楊小猛　趙丹　杜麗偉　陳相　江麗芳

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Ⅱ型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1多克隆抗體制備和免疫特征分析

楊小猛1趙丹2★杜麗偉1陳相1江麗芳3

［摘要］目的制備抗Ⅱ型登革病毒（dengue virus type 2，DENV2）非結(jié)構(gòu)蛋白1（nonstructural protein 1，NS1）多克隆抗體，分析該抗體的免疫特性。方法采用NS1蛋白免疫BALB/c小鼠，取血分離血清，純化獲得抗NS1抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分析抗NS1抗體與NS1蛋白和DENV2結(jié)合特性。免疫熒光法測定抗NS1抗體與人微血管內(nèi)皮細胞株1 （human microvascular endothelial cell 1，HMEC?1）的交叉反應(yīng)性。ELISA法分析抗NS1抗體、HMEC?1和新鮮同系小鼠血清共培養(yǎng)體系中活化補體的含量。結(jié)果抗NS1抗體能與NS1和DENV2特異性結(jié)合，抗體最高滴度分別為1∶1 280和1∶640?？筃S1抗體能與HMEC?1細胞交叉結(jié)合，抗NS1抗體、HMEC?1和新鮮同系小鼠血清共培養(yǎng)上清液中C3a、C4a、C5a和sC5b?9含量均顯著高于HMEC?1和新鮮同系小鼠血清共培養(yǎng)（均P<0.05），以及PBS、HMEC?1和新鮮同系小鼠血清共培養(yǎng)（均P<0.05）。結(jié)論抗DENV2 NS1抗體能交叉結(jié)合于血管內(nèi)皮細胞并激活補體系統(tǒng)，可能在登革出血熱的免疫病理機制中起重要作用。

［關(guān)鍵詞］Ⅱ型登革病毒；非結(jié)構(gòu)蛋白1；抗非結(jié)構(gòu)蛋白1抗體；膜攻擊復(fù)合物

登革病毒（dengue virus，DENV）特異性抗體可以通過3種機制清除病毒：病毒中和效應(yīng)、補體依賴的細胞毒效應(yīng)和抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)［1］。然而DENV特異性抗體也可能引起免疫損傷，免疫機制或自身免疫機制可能與DENV感染的致病機制有關(guān)［2］。研究表明，DENV非結(jié)構(gòu)蛋白1（nonstructural protein 1，NS1）與病毒感染宿主的血小板和血管內(nèi)皮細胞存在相似的抗原表位，抗DENV NS1抗體可能破壞宿主的血小板和血管內(nèi)皮細胞［3］，但其具體機制目前仍不完全清楚。為探討抗DENV NS1抗體在DENV感染病理機制中的作用，本研究制備了高效價抗Ⅱ型登革病毒（dengue virus type 2，DENV2）NS1抗體，分析該抗體與人微血管內(nèi)皮細胞1（human microvascu?lar endothelial cell 1，HMEC?1）的交叉反應(yīng)性以及激活補體系統(tǒng)的能力，探討NS1蛋白介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答在登革出血熱的免疫病理機制中的作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物與試劑

SPF級雌性BALB/c小鼠（3~6周齡）購自中山大學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證號為SCXK（粵）2004?0011/粵監(jiān)證字2012A045。RPMI?1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，使用前添加終濃度的10 mmol/L L?谷氨酰胺、10 ng/mL表皮生長因子、1 μg/mL氫化可的松和5%的熱滅活胎牛血清，C3a、C4a、C5a和sC5b?9酶聯(lián)免疫吸附試驗（en?zyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自深圳達科為公司。

1.2基因工程菌和細胞株

含DENV2 NS1基因的基因工程菌（X?33/ pPICZαB?NS1）由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物教研室構(gòu)建并保存。HMEC?1細胞由美國疾病控制與預(yù)防中心贈送。

1.3DENV2 NS1蛋白的表達和抗NS1抗體的制備

參照以往的方法［4］，采用DENV2 NS1基因工程菌表達NS1蛋白。取100 μg NS1蛋白溶于0.25 mL生理鹽水，加入等體積弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔注射BALB/c小鼠。第21天取50 μg NS1蛋白溶于0.25 mL生理鹽水，加入等體積弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔注射BALB/c小鼠。第31天時采用ELISA法測定小鼠血清中抗NS1抗體滴度，若抗體滴度低于1∶10 000，則同第21天方法再次加強免疫。最后采用眼球摘除法收集小鼠血液，離心分離血清。采用二乙氨基乙基纖維素柱純化血清中抗NS1抗體，并經(jīng)0.22 μm的除菌濾器除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4抗NS1抗體與NS1蛋白和DENV2結(jié)合能力分析

取96孔空白平板，第A至D行用NS1蛋白包被，第E至H行用滅活DENV2包被，整板經(jīng)5%胎牛血清4℃封閉過夜。滴度為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560和1∶5 120的抗NS1抗體依次加入第1至10列，滴度為1∶20的抗DENV2多克隆抗體加入第11列，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）加入第12列，每孔100 μL。平板置37℃、45 min，洗板。每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體（滴度為1∶40 000），37℃、60 min，洗板。每孔加入100 μL酶反應(yīng)底物，37℃、40 min，每孔加入50 μL終止液，輕微振蕩混勻，酶標(biāo)儀測定每孔OD450。以PBS孔為陰性對照，按公式計算每孔截斷值（the cut off value，Cut off），Cut off=測定孔OD450/陰性對照孔OD450。以Cut off值≥2.1確定抗體的最高滴度。

1.5抗NS1抗體與HMEC?1細胞的交叉反應(yīng)性分析

HMEC?1細胞爬片培養(yǎng)于RPMI?1640液，待長滿載玻片后，固定液（50%甲醇和50%丙酮）固定載玻片20 min。分成3組，分別滴加100 μL抗DENV E蛋白抗體（抗E抗體，用作無交叉反應(yīng)對照）（滴度1∶10）、抗NS1抗體（滴度1∶10）和抗NS1抗體（滴度1∶50），4℃、30 min。PBS沖洗，滴加100 μL FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體，陰涼避光處30 min，PBS沖洗。采用奧林巴斯BX?51型熒光顯微鏡分析載玻片熒光強度。

1.6抗NS1抗體激活補體活性測定

共培養(yǎng)體系分為抗NS1抗體組、同系小鼠血清組和PBS對照組，每組6瓶。取規(guī)格為25 cm2的直角斜頸透氣培養(yǎng)瓶，HMEC?1細胞培養(yǎng)于RPMI?1640液中。待細胞貼壁長至2/3，無菌吸出培養(yǎng)液?？筃S1抗體組加入1 mL抗NS1抗體、1 mL新鮮同系小鼠血清和3 mL RPMI?1640液，同系小鼠血清組1 mL新鮮同系小鼠血清和3 mL RPMI?1640液，PBS對照組加入1 mL PBS、1 mL新鮮同系小鼠血清和3 mL RPMI?1640液。3組均置于37℃、5% CO2環(huán)境培養(yǎng)6 h。收集上清液，采用ELISA法按試劑盒說明書測定C3a、C4a、C5a和sC5b?9的含量。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用成組設(shè)計的t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1抗NS1抗體制備，抗NS1抗體與NS1蛋白和DENV2結(jié)合能力分析

BALB/c小鼠經(jīng)基礎(chǔ)免疫后第21天，滴度為1∶1 280的抗血清Cut off值為1.49，小于2.1，再次加強免疫。第31天滴度為1∶1 280的抗血清Cut off值為4.35，為獲得較高滴度的抗血清進行后續(xù)實驗，再次加強免疫，第41天滴度為1∶1 280的抗血清Cut off值為10.32（圖1）?？寡褰?jīng)純化處理獲得的抗NS1抗體能與NS1蛋白、滅活的DENV2特異性結(jié)合，抗體最高滴度分別為1∶1 280和1∶640（圖2）。

2.2抗NS1抗體與HMEC?1細胞的交叉反應(yīng)性

當(dāng)?shù)谝豢贵w為抗NS1抗體時，HMEC?1細胞爬片上可見綠色熒光，抗NS1抗體的滴度越大，結(jié)合強度越弱；當(dāng)?shù)谝豢贵w為抗E抗體時，HMEC?1細胞爬片上幾乎無綠色熒光（圖3）。

2.3抗NS1抗體激活補體活性

抗NS1抗體組上清液中C3a、C4a、C5a和sC5b?9的水平均顯著高于同系小鼠血清組和PBS對照組（均P<0.05），而上述指標(biāo)在同系小鼠血清組和PBS對照組間均無顯著性差異（均P>0.05）（表1）。

3　討論

DENV感染可導(dǎo)致宿主發(fā)生登革出血熱/登革休克綜合征，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的血小板減少、血漿滲漏和肝腫大［5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)免疫或自身免疫反應(yīng)在DENV感染的致疾機制中發(fā)揮重要作用［6?7］，病毒感染導(dǎo)致的自身免疫病病理機制仍不明確，目前認為與分子模擬、旁觀者激活和病毒持續(xù)感染等因素有關(guān)［8］。

自身免疫反應(yīng)是DENV感染所致疾病的一種重要機制，而NS1蛋白以及抗NS1抗體在這一機制中尤為關(guān)鍵［9-10］。NS1蛋白是DENV重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒生存必需的，其確切功能還不清楚。NS1蛋白是一種高度保守的糖蛋白，以可溶性形式存在于感染細胞內(nèi)或細胞表面，是DENV感染過程中體液免疫反應(yīng)的主要靶分子［11］。分子模擬機制導(dǎo)致的自身免疫反應(yīng)與DENV感染所致疾病的病理機制有關(guān)，NS1蛋白誘導(dǎo)的自身抗體可以與細胞外基質(zhì)、血液凝塊、整聯(lián)蛋白/外源凝集素蛋白反應(yīng)，并且能夠與血小板、內(nèi)皮細胞結(jié)合［12?13］?；颊哐逯锌筃S1抗體與內(nèi)皮細胞發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能紊亂和凋亡，在疾病進展中發(fā)揮重要作用［14］；抗NS1抗體與血小板和內(nèi)皮細胞結(jié)合還能導(dǎo)致血小板和內(nèi)皮細胞的破壞和炎性激活。用NS1蛋白預(yù)處理可以抑制DENV患者血清引起的血管內(nèi)皮細胞凋亡［15］，以上研究提示DENV NS1蛋白可能與血小板、血管內(nèi)皮細胞具有相似的抗原決定簇，DENV感染能夠通過分子模擬機制導(dǎo)致疾病的發(fā)生［16］。本研究發(fā)現(xiàn)抗NS1抗體能夠與人微血管內(nèi)皮細胞結(jié)合，且結(jié)合強度與抗NS1抗體滴度呈正相關(guān)，結(jié)果提示抗DENV NS1抗體能夠與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生交叉反應(yīng)。

抗原抗體反應(yīng)可激活機體補體系統(tǒng)，產(chǎn)生多種具有炎癥介質(zhì)作用的過敏毒素C3a、C4a和C5a，以及直接損傷靶細胞的攻膜復(fù)合體。抗NS1抗體與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生交叉反應(yīng)，能夠活化補體，損傷病毒感染宿主血管內(nèi)皮細胞，引起登革出血熱/登革休克綜合征患者血漿滲漏［17］。以往研究發(fā)現(xiàn)登革出血熱/登革熱患者血清中C3a和C5a均顯著升高，并且C3a和C5a與登革發(fā)病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)抗NS1抗體與人微血管內(nèi)皮細胞、新鮮血清共培養(yǎng)產(chǎn)生大量C3a、C4a和C5a，以及可溶性攻膜復(fù)合體sC5b?9，結(jié)果提示抗NS1抗體與人微血管內(nèi)皮細胞交叉結(jié)合后能夠激活補體系統(tǒng)。

綜上所述，DENV NS1蛋白是病毒感染致病過程中的重要蛋白，機體產(chǎn)生的抗NS1抗體能夠與宿主血管內(nèi)皮細胞交叉反應(yīng)并激活補體系統(tǒng)，與登革出血熱/登革休克綜合征患者的血漿滲漏有關(guān)。

表1　抗NS1抗體激活補體活性的測定結(jié)果Table 1　The levels of the activated complement mobilized by anti?NS1 antibodies measured using ELISA

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2.深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院，廣東，深圳518023

3.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東，廣州510080

★通訊作者：趙丹，E?mail：sysu_microbiology@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金和廣東省自然科學(xué)基金聯(lián)合項目（U0632002）；深圳市科技計劃項目（JCYJ20120830091748817）

作者單位：1.深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院，廣東，深圳518019

Preparation and immune signature analysis of anti?dengue virus type 2 nonstructural protein 1 in vitro

YANG Xiaomeng1，ZHAO Dan2★，DU Liwei1，CHEN Xiang1，JIANG Lifang3
（1.Shenzhen Luohu Maternity and Child Healthcare Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518019；2.Shenzhen Luohu Chronic Disease Control，Shenzhen，Guangdong，China，518023；3.Zhongshan School of Medicine，Sun Yat?sen University，Guangzhou，Guangdong，China，510080）

［ABSTRACT］ObjectiveTo prepare the polyclonal antibodies directed against dengue virus type 2 (DENV2)nonstructural protein 1(NS1)(anti?NS1 antibodies)and to analyze the immunological characteristics of the antibodies.MethodsHigh titer polyclonal anti?NS1 antibodies were obtained from BALB/c mice immunized with DENV2 NS1.The binding ability of anti?NS1 antibodies to NS1 protein or DENV2 was detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The cross?reactivity of the antibodies with human microvascular endothelial cell 1(HMEC?1)was demonstrated using immunofluorescence assay.The levels of activated complement in the co?culture systems of anti?NS1,HMEC?1 and fresh syngenic mice sera were measured using ELISA.ResultsAnti?NS1 antibodies could bind to NS1 and DENV2.The highest titer ofthe antibodies was 1:1 280 and 1:640 respectively.Anti?NS1 antibodies could cross bind to HMEC?1.The levels of C3a,C4a,C5a and sC5b?9 in the co?culture systems of anti?NS1,HMEC?1 and fresh syngenic mice sera were sharply higher than those in the co?culture systems of HMEC?1 and fresh syngenic mice sera(P< 0.05)and the co?culture systems of PBS,HMEC?1 and fresh syngenic mice sera(P<0.05).Conclusion These results indicate that anti?NS1 antibodies can crosslink to vascular endothelial cell and activate the complement system,which may be involved in the immunopathologic mechanism of dengue hemorrhagic fever.

[KEY WORDS]Dengue virus type 2;Nonstructural protein 1;Anti?nonstructural protein 1 antibodies; Membrane attack complex