張一堪，曹　密，劉建平，黃　強,3

(1. 復旦大學 生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；2. 國家蛋白質科學中心(上海)，上海 201203； 3. 上海生物制造技術協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237)

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A型流感病毒基質蛋白M1的二聚化機制

張一堪1，曹密2，劉建平1，黃強1,3

(1. 復旦大學 生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；2. 國家蛋白質科學中心(上海)，上海 201203； 3. 上海生物制造技術協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237)

摘要：流感病毒基質蛋白1(matrix protein 1， M1)位于病毒包膜之下，形成一層殼狀結構 (衣殼)，可與病毒的血凝素、神經氨酸酶、包膜和病毒遺傳物質發(fā)生相互作用，在病毒的組裝與復制過程中起著關鍵作用.不過，除N 端有晶體結構外，全長M1蛋白的結構尚未解析.因此，人們對全長M1蛋白如何二聚化、然后多聚化形成病毒衣殼的過程知之甚少.為了解M1蛋白的二聚化機制，首先從M1的N 端片段晶體結構出發(fā)，用蛋白質結構預測方法獲得M1的全長結構模型；其次，對可能的M1二聚體進行分子動力學模擬，分析其二聚化界面的氨基酸，由此發(fā)現(xiàn)了一種通過M1蛋白C端片段結合而形成的二聚體；最后，為驗證模擬結果，用電鏡三維重構方法分析了全長M1二聚體的構象，并提出了M1多聚化的機理模型.

關鍵詞:A型流感病毒； 基質蛋白M1； 二聚化； 分子建模； 單顆粒三維重構

流感病毒是一種造成人類和動物患流行性感冒的RNA病毒，可引發(fā)急性上呼吸道感染、肺炎或心肺衰竭等[1].病毒基質是存在于病毒囊膜下，由基質蛋白1(matrix protein 1， M1)聚合形成的殼狀結構[2]，并把vRNP粒子包裹到殼內[3-4].M1既可以與病毒內部的遺傳物質，又可以與膜蛋白和脂雙層相互作用[3]，在病毒囊膜形成過程中起到組織者的作用[5]，因此在流感病毒的復制過程中扮演重要角色[6].M1的突變研究表明： 當把M1缺失的突變毒株感染宿主時，發(fā)現(xiàn)病毒喪失了侵染細胞的活力[7]；當M1的一些氨基酸發(fā)生突變時，病毒的形狀發(fā)生了改變，如變成球形、多角形、棒狀，甚至會形成纖維狀[8-9]；M1組裝時螺旋轉角的不同也會使病毒粒子的形態(tài)呈現(xiàn)從球形到纖維狀的變化[10].所以，在病毒復制和組裝過程中，M1蛋白對病毒粒子的形態(tài)和功能有重要影響.因此，詳細了解M1蛋白聚合組裝的分子機理，揭示病毒的組裝機制，可以為流感的預防和治療提供新思路，意義重大.特別地，二聚化是M1蛋白多聚化過程的起始步驟[11]，研究清楚M1二聚化的機制是解決該科學問題的前提與關鍵.

目前，對M1蛋白二聚化的結構分析還基本局限于M1的N 端片段(1～158aa).一個主要的原因是用晶體學方法很難獲得全長M1蛋白 (1～252aa) 的結構，可能是因為： M1的C 端片段(159～252aa)結構柔性較大，且部分區(qū)段(159～164aa)易受蛋白酶水解而發(fā)生降解[12-13]等.1997年，Sha和Luo等[14]解析了M1蛋白N 端片段二聚體的晶體結構，發(fā)現(xiàn)N 端單體結構由約9個α螺旋構成，命名為M區(qū)域(螺旋H6～H9)和N區(qū)域(螺旋H1～H4)，二聚化界面由平行的兩個N端H6螺旋之間的疏水氨基酸作用 (Pro 90，Met 93，Val 97) 和N區(qū)域的氫鍵網絡所維持，稱之為平行式二聚化結構.2001年，Arzt等[12]解析出了N端二聚體的另外一種晶體結構[12]，由兩個單體堆疊形成，稱之為堆疊式二聚化結構，二聚化界面面積約為1100 ?2.另外，小角散射的研究也表明，M1的結構N 端與C 端在溶液中呈現(xiàn)出了不同的運動狀態(tài)： N 端片段的結構緊湊、穩(wěn)定，而C 端片段結構伸展，且部分區(qū)域柔性較大[15].這些工作對M1的N端結構及其二聚化模式有了一定研究，但全長M1蛋白的結構和二聚化機制的研究還十分缺乏，因而也限制了人們對全長M1蛋白多聚化機理的理解.例如，雖然人們在N端片段二聚體晶體結構的基礎上提出了初步的M1多聚化的機理模型，但是蛋白C端片段在該模型中的具體位置不清楚[16].

針對上述問題，為了解全長M1蛋白二聚化的機制，本工作從構建全長M1二聚體模型入手，用分子動力學(Molecular Dynamics， MD) 模擬方法研究全長M1蛋白可能的二聚化模式，揭示全長M1二聚體的結構，并利用負染電鏡方法采集M1蛋白的圖像，用單顆粒三維重構方法獲得M1聚合體的構象，與MD模擬結果進行了比對分析.根據所得的全長M1二聚體模型，我們提出了全長M1多聚化的機理模型，為進一步揭示流感病毒自組裝的過程提供基礎.

1計算方法

1.1全長M1二聚體模型的構建

本研究選擇了H1N1病毒(A/Puerto Rico/8/1934， H1N1)和H9N2病毒(A/chicken/Jiangsu/7/2002， H9N2)的M1蛋白作為研究對象.為建立全長M1蛋白的二聚體結構模型，首先以M1蛋白 N端片段晶體結構為模板，用同源模建程序MODELLER[17]預測全長結構，然后把全長結構分別與N端片段二聚體晶體結構[18]的兩個單體進行結構比對，獲得與N端片段類似的全長M1的二聚體模型，作為后續(xù)MD模擬的初始構象.

1.2MD模擬系統(tǒng)構建與模擬

本研究使用NAMD程序[19]進行MD模擬研究.以上述方法構建的M1二聚體模型為初始構象，用CHARMM力場描述系統(tǒng)原子的各種參數，水分子的模型為TIP3P，用VMD[4]程序按標準全原子顯式溶劑方式構建模擬系統(tǒng)： 把M1二聚體置于立方盒子中央，蛋白質表面離盒子邊界至少15?，然后把水分子加入盒子中并加入相應數目的離子(Na+與Cl-)，使體系的離子濃度值為0.150mol/L，并保持模擬系統(tǒng)電中性[20].

MD模擬計算步驟為： 首先對體系進行能量最小化，以消除系統(tǒng)內不合理的原子碰撞；接著，對體系進行時間尺度為250ns的基于NPT系統(tǒng)的模擬，體系溫度設為300K，壓強為1.01325×105Pa，積分步長為2fs，長程靜電相互作用使用Particle Mesh Ewald (PME)求和方法計算.模擬中，每隔10ps保存一次體系原子的坐標與速度，以用于后續(xù)分析.NAMD輸出的dcd軌跡文件是二進制格式，記錄了模擬系統(tǒng)原子在各個時刻的坐標及速度.用可視化軟件(如VMD)可以直觀地觀察模擬過程中蛋白質的構象變化及了解蛋白質內部分子振動狀態(tài)的變化等[21].

1.3MD 模擬軌跡分析

1.3.1M1二聚體構象聚類分析

MD構象的聚類分析可以了解M1蛋白在模擬過程中的優(yōu)勢構象.我們使用分子模擬軟件GROMACS(5.0.1版)中基于均方根偏差(Root-Mean-Square Deviation, RMSD)的gmx_cluster模塊對M1二聚體進行聚類分析[22].分析時，從4個模擬體系50～250ns的模擬軌跡等時間間隔選取2000個構象進行聚類計算，聚類分析用的RMSD截斷值為2.5?.

1.3.2M1二聚化界面氨基酸分析

蛋白質二聚化界面是由兩個單體特定位置的氨基酸相互作用而產生，這些特定的氨基酸稱之為界面氨基酸.本研究采用MDcons程序[23]分析界面氨基酸.MDcons通過計算軌跡中不同單體間界面氨基酸殘基的接觸次數，來表征界面殘基的保守性.兩界面殘基接觸次數越多，表明此氨基酸在界面上的保守性就越高，反之越低.在計算時，氨基酸-氨基酸間相互接觸的判據是它們的最近非氫重原子距離小于5?[23].

2實驗方法

2.1H9N2 M1蛋白的表達與純化

將H9N2的M1蛋白基因(由上海生物制品研究所陳則研究員、上海計劃生育研究所徐萬祥研究員提供)克隆于原核表達載體pET-28a，轉化E.coliBL21(DE3)構建表達M1蛋白的大腸桿菌工程菌.37℃ 培養(yǎng)工程菌至OD600值為0.4～0.6，降低溫度至30℃，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)1h 后，收集菌體，超聲破碎、離心后將上清液經鎳柱吸附層析，獲得M1蛋白質粗品.隨后采用Sephacryl S200分子篩柱層析，對M1蛋白初始樣品進一步精細純化，收集M1蛋白組分，并濃縮至濃度為0.2mg/mL.樣品存于-80℃，以用于后續(xù)電鏡分析實驗.

2.2負染電鏡樣品制備與圖像采集

負染電鏡數據采集在國家蛋白質科學中心(上海)的電鏡分析系統(tǒng)上完成.取-80℃的M1蛋白樣品凍融后，用pH 7.4緩沖液(20mmol/LTris，150mmol/L NaCl)分別稀釋至2.5，5，10，20，30μg/mL，100μL冰上放置，4℃過夜.負染時，取300目(≈8.47μm)銅網的碳膜，PELCO EasiGlow輝光放電系統(tǒng)輝光放電10s，用鑷子將銅網夾起，懸空放置，加稀釋后的蛋白質樣品10μL，孵育60s.然后，迅速用濾紙片接觸銅網邊緣將多余的溶液吸去；加10μL 1%(質量濃度)甲酸雙氧鈾溶液染液，孵育60s；隨后，迅速吸去多余的染液，紅外燈下15min后，將樣品通過樣品桿置入200kV FEI TECNAI TF20 場發(fā)射透射電子顯微鏡，觀察并手動采集圖像.

2.3單顆粒三維重構分析

單顆粒三維重構分析與圖像顯示主要使用軟件EMAN[24]和Chimera[25]來進行.利用電鏡圖像進行單顆粒三維重構的一般流程請參考有關文獻[26-27].

3結果

3.1全長M1二聚體的模型

以M1蛋白 N端晶體結構為模板，用同源模建方法構建了H1N1(A/Puerto Rico/8/1934, H1N1)和H9N2(A/chicken/Jiangsu/7/2002, H9N2) 病毒的M1二聚體的結構模型，作為后續(xù)MD模擬的初始構象，如圖1所示.其中，根據平行式N端二聚體結構(PDB ID： 1aa7) 構建的H1N1全長M1二聚體模型稱之為1aa7d，根據堆疊式N端二聚體結構 (PDB ID： 1ea3) 構建的全長 M1二聚體模型稱為1ea3d；H9N2病毒對應的全長M1二聚體模型則分別稱為： 1aa7m 和1ea3m.由于H1N1與H9N2的M1序列的幾乎類似，個別氨基酸的差異對兩個M1二聚體的初始構象影響很小.

3.2氨基酸殘基的波動分析

為考察模擬體系是否達到平衡，以Cα原子RMSD隨模擬時間的變化作為指標.以0時刻的構象為參考構象，4個模擬系統(tǒng)的M1的RMSD變化情況如圖2所示.由圖可見，在MD模擬進行到50ns后，4個體系都基本趨于穩(wěn)定，說明模擬達到了平衡.因此，選取這4個模擬體系的50～250ns的軌跡進行后續(xù)分析.

蛋白質氨基酸殘基的均方根漲落(Root Mean Square Fluctuation, RMSF)是殘基位置與其平均位置的偏移量的平方進行時間平均后的開方值，反映了殘基的自由運動幅度，即所謂的結構柔性.從圖3可以看出，4個體系RMSF 值變化趨勢一致，都是C 端片段原子位置波動性要遠遠高于N 端片段.可見，M1蛋白的C端片段結構柔性要高于N 端片段.

3.3M1二聚體在模擬中的優(yōu)勢構象分析

表1　4個模擬體系的MD構象的聚類結果

為獲得全長M1二聚體在溶液中的優(yōu)勢構象，我們用GROMACS中的gmx_cluster模塊對MD軌跡構象進行聚類分析，各體系中排序前三位的MD優(yōu)勢構象的比例(η)見表1，其聚類中心構象(即代表構象)見圖4.由表1可知，每個體系中前三類構象占到全部MD構象的50% ，甚至以上.因此，我們選取前三個聚類的代表構象進行分析.另外，表1的數據說明，同一M1序列的平行式構象(1aa7d，1aa7m)構象聚類比堆疊式構象(1ea3d，1ea3m)多，表明在溶液中平行式構象的多態(tài)性高于堆疊式構象.這也說明了堆疊式構象在溶液中有更高的穩(wěn)定性.從二聚體的空間構象也不難看出這一點，堆疊式構象的緊密度比平行式高，因此分子運動時所受的空間位阻作用比平行式大.

圖4(見第392頁)中的C1、C2 和C3 分別表示4個模擬體系中的比例最高的前三類聚類代表構象.由圖可見，兩種來源的M1結構的最穩(wěn)定構象(C1)幾乎沒有差別，并且其N端結構都較穩(wěn)定.另外，在兩種平行式結構(1aa7d，1aa7m)中，我們發(fā)現(xiàn)其C端片段有向兩邊分散的趨勢，如在(a)中的C1和C3的這種分散趨勢較明顯，再次表明C端片段的柔性高于N端片段.在堆疊式結構(1ea3d，1ea3m)中，由于空間位阻效應，這種趨勢不及平行式結構明顯具體表現(xiàn)在： 堆疊式結構中只有左上方的那條鏈對應的C端結構柔性較大，如在(c)中的C1和C3，而另外一條鏈(位于右下方)對應的C端結構在模擬中則較為穩(wěn)定.另外，M1 蛋白是一種富α螺旋蛋白，二級結構約90% 由α螺旋組成.從聚類結果來看，α螺旋在聚類結果中占有較高的比例，說明全長M1預測結果的準確性.通過聚類分析，我們獲得了M1二聚體在溶液中的優(yōu)勢構象，以下的分析將以這些結果為基礎，如界面氨基酸分析所用構象為最大類的代表構象(即C1)；電鏡三維重構分析進行結構比較時用的也是該代表構象.

3.4全長M1二聚體界面氨基酸分析

用MDcons程序分析，我們獲得了全長M1二聚體界面氨基酸的分布情況，如圖5所示.對于平行式結構，相互作用界面氨基酸都分布在N端，與Sha和Luo[14]的結果一致，為極性氨基酸或疏水性氨基酸.這些氨基酸較容易形成α螺旋，因為N 端的氨基酸可與包膜相互作用，有比較多的疏水性氨基酸.在堆疊式M1二聚體結構，界面氨基酸在C端和N端都有分布.由M1蛋白組裝的特性，我們推斷平行式M1二聚體結構中也有部分界面氨基酸分布于C 端.于是，我們利用VMD通過設定周期性邊界條件，觀察4個模擬體系中多個二聚體的運動趨勢，發(fā)現(xiàn)了新的一種M1二聚化的方式，即平行式構象用有C 端氨基酸組成界面的二聚化方式，其二聚化界面氨基酸情況如圖5(e)所示.二聚化界面主要依賴于酸堿性氨基酸的相互作用來維持.我們把這種新發(fā)現(xiàn)的全長M1二聚體命名為1aa7c.

3.5H9N2 M1二聚體的電鏡觀測與分析

為獲得用于電鏡分析的蛋白質樣品，用SDS-PAGE 電泳鑒定所純化的H9N2 M1蛋白，結果如圖6所示.由圖可見，A280曲線有4個明顯的峰，樣品區(qū)分度明顯.其中： 第一峰是外水體積；第二峰是M1的多聚體；第三個峰為主峰即二聚體；最后一個峰是易降解條帶.

為獲得M1二聚體形成的信息及其多聚化情況，我們使用200kV FEITECNAI TF20 場發(fā)射透射電鏡下共拍得高清粒子圖片345張，圖片放大倍數為105倍.從中選取了有代表性的高清圖像，如圖7(a)所示.圖中的單個顆粒為M1蛋白，中間有一條極淡的黑色的痕跡的顆粒為蛋白質二聚體，從圖中可以觀察到不同取向的二聚體.另外，從圖中還可以看到體積較大的M1的多聚體.在本工作中，我們主要通過手動觀察的方式選取電鏡圖像上的二聚體顆粒進行三維重構.圖7(b)為二聚體顆粒的2D平均圖及對應的結構模型圖.M1二聚體的分子量約為53kD，用PyMOL測得3種構象1ea3d(1ea3m)，1aa7d(1aa7m)，1aa7c的三維尺寸分別為40?×50?×50?，50?×30?×100?，50?×30?×120?.圖7中顯示的堆疊的粒子大多都呈長方體或立方體，其中間有淡淡的暗線，形狀與下圖的M1二聚體構象有明顯的對應關系.在進行三維重構建模時共迭代8次，結構精修時迭代3次，所得密度圖如圖7(c)所示，分辨率約為14 ?.由圖可見，三維重構密度圖的中心位置與MD模擬中的堆疊式二聚體結構大致相似，其尺寸與同源模建的結構類似，由此我們推測在溶液中堆疊式二聚體構象較多.因此，通過負染電鏡觀察，MD模擬所獲得的全長M1二聚體模型得到了初步驗證.結合MD模擬的結果，我們提出了如圖8所示的M1多聚化的模型.在此模型中，多聚化主要由計算分析所得的3個二聚化界面來驅動，即堆疊式二聚化界面(N端-C端)，兩種平行式二聚化界面(N端-N端和C端-C端).

4討論

雖然M1蛋白N 端片段的二聚體結構已有報道[12,14]，但由于M1蛋白C端片段易降解等原因，全長M1晶體結構還沒有被解析.因此，在本研究中，我們采用理論計算和負染電鏡相結合的手段對其二聚化的模式進行研究.報道中M1蛋白N端片段晶體結構的二聚化模式主要有平行式和堆疊式兩種，故MD模擬時我們選擇這兩種模式作為初始模型.MD模擬的結果表明，全長M1的C 端片段的RMSF要高于N 端片段，這說明C端片段的結構柔性要高于N端，這也在一定程度上解釋了全長晶體結構難以獲得的原因.還有，通過分析了全長M1二聚體界面氨基酸的接觸頻率，了解二聚體界面的基本信息.在堆疊式結構中，二聚化界面氨基酸在N端與C端片段都有分布，其中，N端界面氨基酸與晶體學數據一致；對于平行式(N端-N端)全長M1二聚體來說，界面氨基酸多存在于77～134aa之間，與晶體結構的結果也保持一致.特別地，當對平行式二聚體結構進行進一步分析時，發(fā)現(xiàn)了另一個二聚化界面，其界面氨基酸主要由C 端片段氨基酸組成，因而獲得了第三種M1全長二聚體的結合方式，如圖5(e)所示.

另一方面，通過負染電鏡方法分析了M1全長二聚體的真實構象，發(fā)現(xiàn)了與此模型一致的多聚體，如圖7(a)右上方白色箭頭部分.因此，綜合了理論計算與實驗結果而提出的多聚化模型(圖8)與天然狀態(tài)下M1的自組裝是基本相符的.

綜上所述，本文工作揭示了全長M1蛋白二聚化的3種可能模式，并由此提出了M1蛋白的多聚化模型，為理解M1聚合形成流感病毒衣殼的機理提供了有價值的結構信息，也為進一步了解流感病毒的組裝過程提供了重要基礎.

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文章編號：0427-7104(2016)03-0388-08

收稿日期：2015-07-20

基金項目：國家自然科學基金(91430112)，上海市自然科學基金(13ZR1402400)

作者簡介：張一堪(1988—)，男，碩士研究生；黃強，男，教授，通訊聯(lián)系人，E-mail： huangqiang@fudan.edu.cn.

中圖分類號：Q 71

文獻標志碼：A

Dimerization Mechanisms of Influenza A Virus Matrix Protein M1

ZHANG Yikan1， CAO Mi2， LIU Jianping1， HUANG Qiang1,3

(1.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China;2.NationalCenterforProteinScienceatShanghai,Shanghai201203,China;3.ShanghaiCollaborativeInnovationCenterforBiomanufacturingTechnology,Shanghai200237,China)

Abstract：Influenza A virus matrix protein 1(M1) forms the viral capsid under the viral membrane，and interacts with hemagglutinin(HA)，neuraminidase(NA)，membrane and RNA simultaneously. However，crystal structures are only available for the N-terminal segment of M1. Little is known about the dimerization of the full-length M1 proteins that is required for the polymerization to form the capsid. To understand the dimerization mechanism of M1，here we used homology modeling to predict the structure of the full-length M1 on the basis of the N-terminal structure. Then，we carried out molecular dynamics(MD) simulation for the possible M1 dimers，and analyzed the amino acids of the dimerization interfaces. The results of MD simulation indicated there is a new dimerization interface formed by the interactions of two M1 C-terminal segments. To verify the results，we analyzed the M1 dimers by the single-particle 3D reconstruction of electron microscopy，and thereby presented a mechanistic model for the M1 polymerization.

Keywords：influenza A virus; matrix protein M1; dimerization; molecular modeling; single-particle 3D reconstruction