歐志英　吳韶清　尹應先　李麗霞　周榮　徐翼　龔四堂

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一種初步快速甄別總腸道病毒的基因分型方法

歐志英★吳韶清尹應先李麗霞周榮徐翼龔四堂

［摘要］目的建立并驗證總腸道病毒5′?非編碼區(qū)（5′?non coding region,5′?NCR）PCR擴增測序并在NCBI數據庫比對進行生物信息分析的方法，為手足口病的早期快速診斷提供敏感、高效的總腸道病毒分子分型檢測方法。方法收集165例臨床檢測陽性的標本，提取總RNA擴增人腸道病毒A、B、C和D型5′端非編碼區(qū)用于總腸道病毒初步基因分型，PCR產物測序并在Genbank中進行BLAST分析。結果成功從臨床咽拭子標本中擴增了5′?NCR用于基因分型。165例總腸道病毒陽性標本中鑒定出12種腸道病毒類型，有77例人腸道病毒（enterovirus type 71，EV?71），37例人柯薩奇病毒（coxsackievirus，CV）CV?A16，31例CV?A4，20例其它型別。結論5′?NCR PCR測序是總腸道病毒基因分型和監(jiān)測的敏感、簡單、早期、快速的檢測方法。

［關鍵詞］手足口病；腸道病毒；分子流行病學；分子分型

手足口病是常見的兒童急性感染性疾病，主要由腸道病毒（enterovirus,EV）感染引起［1］，過去幾十年在亞太地區(qū)很常見，曾在馬來西亞、臺灣、新加坡、中國大陸爆發(fā)流行［2?3］，導致成千上萬兒童死亡，大多數患者癥狀較輕，為一過性自限疾病，少數癥狀嚴重。感染后大部份患者會出現發(fā)燒，體溫超過38.5℃［4］，并伴有手、足、口腔部位皮疹、皰疹、潰瘍?yōu)榈湫捅憩F［5］，個別重度感染可引起肺水腫、病毒性腦膜炎或腦膜腦炎、皰疹性咽峽炎、病毒性心肌炎甚至死亡［6］。

腸道病毒在分類上屬微小核糖核酸（RNA）病毒科，人腸道病毒由至少72個血清型組成，種類有人脊髓灰質炎病毒、人柯薩奇病毒（coxsacki?evirus，CV）A組、B組、?？刹《荆‥cho）和新型腸道病毒。人柯薩奇病毒A組有1~22型和24型，B組有1~6型，新型腸道病毒有68~72型［7-8］。大多數手足口病是人柯薩奇病毒和新型腸道病毒感染引起［5］，人柯薩奇病毒A16型和EV?71是最常見類型。

近些年手足口病發(fā)病有上升趨勢，呈普遍性、爆發(fā)性流行，危害兒童健康發(fā)展。臨床上手足口病感染無特異、高效的疫苗和治療藥物，只能對癥支持治療，積極防止發(fā)生并發(fā)癥。早確診、早治療是該病愈后的關鍵。目前手足口病實驗室檢測的方法有病毒分離培養(yǎng)、血清學實驗、核酸分子檢測，確診的金標準仍然是病毒分離培養(yǎng)。病毒分離培養(yǎng)和血清學實驗耗時較長，核酸分子檢測一般針對EV?71和/或CV?A16進行檢測，不利于疾病診斷、監(jiān)測和治療，亟待開發(fā)簡單、高效、快速診斷的對總腸道病毒進行檢測和分型的試劑。本研究的目的是建立并驗證總腸道病毒5′?非編碼區(qū)（5′?non coding region，5′?NCR）PCR擴增測序并在NCBI數據庫進行生物信息比對分析的方法，為手足口病的早期快速病原診斷提供敏感、高效的總腸道病毒分子分型檢測方法。

1　材料與方法

1.1臨床標本及RNA提取

2008年5月至7月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心收集165例臨床檢測陽性的手足口病門診患者的咽拭子標本。取200 μL咽拭子浸出液，用RNA提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini kit（Qiagen，美國）提取總RNA，最后溶解在無菌、無RNA酶的DEPC水中。

1.2引物設計

通過生物信息比對分析，在NCBI數據庫中找出所有腸道病毒核酸序列，在其保守區(qū)，即5′?NCR設計了一對簡并引物：上游引物PEF：5′?AYCYTT?GTRCGCCTGTTTT?3′，下游引物PER：5′?CCCA AAGTGTCGGTTCCGC?3′（圖1）。血清型包括CV?A1~A24型、B1~B6型，EV?71的Taiwan、Shenzhen、Korea、Singapore病毒株，?？刹《?~7、9、11~17、19~22、24~26和29~33型。

1.3RT?PCR

50 μL一步法RT?PCR擴增體系包含：1×一步法RNAPCR緩沖液、上下游引物濃度分別為0.3μM、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTP、40 U Rnase抑制劑、5 U AMV逆轉錄酶XL、5 U AMV Taq DNA聚合酶、8 μL RNA模板。逆轉錄條件為：94℃預變性2 min，50℃30 min；PCR擴增條件94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s；共35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳、0.5 mg/mL EB染色。

1.4PCR產物純化和測序分析

PCR產物膠分離后用割膠純化試劑盒QIA?quick Gel Extraction kit（Qiagen，美國）純化。測序試劑盒為ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Se?quencing Ready Kit（Applied Biosystems Inc.，美國），測序儀為Genetic Analyzer 377（Applied Bio?systems Inc.，美國）。

1.5序列解讀

每個臨床標本5′?NCR PCR?測序所得序列都與NCBIGenBank（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）中的各型人腸道病毒血清型序列兩兩比對，根據查詢覆蓋得分和同一性得分得出各標本的血清型。本研究中501 bp的5′?NCR序列一致性得分大于91%時被視為同一腸道病毒血清型。

1.6敏感性和特異性

EV?71病毒標準株純化培養(yǎng)用于檢測本方法的靈敏性，病毒滴度分別稀釋為1×106、1×105、1× 104、1×103、1×102、1×101和1×100拷貝數/μL，RNA分別提取并用一步法擴增。同時用EV?71和CV?A16的陽性標本、非腸道病毒標本流感A、流感B、呼吸道合胞病毒、皰疹病毒檢測了本方法的特異性。

1.7統(tǒng)計學分析

數據的統(tǒng)計評價用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，P<0.05被視為有顯著差異。

2　結果

2.1一步法RNA PCR

簡并引物成功地擴增了臨床標本，具有特異、有效的特點，擴增片段長度為501 bp，符合我們的設計（圖2）。

2.2手足口病患者血清型分布

本研究165例腸道病毒感染陽性，其中77例EV?71（46.67%）、31例CV?A4（18.79%）、37例CV?A16（22.42%）、20例（12.12%）其他腸道病毒血清型，序列同源性基本達到97%以上（表1）。5′?NCR PCR產物測序成功，獲得12種腸道病毒血清型。

2.3敏感性和特異性

用EV?71病毒檢測本方法靈敏性，結果表明本方法能成功擴增1×108拷貝數/μL、1×107拷貝數/ μL、1×106拷貝數/μL、1×105拷貝數/μL、1×104拷貝數/μL、1×103拷貝數/μL，PCR條帶的亮度隨病毒滴度下降而變弱（圖3），本方法能有效擴增EV?71和CV?A16，其他病原體流感A、流感B、腺病毒、呼吸道合胞病毒、皰疹病毒未擴增出任何條帶（圖4）。

3　討論

手足口病是一類伴發(fā)熱的疾?。w溫大于37.5℃），是相對溫和的自限性疾病，過去幾十年頻繁爆發(fā)，而且呈現出上升趨勢，也有重癥死亡的病例，成為亞太地區(qū)重要的公共衛(wèi)生問題，手足口病重癥致死與腸道病毒血清型有關，主要是腸道病毒A型感染引起。CV?A16、EV?71、Echo和CV?B組是最常見的病因［9-11］。CV?A16最早于1957年在加拿大分離獲得［12］，1968至1974年日本爆發(fā)手足口病主要是CV?A16引起［13］。20世紀70年代以后EV?71成了手足口病的主要病因［14］。本文提供了總腸道病毒同時檢測的方法，2008年5月至7月在我們醫(yī)院就診患者中手足口病爆發(fā)時檢出EV?71和CV?A16為主（表1），EV?71感染可引起病毒性腦炎或腦膜腦炎，CV?A16感染可引起病毒性心肌炎，因此結合臨床癥狀，早期病原監(jiān)測為患者爭取更多的時間用于臨床治療意義重大。

腸道病毒鑒定的金標準是病毒分離和培養(yǎng)，隨后用中和實驗確定血清型。這一傳統(tǒng)的診斷方法有其缺點：（1）耗時、費力，時間長；（2）64種血清型抗體庫中只有40種抗體，有時存在交叉反應；（3）全球范圍30年前制備的抗血清有限；（4）毒株或抗原變異導致抗體凝集［15-16］；（5）有些腸道病毒在細胞中復制能力較差難以分型；（6）當需要更深入地了解更多詳細的病毒特征時，需要同時接種多種細胞株進行病毒分離培養(yǎng)，找出敏感的細胞株，耗時費力，工作量非常大［17］。

腸道病毒分子流行病學分析通常是以衣殼蛋白VP1為基礎分析，VP1具有型特異性［15-16，18］，在疾病爆發(fā)早期能繞過病毒分離培養(yǎng)，有助于集中有限的資源，快速鑒定病例之間的流行病學關聯分析。VP1基因分析方法只針對一種血清型設計，一次分析無法針對所有的腸道病毒血清型，而且擴增效率不高，擴增片段短，簡并引物不適合直接PCR產物測序、VP1基因序列存在復雜變異等缺點限制了VP1在總腸道病毒分析中的應用，總腸道病毒基因分型需要多對引物和多個反應才能完成，目前沒有快速有效的針對總腸道病毒進行基因分型的方法。在疾病爆發(fā)時總腸道病毒分析變得復雜，單個的VP1基因分析不足以監(jiān)測和甄別不同類型的總腸道病毒。研究表明5′?NCR的系統(tǒng)發(fā)生與腸道病毒血清型無直接關系［19］。但我們通過對所有腸道病毒序列比對分析表明，5′?NCR存在高度同源性，但各血清型之間也存在差異性，于是在總腸道病毒的保守區(qū)設計引物擴增，確保單管單反應能擴增出所有腸道病毒血清型，我們的結果表明該方法能特異地擴增總腸道病毒，以不同病毒滴度的EV?71驗證本方法的靈敏度，1×103拷貝數/μL的標本能成功擴增，方法學上達到了目前PCR方法的靈敏度標準。

表1　手足口病病例和腸道病毒血清型分布Table 1　Distribution of HFMD case and enterovirus serotypes

腸道病毒血清型鑒定對臨床患者管理有一定的意義，分子分型還可以在疾病監(jiān)測方面提供有價值的流行病學信息。通過我們建立的PCR?測序方法從臨床樣本中鑒定了CV A型、CV B型、EV?71的不同分離株和?？刹《?。從研究結果可知有12種腸道病毒與2008年手足口病爆發(fā)有關，其中EV?71 和CV占的比例最大，可能是引起此次爆發(fā)的主要病原。

我們所建立的方法優(yōu)點在于，首先是基于單管單反應，其次是一步法RT?PCR擴增測序獲得了501 bp的擴增片段，含746核苷酸的5′?NCR是腸道病毒基因組的重要區(qū)域，負責起始RNA合成、病毒蛋白表達調節(jié)，是一個相對穩(wěn)定的區(qū)域，對病毒宿主反應和致病性至關重要，具有91%以上同源性的序列分析表明501 bp擴增片段可以保證血清分型的準確性和特異性。獲取臨床標本后，1 h內完成RNA提取，RT?PCR擴增2 h內完成，測序也在3 h內完成，所以一旦有手足口病疫情，不管是哪一種腸道病毒引起，一天之內就可以出具分析報告，指導臨床治療和衛(wèi)生決策。綜上所述，本方法具有快速、方便、準確、高效的特點。

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★通訊作者：歐志英，E?mail：ou_zhiying@qq.com

基金項目：廣東省自然科學基金（S2012010009538,2016A030313501）；廣州市婦女兒童醫(yī)療中心博士啟動基金（2008031）

作者單位：廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東，廣州510623

A rapid genotyping assay for primary total enterovirus screening

OU Zhiying★,WU Shaoqing,YIN Yingxian,LI Lixia,ZHOU Rong,XU Yi,GONG Sitang
(Guangzhou Women and Children′s Medical Center,Guangzhou,Guangdong,China,510623)

［ABSTRACT］ObjectiveTo establish and verify an anaytical method for total enterovirus genotyping.Through 5’?non coding regions PCR amplification,sequencing and Blast in NCBI databases,this method aims to provide a sensitive,efficient and early rapid genotyping detection for hand,foot and mouth disease.MethodsThroat swab samples from 165 cases of HFMD are collected for RNA extraction.Direct total enterovirus genotyping was carried out by amplifying the 5′?non coding region of human enterovirus species group A,B,C and D.PCR products were sequenced and blasted in Genbank.ResultsThe 5′?non coding region was successfully amplified for total enterovirus genotyping.12 types of enterovirus were successfully identified from 165 positive clinical cases.There are 77 cases of EV?71,37 cases of CV?A16,31 cases of CV?A4,20 cases of other types.ConclusionThe 5′?non coding region PCR?sequencing is a sensitive,simple, early,and rapid method for HFMD pathogen genotyping and surveillance.

［KEY WORDS］Hand,foot and mouth disease(HFMD);Enterovirus;Molecular epidemiology; Genotyping