馬桂芬，張?zhí)N哲，付博宇，袁耀武，苑寧，王鑫，張偉，*（．河北農業(yè)大學食品科技學院，河北保定07000；.河北農業(yè)大學理工學院，河北滄州06000）

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實時熒光LAMP技術快速檢測變形桿菌

馬桂芬1，張?zhí)N哲1，付博宇1，袁耀武1，苑寧2，王鑫2，張偉1，*
（1．河北農業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000；2.河北農業(yè)大學理工學院，河北滄州061000）

摘要：建立一種快速檢測變形桿菌的方法。采用實時熒光LAMP（RealAmp）技術檢測變形桿菌，分析GenBank中公布的變形桿菌atpD基因序列，針對其6個區(qū)域設計4條引物，利用實時熒光監(jiān)測儀等溫（62℃）擴增模板DNA，通過與電腦相連進行實時監(jiān)測，對該方法檢測變形桿菌的特異性、靈敏度、人工污染豬肉檢出限等方面進行研究，并將該檢測法的靈敏度與普通環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測法進行比較。結果表明，RealAmp檢測方法比普通LAMP檢測方法更加方便快捷，20min內即可判定結果；用于特異性試驗的19株試驗菌株中，6株變形桿菌呈陽性結果，其他13株非變形桿菌均呈陰性結果；檢測純菌的靈敏度為8.1CFU/mL，是普通LAMP檢測方法的10倍；人工污染豬肉的檢出限為81CFU/mL。本研究建立的RealAmp檢測方法操作簡單，耗時短，特異性強、靈敏度高，能夠實現(xiàn)對變形桿菌的快速檢測。

關鍵詞：實時熒光LAMP；LAMP；變形桿菌；檢測；atpD基因

當前全球性食品安全問題受到的關注越來越多，世界衛(wèi)生組織將控制食品污染和食源性疾病列為優(yōu)先重點戰(zhàn)略工作領域。變形桿菌是一種食源性條件致病菌，吃剩下的食物、食品沙拉和一些豆類制品，還有動物的內臟及肉、蛋類等一系列食品都很容易被變形桿菌污染，從而導致食物中毒。致使身體的抵抗力變弱，身體的某些部位極易被感染和病變，如：尿路感染、呼吸道感染、敗血癥，此外還能引起腦膜炎，腹膜炎，類風濕關節(jié)炎等疾病［1-2］。

在2000年，日本的榮研化學株式會Notomi等［3］研發(fā)出一種新型的能夠在體外進行等溫擴增核酸片段的技術——環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，簡稱LAMP），這一技術的特點就是根據(jù)靶基因序列的6個位置區(qū)域，設計出4種具有特異性的引物（包擴外引物F3和B3及內引物FIP 和BIP），然后在DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的催化作用下等溫（65℃左右）持續(xù)數(shù)十分鐘，就能夠完成核酸的擴增，這里使用的Bst DNA polymerase是具有強的鏈置換活性的。由于LAMP技術可以在恒溫下實現(xiàn)模板的快速擴增且特異性和靈敏度較高，被廣泛的應用，且尚在不斷的發(fā)展。

實時熒光監(jiān)測儀（ESE-Quant Tube Scanner）可對模板DNA進行等溫擴增。實時熒光監(jiān)測儀的價格相對便宜，體積較小，便于攜帶，能夠在現(xiàn)場進行快速檢測，更加易于推廣。實時熒光環(huán)介導等溫擴增（Real-time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification Technology，RealAmp）技術，是指將實時熒光監(jiān)測儀與電腦相連，在LAMP反應體系中加入熒光染料（SYBR GreenⅠ），SYBR Green I和雙鏈DNA發(fā)生結合，熒光強度會大大增強。當反應開始，DNA便開始擴增，反應體系中的熒光信號也隨之發(fā)生變化［4］，通過電腦軟件對整個LAMP反應進行實時監(jiān)測，擴增曲線就會被顯示出來。2010年，Naomi W.Lucchi等［5］用實時熒光LAMP技術建立了瘧原蟲基因的檢測方法。同年，Yamazaki等［6］運用實時熒光LAMP技術實現(xiàn)了副溶血弧菌的檢測。實時熒光LAMP檢測法可實時監(jiān)測并直觀判定檢測結果，操作簡單，耗時短，特異性強、靈敏度高。目前，利用實時熒光LAMP技術檢測病原菌在國內外少有報道，而利用該方法檢測變形桿菌的研究在國內外鮮見報道。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

本試驗所用菌株見表1。

1.1.2試劑

8 000 U/mL Bst DNA聚合酶大片段（Bst DNA polymerase large fragment）和 10×ThermoPolTMReaction Buffer：New England Biolab公司；2.5 mmol/L High Pure dNTPs、50 mmol/L MgSO4、100-bp DNA ladder及Hpa I限制性內切酶：寶生物（大連）工程有限公司；SYBR Green I：北京天恩澤公司；LAMP引物合成于北京華大基因；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術有限責任公司。

1.1.3儀器與設備

實時熒光監(jiān)測儀（ESE-Quant Tube Scanner）：ESE GmbH，Stockach，Germany；Whatman T Gradient PCR儀：Biometra Co.Ltd；DLCJ-1N凈化工作臺：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；UVIpro凝膠成像系統(tǒng)：UVItec公司；DYY-10C電泳儀：北京市六一儀器廠；數(shù)顯超級恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；高速冷凍離心機：德國西格瑪公司。

1.2方法

1.2.1引物設計

對GenBank中已公布的變形桿菌atpD保守基因（普通變形桿菌AY134488，奇異變形桿菌AX109601）序列進行同源性對比分析，針對靶序列的6個位點，運用LAMP引物設計軟件（Primer Explorer V3）在線設計引物［7-10］。設計的4條引物包括：2條外引物（F3和B3），2條內引物（FIP和BIP）［11］，其中FIP由F1的互補序列F1c和正向序列F2構成，BIP由B1的互補序列B1c和正向序列B2構成。經(jīng)過篩選引物，擴增靶基因序列中272至470的位置區(qū)域，擴增的目的基因片斷長度為199 bp。實時熒光LAMP的4條引物見表2，每一條引物在靶基因序列中的位置見圖1。

表1　試驗菌種Table 1　Experimental strains

表2　LAMP引物Table 2　Primer of LAMP

圖1　引物位置Fig.1　Gene map of the target sequences

1.2.2純菌培養(yǎng)

將變形桿菌菌種接種于無菌的營養(yǎng)肉湯中，在36.8℃，220 r/min的搖床中培養(yǎng)過夜（約12 h），此方法適用于本試驗其它細菌的培養(yǎng)。采用稀釋平板菌落計數(shù)法進行變形桿菌菌落計數(shù)，測定變形桿菌純培養(yǎng)物的活菌數(shù)為8.1×108CFU/mL。

1.2.3制備DNA

采用熱裂解法提取基因組DNA，將提取的DNA儲存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

熱裂解法具體步驟如下：①將1 mL過夜培養(yǎng)的菌液加入到1.5 mL滅菌離心管中，在11 000 r/min，1 min條件下離心，棄上清。②用300 μL滅菌水反復吹吸菌體沉淀，然后11 000 r/min，離心1min，棄去上清。③在沉淀中加100 μL滅菌水，反復吹吸沉淀物，使其充分懸浮。④將懸浮液置于沸水浴中，約10 min后取出，11 000r/min離心1 min，取上清（基因組DNA）。

1.2.4LAMP反應

1.2.4.1實時熒光LAMP反應

經(jīng)實時熒光監(jiān)測儀反復優(yōu)化確定RealAmp反應體系和程序。

反應體系：2.5 mmol/L high-pure dNTPs 5 μL，10× ThermoPolTMReaction Buffer 3 μL，50 mmol/L MgSO40.5 μL，10 μmol/L F3和B3各1 μL，10 μmol/L FIP和BIP各2.5μL，8000U/mLBstDNA聚合酶大片段1.5μL，1.5 μL SYBR Green I（1∶500稀釋），模板DNA 3 μL，剩余為無菌蒸餾水，補足25 μL反應體系。

反應程序：溫度為62℃，時間為60 min，可以依照實際反應的情況進行終止。

產(chǎn)物驗證：吸取擴增產(chǎn)物4μL，然后與1μL的10× Loading Buffer進行均勻的混合，在進行完1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，將凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)中，觀察是否產(chǎn)生正確LAMP梯形條帶，驗證實時熒光LAMP擴增反應發(fā)生了正確的LAMP擴增。

1.2.4.2普通LAMP反應

為了比較RealAmp和普通LAMP檢測變形桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度，用PCR儀對普通LAMP反應體系和反應程序進行了優(yōu)化。以下為優(yōu)化后的普通LAMP反應體系和反應程序。

反應體系：2.5 mmol/L High Pure dNTPs 4 μL，10× ThermoPolTMReaction Buffer 2.5 μL，50 mmol/L MgSO40.5μL，10 μmol/L F3和B3各1 μL，10 μmol/L FIP和BIP 各1.5μL，8000U/mLBstDNA聚合酶大片段1μL，模板DNA 2 μL，剩余為無菌蒸餾水，補足25 μL反應體系。

反應程序：溫度62℃，時間60 min，80℃10 min終止反應。

產(chǎn)物檢測：與RealAmp反應的產(chǎn)物驗證方法相同。

1.2.5酶切分析RealAmp反應產(chǎn)物

由于RealAmp擴增產(chǎn)物的電泳條帶為梯狀，故很難用于測序。研究發(fā)現(xiàn)對RealAmp產(chǎn)物進行酶切分析，也可以驗證其產(chǎn)物的特異性。取RealAmp反應產(chǎn)物1 μL，加入2 μL 10×K Buffer和1 μL Hpa I限制性內切酶，用無菌蒸餾水補足20 μL反應體系，37℃水浴1.5 h（可根據(jù)酶切效果適當延長酶切時間）。吸取酶切產(chǎn)物5 μL，與1 μL的10×Loading Buffer混合均勻，進行完1.5%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min）后，將凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)中，觀察分析RealAmp反應產(chǎn)物酶切結果是否與理論相一致。

1.2.6實時熒光LAMP的特異性

采用熱裂解法，提取表1所列的19株特異性試驗菌株的基因組DNA，陰性對照以無菌蒸餾水作為模板，采用RealAmp反應體系和程序進行擴增，驗證該檢測方法的特異性。

1.2.7比較RealAmp與普通LAMP檢測純菌的靈敏度

將過夜培養(yǎng)的變形桿菌純培養(yǎng)物進行10倍系列梯度稀釋，取各稀釋度菌液1 mL進行平板計數(shù)，通過計數(shù)可知變形桿菌純培養(yǎng)物的濃度為8.1×108CFU/mL。用1.2.3熱裂解法提取各稀釋度（8.1×10-1CFU/mL～8.1×108CFU/mL）的變形桿菌基因組DNA，進行實時熒光LAMP和普通LAMP擴增反應，比較兩種檢測方法的靈敏度。

1.2.8RealAmp法檢測人工污染豬肉的檢出限

在進行變形桿菌污染前，根據(jù)FDA推薦的常規(guī)檢測方法確定豬肉中是沒有變形桿菌存在的。取25 g已絞成均勻肉餡的豬肉，加入225 mL滅菌生理鹽水，制成豬肉勻漿液。分別取1.2.7中10倍系列梯度稀釋的變形桿菌純菌液1 mL，加入裝有9 mL豬肉勻漿液的無菌離心管中，振蕩均勻，以1 000 r/min的轉速離心10 min。取上清，加入到另一個無菌的離心管，在14 000 r/min的轉速下離心10 min。棄上清，加入500 μL生理鹽水，將沉淀物進行懸浮。加入乙酸乙酯（上述懸浮液0.25倍體積），反復吹吸并混勻振蕩（約2 min），14 000 r/min，離心10 min。將上清液去除，用500 μL的TE緩沖液將沉淀溶解。各取溶解液1 mL，用熱裂解法提取DNA，進行實時熒光LAMP擴增。

2　結果與分析

2.1建立RealAmp檢測方法

RealAmp直觀檢測變形桿菌，見圖2。

由圖2可知，隨著反應的進行，開始出現(xiàn)熒光曲線，當反應約10 min的時候，Tube1試驗管和Tube2試驗管熒光強度開始增強，當反應達到25 min左右時熒光曲線的峰值相繼達到最高。而Tube3陰性對照管的熒光曲線一直處于相對平滑的狀態(tài)，直到反應終止也沒有出現(xiàn)明顯的峰值。瓊脂糖凝膠電泳檢測實時熒光LAMP反應產(chǎn)物，見圖3。

圖3　變形桿菌凝膠電泳檢測結果Fig.3　Reaction products of RealAmp detected using agarose gel electrophoresis

由圖3可知，Tube1和Tube2出現(xiàn)了LAMP反應典型的梯狀條帶，而Tube3未出現(xiàn)梯狀條帶。由此可知，實時熒光LAMP的直觀檢測結果和電泳檢測結果一致，表明Tube1和Tube2發(fā)生了LAMP擴增反應。

2.2酶切分析RealAmp反應產(chǎn)物

LAMP產(chǎn)物的酶切分析結果見圖4。

圖4　LAMP產(chǎn)物的酶切分析結果Fig.4　Restriction enzyme analysis results of RealAmp

由圖4可知，利用DNAMAN軟件對靶序列進行限制性切酶分析可知，Hpa I的酶切位點在靶序列405的位置區(qū)域，也就是B1和B2之間。運用酶切理論圖進行推導計算，理論上酶切產(chǎn)物的片段大小主要為183、200、217 bp。實時熒光LAMP擴增產(chǎn)物經(jīng)Hpa I酶切后，切出的片段長度與理論值是一致的。

2.3研究RealAmp法的特異性

實時熒光LAMP的特異性試驗結果見圖5。

由圖5可知，用于RealAmp特異性試驗的19株試驗菌株中，3株普通變形桿菌和3株奇異變形桿菌有明顯的擴增峰，儀器自動判定為陽性，而其他13株非變形桿菌沒有出現(xiàn)擴增峰，故均未發(fā)生擴增，判定為陰性。試驗表明實時熒光LAMP檢測變形桿菌的特異性較強。

圖5　實時熒光LAMP的特異性試驗結果Fig.5　Results of the specificity test of RealAmp detection

2.4比較RealAmp與普通LAMP檢測純菌的靈敏度實時熒光LAMP反應的靈敏度試驗結果見圖6。

如圖6所示，采用RealAmp反應，當變形桿菌純培養(yǎng)物濃度為8.1×108CFU/mL（Tube1）和8.1× 104CFU/mL～8.1×100CFU/mL（Tube3～Tube7）時，熒光曲線出現(xiàn)明顯的擴增峰，儀器自動判定為陽性；當濃度為8.1×10-1CFU/mL（Tube 8）時，熒光曲線平緩，未出現(xiàn)擴增峰，判定為陰性。因此，本試驗所建立實時熒光LAMP檢測變形桿菌的靈敏度為8.1 CFU/mL。

普通LAMP反應的靈敏度試驗結果見圖7。

圖6　實時熒光LAMP反應的靈敏度試驗結果Fig.6　Sensitivity test using RealAmp

圖7　 普通LAMP反應的靈敏度試驗結果Fig.7　Sensitivity test using conventional LAMP

如圖7所示，采用普通LAMP反應，當變形桿菌純培養(yǎng)物濃度為8.1×101CFU/mL（第7個膠孔）時，不再出現(xiàn)梯狀條帶，故普通LAMP檢測變形桿菌的靈敏度為81 CFU/mL。

由此可知，RealAmp檢測變形桿菌的靈敏度是普通LAMP的10倍。

2.5RealAmp法檢測人工污染豬肉的檢出限

實時熒光LAMP檢測人工污染豬肉的檢出限試驗見圖8。

如圖8所示，采用實時熒光LAMP檢測人工污染豬肉的檢出限，當變形桿菌純培養(yǎng)物濃度為8.1×108CFU/mL （Tube1）和8.1×104CFU/mL～8.1×101CFU/mL（Tube3～Tube6）時，熒光曲線出現(xiàn)明顯的擴增峰，儀器自動判定為陽性；當濃度為8.1×100CFU/mL and 8.1×10-1CFU/mL （Tube 7～Tube 8）時，熒光曲線平緩，未出現(xiàn)擴增峰，判定為陰性。因此，本試驗所建立實時熒光LAMP檢測人工污染豬肉的檢出限為81 CFU/mL。

圖8　實時熒光LAMP檢測人工污染豬肉的檢出限試驗Fig.8　Detection limit of the pork artificially contaminated with proteus using RealAmp

3　結論

本試驗建立的變形桿菌RealAmp檢測方法的靈敏度是普通LAMP的10倍，且大大縮短了檢測時間，20 min內儀器自動判定結果。該檢測方法可實時監(jiān)測并直觀判定檢測結果，避免了繁瑣的凝膠電泳過程，其操作簡單，耗時短，特異性強、靈敏度高，能夠實現(xiàn)對變形桿菌的快速檢測，其應用前景十分廣闊。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.030

基金項目：河北省自然科學基金項目（C2008000216）

作者簡介：馬桂芬（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：有害微生物檢測與控制。

*通信作者：張偉（1963—），男（漢），教授，院長。

收稿日期：2015-05-02

Real-time Fluorescence LAMP Assay for Rapid Detection of Proteus

MA Gui-fen1，ZHANG Yun-zhe1，F(xiàn)U Bo-yu1，YUAN Yao-wu1，YUAN Ning2，WANG Xin2，ZHANG Wei1，*
（1.College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China；2.College of Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Cangzhou 061000，Hebei，China）

Abstract：We established a rapid detection method for proteus by using real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification（RealAmp）technology.Four loop-mediated isothermal amplification primers were constructed based on the atpD gene of proteus published in GenBank.The portable fluorescence reader（ESEQuant Tube Scanner）was used for isothermal（62°C）amplification of DNA template.Real-time monitoring was achieved by connecting the reader to a computer.Sensitivity，specificity and the detection limit of artificially contaminated pork of proteus were determined using RealAmp and compared with the sensitivity of the conventional LAMP.The results showed that RealAmp method was more simple and rapid than the conventional LAMP.The total time of judgment result of the former was generally less than 20 min.A total of 19 strains were subjected to specificity tests，6 proteus strains indicated positive results，whereas the other 13 non-proteus strainsindicatednegativeresults.ThesensitivityofRealAmpindetectingpureculturesof proteuswas8.1CFU/mL，which was10 times compared with that of the conventional LAMP.Moreover，the detection limit of artificially contaminated pork was 81 CFU/mL.The RealAmp method was superior in terms of testing time，convenience，specificity，and sensitivity，and had significant potential for rapid detection of proteus.

Key words：RealAmp；LAMP；proteus；detection；atpD