生長沒有促進作用，并且兩種藥物對MTC細胞降鈣素的分泌沒有影響。

本研究進一步應用Seahorse能量代謝分析儀分析了艾塞那肽和利拉魯肽對MTC細胞能量代謝的影響。之所以選擇能量代謝作為研究內(nèi)容，是因為惡性腫瘤細胞重要的生物學特性之一是細胞代謝的改變，以“瓦博格效應”為突出代表，即腫瘤細胞即使在供氧充足條件下也會以糖酵解為主要供能方式，并出現(xiàn)線粒體呼吸功能降低。鑒于越來越多證據(jù)表明這種能量代謝改變是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎環(huán)節(jié)［11-12］，因此以該指標作為評估GLP-1受體激動劑是否可以促進MTC進展的佐證。研究結(jié)果并未提示艾塞那肽和利拉魯肽可以改變MTC細胞能量代謝模式，這進一步支持了兩種藥物對人類MTC細胞無影響。

綜上所述，本研究從細胞增殖、降鈣素分泌和能量代謝角度提示GLP-1受體激動劑不會促進MTC發(fā)生、發(fā)展。但本研究僅在體外實驗層面上對利拉魯肽和艾塞那肽進行了安全性的初步研究。作為2型糖尿病患者新型降糖藥物，未來仍需大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)進一步證實GLP-1受體激動劑在實際應用中的安全性。

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DOI：10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.06.002

中圖分類號：R736.1

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639（2016）06-0487-05

收稿日期：（2015-12-01 修回日期：2016-05-10）

基金項目：遼寧省科學技術計劃項目（2013225021）。通信作者：關海霞 E-mail： hxguan@vip.126.com

Effect of glucagon-like peptide-1 receptor agonists on growth and energy metabolism in human medullary thyroid cancer cells

WANG Hong， ZHANG Siliang， GUAN Haixia
（Department of Endocrinology and Metabolism， the Endocrine Institute， the First Hospital of China Medical University， the Liaoning Provincial Key Laboratory of Endocrine Diseases， Shenyang 110001， Liaoning Province， China）Correspondence to： GUAN Haixia E-mail： hxguan@vip.126.com

［Abstract］Background and purpose： This study aimed to investigate the efect of glucagon-like peptide-1 receptor agonists on proliferation， secretion of calcitonin and energy metabolism of medullary thyroid cancer （MTC）cell. Methods： The MTC cell line （TT） was cultured in vitro. After treatment with exenatide and liraglutide （0， 1， 10 and 100 nmol/L） for 24， 48 and 72 h， the proliferation of TT was analyzed by CCK-8 kit， the calcitonin was measured by calcitonin assay kits， and the energy metabolism of TT was measured by Seahorse XF instrument. Results： When compared with control group， neither exenatide nor liraglutide had efects on proliferation of TT （P＞0.05）； the calcitonin levels did not change signifcantly after treatment with GLP-1 receptor agonists （P＞0.05）. Exenatide and liraglutide did not alter glycolysis and mitochondrial respiration in TT cells in a dose- and time-dependent manner. Conclusion：GLP-1 receptor agonists have no efect on the development of TT. Further collection of the safety data of exenatide and liraglutide on thyroid is still needed.

［Key words］Medullary thyroid cancer； Exenatide； Liraglutide； Energy metabolism