王繼成　秦丹卿　駱明勇　何天文

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中國型Gγ+(Aγδβ)0地中海貧血的基因診斷和臨床特征分析

王繼成秦丹卿駱明勇何天文★

［摘要］目的對42例中國型Gγ+(Aγδβ)0地中海貧血患者進行基因診斷并分析其臨床特征。方法所有患者的外周血標本進行血紅蛋白毛細管電泳和包括平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV），平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）等紅細胞參數(shù)的分析，應用Gap?PCR、PCR ?RDB的方法進行地中海貧血基因檢測。結果40例患者為中國型Gγ+(Aγδβ)0雜合子，血紅蛋白正?；蜉p度下降，血紅蛋白分析顯示HbF為10.6%～20.6%；2例為中國型Gγ+(Aγδβ)0合并其它常見的β地中海貧血，表現(xiàn)為中重度的貧血，HbF為80.8%～93.1%。結論中國人群中中國型Gγ+(Aγδβ)0是比較常見的缺失型β地中海貧血類型，其雜合子臨床癥狀較輕，當合并其他地中海貧血時可改變原有的血液學表現(xiàn)。

［關鍵詞］β地中海貧血；δβ地中海貧血；基因診斷

地中海貧血簡稱地貧，又稱海洋性貧血，是我國南方常見的遺傳性血液學疾病，主要分α地中海貧血（簡稱α地貧）和β地中海貧血（簡稱β地貧）2種類型。β地貧主要是由β珠蛋白基因的點突變引起，少數(shù)是由于β珠蛋白基因簇的大片段缺失所致。δβ地貧是一類累及δ和β珠蛋白基因的缺失型地貧。這種缺失導致胎兒期的γ珠蛋白基因在成人期重新開放和持續(xù)表達，從而導致HbF的異常升高［1］。目前全世界已發(fā)現(xiàn)多種不同缺失類型的δβ地貧。在我國人群中，中國型、云南型和廣州型的δβ地貧已被報道，這些類型都是Gγ+（Aγδβ）0地貧，其中中國人最常見的是中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧［2-5］。這種地貧首先由Mann等［6］人在上世紀70年代報道。我們對42例中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧患者進行基因診斷并分析其臨床特征，報告如下。

1　對象與方法

1.1對象

2012年至2015年來我院就診，血紅蛋白電泳顯示HbF增高（>5%）且經(jīng)基因檢測確診為中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧的42例的患者。所有患者均為廣東籍居民，年齡為18~38歲，平均年齡為27.6歲。取其外周血用于血常規(guī)和血紅蛋白電泳分析，提取外周血基因組DNA用于珠蛋白基因檢測。

1.2方法

1.2.1紅細胞參數(shù)和血紅蛋白分析

提取EDTA抗凝靜脈血2 mL，用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司的BC?2000血液分析儀對外周血進行紅細胞參數(shù)分析。抽取檸檬酸鈉抗凝靜脈血2 mL，應用法國SEBIA公司的se?bia capillary2毛細管電泳分析系統(tǒng)進行血紅蛋白分析。

1.2.2地貧基因診斷

使用QIAmp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取外周血基因組DNA。應用亞能生物技術有限公司的地貧基因檢測試劑盒進行基因檢測，包括3種最常見的缺失型α地貧（??SEA/、?α4.2、?α3.7）、3種最常見的點突變型α地貧（CS、WS、QS）以及17種常見的β地貧，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。采用裂隙聚合酶鏈反應（gap polymerase chain reaction,Gap?PCR）的方法檢測中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧，Gap?PCR引物委托鉑尚生物技術（上海）有限公司合成。PCR擴增反應體系是3條引物雙重Gap?PCR，3條引物的序列分別為：共同上游引物5′?CCAGCCTCATGGTAGCAGAATC?3′，缺失下游引物5′?TGGTATCTGCAGCAGTTGCC?3′，正常內(nèi)對照下游引物5′?GTGATTGTTGAGTTGCAG?GATCG?3′。中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧缺失擴增產(chǎn)物長度為211 bp，正常內(nèi)對照擴增產(chǎn)物長度為298 bp。PCR擴增反應條件為95℃預變性5 min，94℃變性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物。

2　結果

2.1血液學和血紅蛋白電泳

40例中國型Gγ+（Aγδβ）0雜合子患者的血液學指標表現(xiàn)差別較大，血紅蛋白正?；蜉p度降低；MCV和MCH有不同程度的下降，提示小細胞低色素性貧血的特征。血紅蛋白電泳分析顯示HbA2為2.3%~3.1%，HbF為10.6%～20.6%；2例為中國型Gγ+（Aγδβ）0復合其它常見的β地中海貧血，表現(xiàn)為中重度貧血，HbF大幅增高到80.8%～93.1%（表1）。

表1　紅細胞參數(shù)、血紅蛋白電泳及基因檢測結果Table 1　Results of hemotological parameters and gene diagnosis

2.2基因檢測結果

應用基于反向斑點雜交方法的β?地貧基因檢測試劑盒檢測到2例突變，分別為?28和CD17純合突變，PCR?RDB結果見圖1。用Gap?PCR法共檢測，42例為中國型Gγ+（Aγδβ）0缺失型地貧。PCR瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2，其中298 bp為正常對照的擴增產(chǎn)物，211 bp為缺失型條帶。

3　討論

中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧的缺失范圍約100 kb，包括部分Aγ珠蛋白基因、全部的δ和β珠蛋白基因以及β珠蛋白基因下游較遠的具有調(diào)控功能的DNA序列［7-8］。這種缺失致使Gγ珠蛋白基因的高表達，從而使HbF在胎兒出生后的持續(xù)性升高（5%~20%）和小細胞低色素性貧血成為中國型Gγ+（Aγδβ）0特征性的臨床表現(xiàn)［9］。HbF是胎兒期表達的血紅蛋白。出生6個月后，HbA（α2β2）成為紅細胞中主要的血紅蛋白，HbF含量則低于1%。但HbF在成人時期增高性的表達可以緩解α肽鏈和類β肽鏈比例失衡的程度從而起到代償性的作用。從本研究40例確診為中國型Gγ+（Aγδβ）0雜合型患者的血細胞參數(shù)和血紅蛋白電泳結果可知，雜合子患者的血紅蛋白的值為102~154 g/L，表現(xiàn)較輕的貧血或無貧血。但MCV<80 fL和MCH< 27 pg均提示地貧的可能。雜合子患者的HbA2是正常的或輕微下降，而HbF值為10.6%～20.6%，分布范圍比較集中。但當合并其他常見的β地貧基因突變時，表現(xiàn)為明顯的中度或重度貧血（Hb顯著降低），HbF也上升為80.8%～93.1%，這與文獻報道的相類似［10-14］。所以進行血液學分析時，若紅細胞指標提示為小細胞低色素性貧血，而HbF有相應程度的升高，且也未檢測到中國人常見的17 種β地貧，需考慮缺失型β地貧的可能。當然這首先要與中國人常見的SEA?HPFH相鑒別，后者常有更高水平的HbF和很少有小細胞低色素性貧血樣改變［15］。

雖然中國人群中，β地貧主要是因β珠蛋白基因的點突變所致，但李志琴等［16］的調(diào)查顯示在中國南方人群分別有10%和13%的中間型地貧的基因構成為中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧和SEA?HPFH，這提示這2種缺失型突變也是我國南方人群比較常見的類型。目前國內(nèi)商業(yè)化的試劑盒普遍采用PCR?RDB的方法檢測β地貧最常見的17種點突變，并未常規(guī)檢測包括中國型Gγ+（Aγδβ）0在內(nèi)的中國人比較常見的缺失型β地貧。β地貧的臨床檢驗過程中，當發(fā)現(xiàn)基因檢測的結果與血液學分析的結果不相符時，需考慮其他未在檢測范圍內(nèi)的地貧類型的可能。圖1A和B雜交膜條中的?28和CD17位點均無正常對照，顯示為此2個位點的純合突變。然而這與此2位點真實的純合突變的血液學表現(xiàn)明顯不同，包括HbF在內(nèi)的數(shù)值也明顯不一致。這些血液學表現(xiàn)與是否合并α地貧也有很大的相關性，故而常見α地貧的基因檢測也必不可少。

在我國南方這些β地貧的高發(fā)區(qū)，通常先以血常規(guī)和血紅蛋白電泳進行地貧的篩查，疑似病例再進行常規(guī)的基因檢測，這時不能忽視包括中國型Gγ+（Aγδβ）0在內(nèi)的缺失型β地貧存在的可能。這些缺失型地貧通常是大片段的缺失，斷裂位點也比較明確，都可以采用Gap?PCR的方法來進行檢測［17］。雜合缺失型β地貧的患者與常見β地中海貧血攜帶者結合有可能導致中重度β地貧患兒出生的可能，所以準確的孕前基因檢測和產(chǎn)前診斷就非常有必要?？傊?，罕見β地貧的正確診斷和鑒別，對于遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷可以提供更好的依據(jù)。尤其當不符合遺傳規(guī)律時，更具有指導性的價值。

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基金項目：廣東省科技計劃項目（2014A020212246）

作者單位：廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心，廣東，廣州511442★通訊作者：何天文，E?mail：love830415@126.com

Genetic research and clinical analysis of deletional ChineseGγ+(Aγδβ)0?thalassemia

WANG Jicheng,QIN Danqing,LUO Mingyong,HE Tianwen★
(Medical Genetics Center of Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou,Guangdong,China,511442)

［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatethegenotypeandclinicalfeaturesofdeletional ChineseGγ+(Aγδβ)0?thalassemia.MethodsBlood cell count and hemoglobin electrophoresis analysis were performed on the blood samples of all 42 subjects.Gap?PCR and PCR?reverse dot hybridization analysis were used to detect globin gene mutations.ResultsAmong all the subjects,40 cases were identified to be heterozygote of deletional ChineseGγ+(Aγδβ)0?thalassemia.Hemoglobin analysis showed normal or mild anaemia.And the value of HbF was about 10.6%~20.6%.The other 2 cases were of ChineseGγ+(Aγδβ)0accompanied by other β?thalassemia.The value of HbF was around 80.8%～93.1%.And showed symptoms of severe anemia.ConclusionChineseGγ+(Aγδβ)0?thalassemia is a common type of deletional β?thalassemia in Chinese people.The heterozygotes have mild clinical symptoms,when co?inherited with other thalassemia,it will change the hematological manifestations.

[KEY WORDS]β?thalassemia;δβ?thalassemia;Gene diagnosis