苗巍男，李　瑞，鐘　江，鄭兆鑫，劉明秋

(復旦大學 生命科學學院，上海 200438)

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含FMDV中和表位的重組病毒顆粒的構建及鑒定

苗巍男，李瑞，鐘江，鄭兆鑫，劉明秋

(復旦大學 生命科學學院，上海 200438)

摘要：針對FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重點，而病毒樣顆粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似傳統(tǒng)滅活疫苗的良好免疫效果，近年來逐漸成為疫苗研究的一個新方向.本實驗利用豬圓環(huán)病毒PCV2的衣殼蛋白(CAP)作為載體，分別插入FMDV MYA98毒株的抗原表位組合——VP1蛋白上B細胞表位141～160aa(B)與串聯(lián)的B細胞和T細胞表位141～160aa-21～40aa-141～160aa(BTB)，構建對應重組桿狀病毒，分別命名為reBAC-CAP-B，reBAC-CAP-BTB.將上述病毒顆粒轉入Sf9細胞表達，收獲重組桿狀病毒并再次感染Sf9細胞擴大病毒滴度，獲得目的蛋白CAP-B，CAP-BTB，經過SDS-PAGE，Western blot鑒定正確，透射電鏡觀察到20～30 nm大小的目的顆粒.

關鍵詞:口蹄疫病毒； 豬圓環(huán)病毒； 病毒樣顆粒； 抗原表位； 桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease， FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus， FMDV)引起的一種偶蹄類動物所患的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1].FMDV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，是最小的動物病毒之一.按血清學分類，口蹄疫病毒目前可以分為7種血清型： O、A、C型(歐洲型)，SAT1、2、3型(非洲型)，AsiaⅠ型(亞洲型)；每種血清型內又包含許多亞型[2].不同血清型間不能交叉保護，同一種血清型中不同亞型也有變化，不一定能交叉保護.由于該病傳播途徑多，傳染速度快，并且病毒易變異，已被國際獸醫(yī)局(OIE)列為A類傳染病之首[3]；許多國家盡管投入了大量的人力、物力和財力進行預防和控制，然而該病仍在流行；因此針對口蹄疫預防及治療的研究一直是一個熱點.在我國主要流行的血清型之一是O型FMDV，其中近年來廣泛爆發(fā)的是MYA98亞型毒株[4].

疫苗免疫是預防FMDV爆發(fā)的重要手段之一，可以在疾病暴發(fā)時快速誘導免疫動物產生中和抗體，從而保護動物免于病毒感染[5].傳統(tǒng)疫苗為滅活疫苗，具有免疫原性高，生產、儲存、運輸方便等優(yōu)點，但是滅活不徹底則容易造成散毒，制作過程需要很高的防護措施以防病毒泄露是滅活疫苗的重大缺點[6].近年來隨著基因工程和蛋白質工程技術的不斷發(fā)展，逐漸衍生出基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗等新疫苗種類.

其中病毒樣顆粒(Virus-Like Particles， VLPs)是一種新興的具有巨大潛力的疫苗形式.病毒樣顆粒即含有一種或多種病毒結構蛋白的空心顆粒，它具有和野生病毒相似的顆粒結構和抗原性，但不含相關病毒基因[7].VLPs具有安全性高(不含病毒核酸)、免疫原性高、結構利于抗原呈遞、穩(wěn)定性好、能作為載體插入外源片段、可以用來區(qū)分免疫動物和感染動物等優(yōu)點[8].目前已有多種公司研發(fā)的VLPs形式的疫苗上市銷售.VLPs作為疫苗的潛力已被各項研究充分地證明，并且仍擁有著廣闊的發(fā)展前景和巨大的潛力，在基礎研究中也充滿著潛力，為科學研究開辟了新的探索領域[9-10].

豬圓環(huán)病毒(Procine CircoVirus， PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是迄今為止已知最小的動物病毒[11]，該病毒顆粒無囊膜，呈二十面體結構.其ORF2編碼的CAP蛋白是病毒最主要的結構蛋白和免疫原[12]，CAP蛋白C端含有較多的轉角結構，位于病毒顆粒表面，因此也是優(yōu)勢抗原表位所在[13].單獨CAP蛋白已被證明能組裝成病毒顆粒，且能插入外源片段表達，并具有生物活性[14-15]，插入的外源片段最大約為20aa左右.

本實驗采用PCV2的外殼蛋白CAP作為載體，在C端插入兩種不同的FMDV中和表位組合-MYA98亞型VP1蛋白上B細胞表位141～160aa(B)與串聯(lián)的B細胞和T細胞表位141～160aa-21～40aa-141～160aa(BTB)，將構建的重組桿狀病毒在草地夜蛾Sf9細胞系內擴增并驗證了CAP蛋白C端所能容納的外源片段大小，期望為進一步構建含有FMDV表位的VLPs疫苗奠定基礎.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株、細胞與質粒

大腸桿菌菌株E.coliDH5α由本實驗室保存；草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)卵巢細胞Sf9，大腸桿菌E.coliDH10Bac，pFastBac-1載體由復旦大學鐘江教授提供.

1.1.2主要試劑

限制性內切酶，T4 DNA連接酶體系購自New England Biolabs公司；pMD-18T試劑盒購自TaKaRa公司；PCR體系(pfu酶，taq酶，PCR buffer，dNTPs等)購自北京天根生化科技有限公司；質粒小量抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司；TNM-FH培養(yǎng)基購自Sigma公司；胎牛血清購自Thermo Fisher公司；Cellfectin Ⅱ轉染試劑，購自Invitrogen公司；豚鼠抗FMDV MYA亞型血清來自內蒙古金宇保靈生物藥品有限公司；辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase， HRP)偶聯(lián)羊抗豚鼠抗體購自proteintech公司；ECL化學發(fā)光顯色試劑盒購自GE公司.

表1　實驗中使用的引物序列

注： 劃線部分為酶切位點.

1.1.3引物和序列

FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010(MYA98亞型)VP1上的21～40aa和141～160aa的核苷酸序列(GenBank： JN998085.1)由上海捷瑞生物工程有限公司經由昆蟲細胞密碼子優(yōu)化后合成，命名為BTB；PCV2 CAP基因(GenBank： ACZ06084.1)由上海農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所易建中老師提供；實驗過程所用引物由上海賽百盛基因技術有限公司合成，見表1.

1.2方法

1.2.1CAP-B和CAP-BTB基因的克隆

分別從公司合成的含有BTB基因的載體和含有CAP基因的載體上擴增出BTB和CAP基因(使用的引物分別為btb-F/btb-R和cap-F/cap-R)，然后通過重疊PCR(合成的BTB基因N端含有CAP基因C端一部分序列)獲得CAP-BTB序列(使用的引物為cap-F/btb-R)，測序確認.再利用cap-F/b-R引物從測序正確的CAP-BTB序列上擴增出CAP-B序列，測序確認后分別保存.

1.2.2質粒pFB-CAP-B和pFB-CAP-BTB的構建

將CAP-B基因和pFastBac1載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收后進行連接，將連接產物轉入感受態(tài)E.coliDH5α后，挑取陽性克隆測序確認，抽取質粒并命名為pFB-CAP-B；同樣方法獲得pFB-CAP-BTB.

1.2.3重組桿狀病毒質粒reBAC-CAP-B和reBAC-CAP-BTB的獲得

分別將質粒pFB-CAP-B和pFB-CAP-BTB轉化入E.coliDH10 Bac感受態(tài)細胞內，借由質粒上的Tn5轉座單位和細胞內輔助質粒的功能將目的基因轉座到桿狀病毒載體Bacmid上.經由抗生素(卡那霉素，四環(huán)素，慶大霉素)和藍白斑篩選后，提取重組桿狀病毒質粒，分別利用目的基因的特異性引物和載體上的M13通用引物進行PCR鑒定，分別命名為reBAC-CAP-B和reBAC-CAP-BTB.

1.2.4重組病毒樣顆粒的表達

將2種重組桿狀病毒質粒分別轉染至對數期Sf9昆蟲細胞，當細胞出現明顯病變時，收獲培養(yǎng)基上清，500g離心5～10min收取上清，即為P1代毒株；再用P1代毒株感染細胞獲得滴度較高的P2代毒株；P2代毒株再次感染細胞(MOI=1～5)即可表達重組病毒樣顆粒，分別命名為CAP-B和CAP-BTB.

1.2.5SDS-PAGE及Western blot鑒定

用P2代感染細胞，當有明細病變時，收獲細胞，PBS洗2次，500g離心5～10min收獲細胞沉淀，加入SDS-PAGE loading Buffer混勻后進行SDS-PAGE驗證.同時電轉硝酸纖維素膜進行Western blot鑒定，用含5% 脫脂奶粉的PBST(含0.1% Tween-20的PBS)封閉液封閉2h，加入按效價稀釋的豚鼠抗FMDV MYA98亞型血清的一抗孵育1h，PBST洗3次，每次5min；加入HRP標記的羊抗豚鼠IgG二抗孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用ECL化學發(fā)光試劑盒進行顯色分析.

1.2.6透射電鏡觀察VLPs形態(tài)

將P2代感染后的細胞經過超聲波破碎，離心后取沉淀樣品少許溶于PBS制成懸浮液，滴在載樣銅網上，使用2%的磷鎢酸負染3～5min，吸去多余液體，室溫干燥后使用透射電鏡(TEM)進行觀察.

2結果與分析

2.1CAP，BTB及重組基因CAP-B，CAP-BTB擴增產物的鑒定

CAP和BTB基因全長分別為705bp和243bp，分別用cap-F/cap-R和btb-F/btb-R引物進行擴增后，瓊脂糖凝膠電泳分析結果見圖1(a)，條帶大小均正確.CAP和BTB基因在CAP基因C端重疊21bp，利用引物cap-F/btb-R通過重疊PCR獲得CAP-BTB基因，全長為930bp，再用cap-F/b-R引物從CAP-BTB基因上擴增出CAP-B序列，全長為771bp，電泳分析結果均正確(圖1(b),(c)).所有結果均測序并比對標準序列確認.

2.2重組桿狀病毒質粒的構建及鑒定

挑選轉座后白斑抽取重組桿狀病毒質粒，分別獲得reBAC-CAP-B和reBAC-CAP-BTB；分別利用M13引物(桿狀病毒質粒上自帶引物，見圖2(a)(見第384頁))和序列對應的特異性引物進行PCR鑒定；M13引物PCR產物理論大小分別為3100bp和3200bp，特異性引物PCR產物結果分別為771bp和930bp，結果見圖2(b)、(c)(見第384頁)，均在目的大小位置看到對應條帶，說明重組桿狀病毒質粒構建成功.

2.3重組桿狀病毒毒株的獲得

用rBAC-CAP-B和rBAC-CAP-BTB分別轉染sf9細胞，3～4d后細胞停止生長，體積變大，內部出現顆粒體(小泡)，晚期細胞脫落或破碎，大量死亡；陰性對照組細胞正常生長，說明重組病毒轉染成功，見圖3(見第384頁)(結果未完全列出).待細胞大部分明顯病變后收獲病毒毒株，即P1代毒株，用于接下來的擴增.

2.4重組病毒樣顆粒的SDS-PAGE和Western blot結果

使用P2代毒株感染細胞，收獲細胞進行SDS-PAGE鑒定.根據軟件預測， CAP-B蛋白約為30kD，CAP-BTB約為36kD.如圖4(a)，各樣品在預計大小位置有明顯目的條帶，且陰性對照空細胞和空載體在相應位置無明顯條帶，說明目的蛋白成功表達.

使用豚鼠抗FMDV MYA98亞型血清作為一抗進行Western blot，在CAP-B和CAP-BTB實驗組均可以觀察到特異性條帶(圖中向下箭頭指示位置)，而陰性對照均無對應條帶，見圖4(b).圖中除目的條帶位置處有其他條帶，是因為所用一抗為多抗造成的非特異性雜帶，沒有特異性條帶反應強烈，不影響實驗結論.結果說明表達的重組病毒樣顆粒均具有良好的免疫反應性.

2.5重組病毒樣顆粒的電鏡觀察

表達的2種重組VLPs樣品經過磷鎢酸負染后，在透射電鏡下觀察結構.PCV2病毒顆粒大小理論上直徑為17～20nm，預估插入了外源片段后，CAP-B的大小為20～25nm，CAP-BTB大小為20～30nm.圖5中可見，觀察到的顆粒與預測大小一致，證明了重組病毒形成了VLPs結構.圖中有些較大的顆粒可能是多個蛋白聚在一起沒分開導致的，屬于正?，F象.

3討論

多種病毒，包括包膜病毒、無包膜病毒、人類病毒、植物病毒、動物病毒等均已證明在各種表達系統(tǒng)中內能正常表達并正確組裝成顆粒結構[16-17].桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)具有安全性好、可容納的外源片段大、表達效率較高、蛋白質翻譯后修飾與哺乳動物細胞類似等優(yōu)點[18-19].Invitrogen公司的bac-to-bac系統(tǒng)就是采用這一體系的轉座子介導的桿狀病毒-昆蟲細胞重組系統(tǒng).目前已有多種利用該系統(tǒng)表達的VLPs疫苗正式上市.因此本實驗采用昆蟲細胞系統(tǒng)表達目的蛋白.

PCV2的ORF2編碼的CAP蛋白是其最主要的結構蛋白，已被證明在不同表達體系中均能正確折疊成天然顆粒結構，且有一定的容納外源片段(約20aa)的能力[14-15].理論上，在C端插入的序列是暴露或者部分暴露在VLPs顆粒的表面，所以對結構的形成影響不大.目前關于FMDV的VLPs研究多使用P1-2A-3C形式構建完整FMDV病毒顆粒，也有在其他病毒外殼蛋白插入結構蛋白或表位的構建方式[20-22].研究表明，FMDV復合多表位組合可誘導強烈的免疫反應，其中VP1蛋白上的21～40aa為常見的T細胞表位[23]，141～160aa位于暴露在表面的G-H環(huán)區(qū)域，是常見的經典B細胞表位之一[24].因此本實驗采用在C端插入兩種不同表位組合(單表位和三表位串聯(lián))的不同方式構建重組VLPs，成功獲得重組毒株并表達蛋白CAP-B，CAP-BTB，在預期蛋白質大小位置分別可看到對應的條帶，并且在使用口蹄疫病毒血清的Western blot實驗中CAP-B，CAP-BTB都有免疫反應，證明了表達的蛋白具有免疫反應性.在電鏡觀察結果中看到重組VLPs均形成了顆粒狀結構，近似天然病毒.說明重組病毒具備形成顆粒結構的能力，PCV2 VLPs能容納長達70aa的外源片段.

理論上桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)表達的外源性蛋白應該可溶，大部分的實驗也證明了這點.但是本實驗提取的重組病毒樣顆粒均不溶于緩沖溶液(PBS，TNE等溶液)中，即使在裂解細胞時采取了超聲破碎、反復凍融、細胞裂解液等辦法，但是蛋白仍然存在于裂解后離心下來的沉淀中.對重組病毒樣顆粒的等電點進行分析，中和緩沖液pH有一定的差距；且重組病毒樣顆粒上無核定位和膜定位信號，因此理論上不會形成膜融合蛋白或者核內蛋白.蛋白質的溶解情況可能與蛋白質本身性質、表達量、裂解條件有一定的關系.大部分的研究本身表達的蛋白均可溶，因此對不溶的情況研究較少，楊林等在2000年對昆蟲細胞表達的GST融合蛋白的可溶性進行了一定研究，發(fā)現本身不溶的蛋白在提高裂解液非離子去垢劑(如Triton-X100)濃度以及加入十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)后有約20%～30%的蛋白質變?yōu)榭扇躘25].Crisci等在2012年利用該系統(tǒng)表達VLPs時，裂解細胞時分別加入了DNase Ⅰ和Sarkosyl處理[22]，研究本身并未提及表達的VLPs是否存在不溶的情況，但是這些處理方式為以后的實驗改進提供了新的方向.此外也可以考慮更換細胞系，如高表達量的High Five、哺乳動物細胞等，或者引入引導序列使得蛋白質可以分泌表達等方法.

本實驗構建了含有FMDV抗原表位的重組病毒顆粒載體，并表達了具有免疫反應性及能夠形成顆粒結構的重組VLPs，驗證了PCV2 CAP蛋白在C端插入了70aa的外源片段后仍能形成VLPs，為進一步利用該載體表達多表位抗原奠定了基礎.雖然存在著蛋白質不可溶的問題，但可以考慮直接加入佐劑進行動物實驗檢測免疫效果，同時嘗試著更換條件以期望得到可溶的蛋白質.

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文章編號：0427-7104(2016)03-0381-07

收稿日期：2015-07-28

基金項目：教育部留學回國人員科研啟動基金；上海市科學技術委員會項目(13DZ2252000)

作者簡介：苗巍男(1992—)，男，碩士研究生；劉明秋，女，副教授，通訊聯(lián)系人，E-mail： liumq@fudan.edu.cn.

中圖分類號：Q 78

文獻標志碼：A

Construction and Identification of Recombinant Virus-like Particles Fused with Neutralizing Epitopes of FMDV

MIAO Weinan， LI Rui， ZHONG Jiang， ZHENG Zhaoxin， LIU Mingqiu

(SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Abstract：The study on vaccine of FMDV is always a hot spot in world. Recent years, VLPs became a new direction of vaccine study, for its safety and good ability of protection against virus compared to traditional vaccines. Two kinds of neutralizing epitopes of type O FMDV MYA98, single B antigen epitope on VP1 141—160 aa(B) and the combination of B antigen epitope and T antigen epitope 141—160 aa-21—40 aa-141—160 aa(BTB) epitopes, were inserted into CAP vector protein from PCV2 to construct the recombined Bacmids reBAC-CAP-B, reBAC-CAP-BTB. These recombined Bacmids were transfected into Sf9 cells to express fusion proteins CAP-B，CAP-BTB respectively. After amplifying the viral stock, the high-titer stock was infected to cells for protein expression. The results of SDS-PAGE, Western blot and TEM showed that the proteins with the right molecule size had the specific immunogenicity and were assembled into VLPs successfully.

Keywords：FMDV; PCV; VLPs; antigen epitope; baculovirus-insect cell expression system