馬大昌，陳　誠(chéng)，吳多明，王紅磊，武　力蘭州大學(xué)第一醫(yī)院乳腺病科，甘肅 蘭州 730000

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miR-199a-3p在乳腺癌中的表達(dá)及其作用

馬大昌，陳誠(chéng)，吳多明，王紅磊，武力
蘭州大學(xué)第一醫(yī)院乳腺病科，甘肅 蘭州 730000

［摘要］背景與目的：多種微小RNA（microRNA，miRNA）在乳腺癌中異常表達(dá)，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。miRNA可能是治療乳腺癌的新靶點(diǎn)。該研究旨在探討miR-199a-3p在乳腺癌中的表達(dá)水平，及其對(duì)乳腺癌癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法：運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，QRT-PCR）檢測(cè)乳腺癌患者癌組織、癌旁正常組織、人乳腺癌細(xì)胞和人乳腺細(xì)胞中miRNA-199a-3p的表達(dá)水平，miR-199a-3p mimic（或inhibitor）轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231過(guò)表達(dá)（或沉默）miR-199a-3p的表達(dá)后，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Hoechst染色法和caspase-3活力測(cè)試檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：相對(duì)癌旁正常組織和人正常乳腺細(xì)胞，miR-199a-3p在乳腺癌患者癌組織和人乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。在MDAMB-231中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic過(guò)表達(dá)miR-199a-3p可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡；在MDA-MB-231中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p inhibitor沉默miR-199a-3p可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。結(jié)論：miR-199a-3p在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡發(fā)揮抑癌作用。

［關(guān)鍵詞］乳腺癌；miR-199a-3p；MDA-MB-231；增殖；凋亡

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。我國(guó)的乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位，占全身其他惡性腫瘤的7%～10%，是嚴(yán)重威脅我國(guó)女性身體健康的主要疾病。隨著治療手段的發(fā)展，乳腺癌的治療效果有了長(zhǎng)足的提高［1］。近年來(lái)，腫瘤的基因治療也逐漸成為研究的熱點(diǎn)，探尋與乳腺癌相關(guān)的原癌基因和抑癌基因也為診斷和治療乳腺癌提供了新的研究方向［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類真核細(xì)胞中由21～23個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA［3］。miRNA通過(guò)抑癌或促癌作用參與癌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡［4］。最近研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中多種miRNA表達(dá)異常并參與調(diào)節(jié)乳腺癌功能，如miR-21、miR-210和miR-200等［5］。因此，miRNA可能是治療乳腺癌的新靶點(diǎn)。miR-199a-3p是重要的抑癌基因，參與調(diào)節(jié)多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展，包括胃癌［6］、肝癌［7］、子宮內(nèi)膜癌［8］、睪丸癌［9］和骨肉瘤［10］等，但miR-199a-3p是否也參與調(diào)節(jié)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展未見報(bào)道。本研究旨在研究miR-199a-3p在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，將通過(guò)以下兩個(gè)方面進(jìn)行研究：① 乳腺癌患者癌組織與癌旁正常組織miR-199a-3p的表達(dá)是否有差異；② miR-199a-3p是否參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)，與miR-199a-3p同家族的miR-199a-5p參與調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞功能［11］，并在乳腺癌患者的血漿中循環(huán)miR-199a-3p表達(dá)明顯下降［12］，因此我們推測(cè)miR-199a-3p可能參與調(diào)節(jié)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

1　材料和方法

1.1材料與主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞株（MDA-MB-231、MDAMB-468、MCF-7和SK-BR-3）和正常的人乳腺細(xì)胞HBL-100均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所。培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。Trizol購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。miRNA引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。miR-199a-3p mimic、miR-199a-3p inhibitor、NC mimic、NC inhibitor和LipofectamineTM2000購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。MTT、Hoechst 33258和Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1樣本收集

收集2013年在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院進(jìn)行乳腺癌切除手術(shù)的26例乳腺癌患者，所有患者均已經(jīng)過(guò)病理學(xué)確診。經(jīng)患者同意，于術(shù)后摘取微量乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織用于本研究。所取組織均凍于-80 ℃用于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，QRT-PCR）。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPML1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系及正常乳腺細(xì)胞HBL-100均用含10%胎牛血清的高糖細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞接種于12孔或96孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞匯合密度達(dá)到60%～70%時(shí)，利用LipofectamineTM2000運(yùn)載miRNA mimic或miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)。QRT-PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，采用MTT法檢測(cè)0、24、48 和72 h時(shí)的細(xì)胞增殖，采用Hoechst 33258和Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)24 h時(shí)的細(xì)胞凋亡。具體操作參照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.5miRNA的提取、逆轉(zhuǎn)和QRT-PCR

Trizol法提取總RNA，取2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。在cDNA中加入PCR熒光試劑和引物于ABI-7300 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。ABI-7300系統(tǒng)分析得到miRNA表達(dá)量。具體操作參照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。人組織和細(xì)胞數(shù)據(jù)表示采用±s 。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1miR-199a-3p在乳腺癌患者癌組織中表達(dá)下調(diào)

QRT-PCR檢測(cè)乳腺癌患者癌組織和癌旁正常組織發(fā)現(xiàn)，相對(duì)癌旁正常組織，乳腺癌組織中miR-199a-3p表達(dá)顯著下調(diào)（圖1）。

圖1　miR-199a-3p在乳腺癌患者癌組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-199a-3p in cancer tissues of breast cancer patients

2.2miR-199a-3p在乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)

QRT-PCR檢測(cè)4種人乳腺癌細(xì)胞株（MDAMB-231、MDA-MB-468、MCF-7和SK-BR-3）和人乳腺細(xì)胞株HBL-100發(fā)現(xiàn)，相對(duì)人乳腺細(xì)胞株HBL-100，4種人乳腺癌細(xì)胞株中miR-199a-3p表達(dá)均顯著下調(diào)（圖2）。

圖2　miR-199a-3p在乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.2 Expression of miR-199a-3p in breast cancer cell lines

2.3miR-199a-3p mimic抑制MDA-MB-231增殖促進(jìn)其凋亡

轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic 24 h后，QRT-PCR檢測(cè)miR-199a-3p表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p表達(dá)顯著上調(diào)，過(guò)表達(dá)成功（圖3A）。轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic，分別于0、24、48和72 h運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-199a-3p明顯抑制MDA-MB-231的增殖，48和72 h的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。

轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic 24 h后，Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-199a-3p引起Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，即凋亡數(shù)增多（圖4A、B）。Caspase-3活力是細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)，與細(xì)胞凋亡正相關(guān)。檢測(cè)caspase-3活力發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-199a-3p顯著增加caspase-3活力（圖4C）。

圖3　miR-199a-3p mimic對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Efect of miR-199a-3p mimic on the proliferation of MDA-MB-231

2.4miR-199a-3p inhibitor促進(jìn)MDAMB-231增殖抑制其凋亡

轉(zhuǎn)染miR-199a-3p inhibitor 24 h后，QRTPCR檢測(cè)miR-199a-3p表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p表達(dá)顯著下調(diào)，沉默成功（圖5A）。轉(zhuǎn)染miR-199a-3p inhibitor，分別于0、24、48和72 h運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，沉默miR-199a-3p明顯促進(jìn)MDA-MB-231的增殖（圖5B）。

轉(zhuǎn)染miR-199a-3p inhibitor 24 h后，Hoechst染色法和caspase-3活力測(cè)試檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，沉默miR-199a-3p引起Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，即凋亡數(shù)減少（圖6A、B），caspase-3活力降低（圖6C）。

圖4　miR-199a-3p mimic對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Efect of miR-199a-3p mimic on the apoptosis of MDA-MB-231

圖5　miRNA-199a inhibitor對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Efect of miR-199a-3p inhibitor on the proliferation of MDA-MB-231

圖6　miRNA-199a inhibitor對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Efect of miR-199a-3p inhibitor on the apoptosis of MDA-MB-231

3　討 論

miRNA調(diào)控人類30%的基因表達(dá)，與人類疾病密切相關(guān)。miRNA通過(guò)與靶基因mRNA 的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，調(diào)節(jié)靶基因mRNA降解和蛋白合成，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后靶基因的表達(dá)水平，最終影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等功能。研究發(fā)現(xiàn)，癌組織的miRNA表達(dá)異常，并參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在腫瘤組織中高表達(dá)，表現(xiàn)出癌基因的特性，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和遷移的miRNA稱為促癌miRNA；在腫瘤組織中低表達(dá)，負(fù)性調(diào)控癌基因的表達(dá)的miRNA稱為抑癌miRNA［4］。

miR-199a-3p在胃癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌和骨肉瘤的癌組織中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)抑制相應(yīng)癌細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡發(fā)揮抑癌作用［6-10］。miRNA-199a-5p和miR-199a-3p在乳腺癌患者血漿中表達(dá)下調(diào)［12］，miRNA-199a-5p通過(guò)調(diào)節(jié)輻射引起的自噬影響乳腺癌細(xì)胞功能［11］。本研究顯示，相對(duì)癌旁正常組織，乳腺癌患者癌組織miR-199a-3p表達(dá)下調(diào)。乳腺癌細(xì)胞miR-199a-3p表達(dá)水平較正常乳腺細(xì)胞也下調(diào)，其中MDA-MB-231下調(diào)最明顯，故用于下一步功能實(shí)驗(yàn)。本研究利用化學(xué)合成的miR-199a-3p mimic和miR-199a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染MDAMB-231細(xì)胞，成功過(guò)表達(dá)和沉默miR-199a-3p。MDA-MB-231中過(guò)表達(dá)miR-199a-3p促進(jìn)其凋亡抑制增殖，而沉默miR-199a-3p促進(jìn)其增殖。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在乳腺癌組織和多種乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖促進(jìn)其凋亡。miR-199a-3p可能是治療乳腺癌的重要靶點(diǎn)。miR-199a-3p調(diào)控乳腺癌功能的靶標(biāo)蛋白未知，這將是我們下一步工作的重點(diǎn)。

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DOI：10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.06.001

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639（2016）06-0481-06

收稿日期：（2015-09-09 修回日期：2015-12-21）

通信作者：武力 E-mail： lzuwuli2015@sina.com

The expression of miR-199a-3p in breast cancer and its effect

MA Dachang， CHEN Cheng， WU Duoming， WANG Honglei， WU Li
（Department of Breast Diseases， the First Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730000， Gansu Province， China）Correspondence to： Wu Li E-mail： lzuwuli2015@sina.com

［Abstract］Background and purpose： Multiple microRNAs （miRNAs） are abnormally expressed in breast cancer and play an important role in the regulation of breast cancer. miRNAs may be a new target for the treatment of breast cancer. This study aimed to investigate the expression of miR-199a-3p in breast cancer and the efect of miR-199a-3p on proliferation and apoptosis of breast cancer. Methods： Real-time PCR was used to test the expression of miR-199a-3p in breast cancer tissues， normal breast tissues， breast cancer cells and normal breast cells. Overexpression （or silencing the expression） of miR-199a-3p was conducted by transfecting MDA-MB-231 with miR-199a-3p mimics （or inhibitors）. The proliferation of MDA-MB-231 was detected by MTT method. The apoptosis of MDA-MB-231 was investigated by Hoechst staining and caspase-3 activity assay kit. Results： Compared to corresponding non-tumor breast tissues （or normal breast cell HBL-100）， lower levels of miR-199a-3p were expressed in breast cancer tissues or breast cancer cells. Overexpression of miR-199a-3p induced by miR-199a-3p mimic inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of MDA-MB-231， while silencing the expression of miR-199a-3p induced by miR-199a-3p inhibitor increased the proliferation and suppressed the apoptosis of MDA-MB-231. Conclusion： The expression of miR-199a-3p is lower in breast cancer， which shows its tumor suppression efect by regulating the proliferation and apoptosis of breast cancer cells.

［Key words］Breast cancer； miR-199a-3p； MDA-MB-231； Proliferation； Apoptosis