王艷，杜愛玲，周長遠（.山東職業(yè)學(xué)院生物工程系，山東濟南25004；2.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東濟南25006；.棗莊市臺兒莊區(qū)林業(yè)局，山東棗莊277400）

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蘋果中糖含量的HPLC檢測條件研究

王艷1，杜愛玲2，*，周長遠3
（1.山東職業(yè)學(xué)院生物工程系，山東濟南250104；2.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東濟南250061；3.棗莊市臺兒莊區(qū)林業(yè)局，山東棗莊277400）

摘要：利用反相高效液相色譜法測定蘋果中的糖含量，針對糖的特殊結(jié)構(gòu)，調(diào)整高效液相色譜法的測試條件，獲得了適于蘋果中糖含量的測試方法。色譜條件：ODS柱，RI檢測器，柱溫25℃，進樣體積10μL，流動相為3∶97的甲醇-水體系，流速1mL/min，等度洗脫。在選定的檢測條件下，可分析出蘋果中5種主要的糖，果糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖和D-木糖；在對市場上國光、富士、紅玉、黃金4種不同的蘋果進行檢測時發(fā)現(xiàn)各品種間糖成分差異不大。

關(guān)鍵詞：蘋果；糖；HPLC；分離效果

蘋果是世界四大水果之一，因其爽脆可口、汁多味甜等優(yōu)點而廣受人們喜愛，糖是蘋果的重要風(fēng)味成分和營養(yǎng)成分，準(zhǔn)確測定其中的糖對于研究蘋果的品質(zhì)和貯藏加工具有重要的意義［1］。目前化學(xué)分析［2］、比色分析［3］、紙色譜［4］、薄層色譜［5］、氣相色譜［6］、高效液相色譜［7］等都用于糖的分離和測定。HPLC因其快速、簡便等優(yōu)點常用于糖的分析，但由于糖分子的特殊結(jié)構(gòu)，目前缺少一個統(tǒng)一的HPLC方法來分析蘋果中的糖。為了全面評價不同蘋果的風(fēng)味特色并保證其測定的穩(wěn)定性，本文將考察不同反相高效液相色譜測試條件對分析結(jié)果的影響，獲得適用于蘋果中糖含量測定的分析條件并以此分析不同品種間糖含量的差異。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

1260Infinity高效液相色譜儀、G5611A生物惰性四元泵、G5667A自動進樣器、G5664A餾分收集器：美國安捷倫公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海雙旭電子有限公司；梅特勒AL204電子分析天平：瑞士梅特勒托利多；貝克曼L-100K超速離心機：寧波歐普儀器有限公司。

果糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、D-木糖：美國Sigma公司；甲醇（色譜純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；純凈水經(jīng)抽濾機過濾制備。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制［8］

準(zhǔn)確稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、D-木糖各50 mg，用蒸餾水稀釋定容至25 mL的容量瓶中。

分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，混合均勻，備用。

1.3蘋果樣品的處理

準(zhǔn)確稱取一定量的果肉，研磨后加水在恒溫水浴鍋內(nèi)攪拌30 min，離心過濾，收集上清液并用0.45 μm的微孔濾膜過濾，待測。

1.4糖的測定

高效液相色譜法是以液體作為流動相的現(xiàn)代柱色譜分離分析方法，在技術(shù)上采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器實現(xiàn)分析速度快、分離效率高和操作自動化。綜合考慮柱效、分離度以及糖的結(jié)構(gòu)特點，我們選擇化學(xué)鍵合的C18烷基柱為固定相，示差折光檢測器，流速1 mL/min，等度洗脫。

測定過程中通過改變流動相、柱溫、進樣量和進樣時間，用同一標(biāo)準(zhǔn)樣品進樣，考察其峰面積和分離度等，對比不同條件下的分離效果，確定較優(yōu)的檢測條件。

色譜峰分離度可以通過下式進行計算：

式中：RW表示分離度；d表示峰間距；tR1、tR2分別表示色譜峰1、色譜峰2的保留時間；yW1、yW2分別表示色譜峰1、色譜峰2的峰寬。

2　結(jié)果與討論

2.1流動相的選擇

根據(jù)反相鍵合色譜對流動相的要求及糖分子含有極性基團的結(jié)構(gòu)特點，并考慮試驗試劑的安全性等因素，我們選用甲醇-水體系作為流動相。

調(diào)整流動相中甲醇的體積百分數(shù)分別為1%、3% 和5%，其他條件為：柱溫為25℃、進樣量15 μL。考察不同配比的流動相對各糖含量和分離度的影響，分離效果見圖1和表1、表2。

圖1　 不同流動相配比的HPLC色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms with different mobile phase composition

表1　不同流動相配比對各糖間的分離度Table 1　The resolution between the different sugars with different mobile phase composition

表2　不同流動相配比各糖的相對含量Table 2　The relative content of different sugars with different mobile phase composition

由圖1、表1、表2可知，甲醇在流動相中的比例增大，有利于各組分的分離，可有效改善峰形，但是隨著甲醇含量的增加，蘋果中的主要糖分之一葡萄糖的峰信號較弱，同時基線噪聲增大，分析靈敏度降低；當(dāng)增加水的比例時，葡萄糖峰信號增強，但此時果糖和阿拉伯糖峰距小，分離度低。綜合考慮分離效果和峰信號強弱，確定流動相為甲醇體積分數(shù)為3%的甲醇-水體系。

2.2柱溫的影響

控制柱溫分別為15、25、35℃，流動相為V甲醇∶V水= 3∶97，其他條件同2.1。考察各糖在此條件下的含量和分離度的變化。分離結(jié)果見圖2、表3、和表4。

柱溫是一個重要的色譜操作參數(shù)，它直接影響分離效能和分析速度。降低柱溫色譜柱的選擇性增大，各糖之間的分離度較高，但是此時葡萄糖的信號響應(yīng)值減小，檢出限較高，檢測靈敏度大大降低；升高柱溫有利于提高柱效能，縮短分析時間，但是此時果糖、阿拉伯糖和D-木糖大量分解轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致檢測失敗。兼顧分離效果和檢測靈敏度，確定柱溫箱溫度25℃。

圖2　不同柱溫時的HPLC色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms with different column temperature

表3　不同柱溫各糖間的分離度Table 3　The resolution between different sugars with different column temperature

表4　 不同柱溫時各糖的相對含量Table 4　The relative content of different sugars with different column temperature

2.3進樣量

分別調(diào)整進樣量為5、10、20 μL，柱溫25℃，其他條件同2.2。分析混合糖在此條件下的含量分布和分離度的變化。測定結(jié)果見圖3、表5和表6。

圖3　 不同進樣量時的HPLC色譜圖Fig.3　HPLC chromatograms with different injection volume

表5　不同進樣量時各糖間的分離度Table 5　The resolution between different sugars with different injection volume

表6　不同進樣量時各糖的相對含量Table 6　The relative content of different sugars with different injection volume

進樣量與柱容量和檢測器的線性范圍等因素有關(guān)，進樣量太小，基線噪聲增大，檢測器靈敏度降低，檢測器不易檢測到阿拉伯糖、木糖和葡萄糖，導(dǎo)致分析誤差增大；進樣量太大，基線噪聲較小，但是柱效能下降，使得果糖和阿拉伯糖未能分開，同時D-木糖出峰失敗。在實際的分析中最大允許進樣量應(yīng)控制在使半峰寬基本不變，而峰高與進樣量成線性關(guān)系的范圍內(nèi)，因此我們確定進樣量為10 μL。

2.4不同品種蘋果中糖的HPLC分析

根據(jù)以上分析確定蘋果中糖的檢測條件如下：化學(xué)鍵合C18烷基柱為固定相，示差折光檢測器，流動相為V甲醇∶V水=3∶97，等度洗脫，流速1 mL/min，柱溫25℃，進樣量10 μL。在此檢測條件下進行市購不同品種蘋果糖分的測定，最終所得的色譜圖如圖4，分離度和歸一化含量見表7、表8。

圖4　不同品種蘋果的HPLC色譜圖Fig.4　HPLC chromatograms of different apple cultivars

表7　不同品種蘋果各糖間的分離度Table 7　The resolution between different sugars of different apple cultivars

表8　不同品種蘋果各糖的相對含量Table 8　The relative content of different sugars with different apple cultivars

結(jié)果表明，該檢測條件重現(xiàn)性較好，不同品種蘋果間各糖的含量相差不大。

3　結(jié)論

糖是蘋果的重要風(fēng)味成分和營養(yǎng)成分，由于糖分子的特殊結(jié)構(gòu)及高效液相色譜法的優(yōu)點，我們選用化學(xué)鍵合的C18烷基柱，示差折光檢測器，柱溫25℃，進樣量10 μL，體積比為3∶97的甲醇-水體系為流動相，等度洗脫，流速1 mL/min，進行蘋果中糖成分的測定，在選定的檢測條件下可以檢測出其中的5種糖，此方法簡便可靠，靈敏度高，重現(xiàn)性較好。同時對市場上4種不同品種的蘋果進行糖成分檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各蘋果間糖含量差異不大。

參考文獻：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.028

基金項目：科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目（2008GB2C600178）

作者簡介：王艷（1986—），女（漢），碩士，主要研究方向：天然產(chǎn)物有效成分的分離。

*通信作者：杜愛玲（1956—），女（漢），教授，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物有效成分的提取分離，以及材料腐蝕與防護。

收稿日期：2015-04-28

A Conditional Study of Analyzing Sugars in Apple With High Performance Liquid Chromatography

WANG Yan1，DU Ai-ling2，*，ZHOU Chang-yuan3

（1.Department of Bioengineering，Shandong Polytechnic，Jinan 250104，Shandong，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering，Shandong University，Jinan 250061，Shandong，China；3.Tai'erzhuang Forestry Bureau of Zaozhuang Municipal，Zaozhuang 277400，Shandong，China）

Abstract：Reversed-phase high performance liquid chromatography was used to analyze sugars in apples，in light of the characteristics of sugars，the adjusted high performance liquid chromatography technique was employed to analyze sugars.The chromatographic conditions：octadecylsilyl column，refractive index detector，column temperature at 25℃，injection volume was 10 μL，a mobile phase was Vmethanol∶Vwater=3∶97，flowing rate was 1 mL/min，isocratic elution.Five main sugars in apples were detected under the selected conditions：fructose，glucose，sucrose，arabinose and D-xylose；sugar compositions were found little difference among the varieties of Guoguang，F(xiàn)ushi，Hongyu and Huangjin bought on the market.

Key words：apple；sugar；HPLC；separation effect