滕安國，齊曉娜，張芹，王穩(wěn)航（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

?

高通量測序技術(shù)分析天然腸衣香腸的菌群組成

滕安國，齊曉娜，張芹*，王穩(wěn)航
（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

摘要：以貯藏至不同時期的天然腸衣香腸為研究對象，采用高通量測序技術(shù)，研究正常香腸、發(fā)黏香腸，以及腌漬天然腸衣的菌群組成。研究發(fā)現(xiàn)：貯藏至不同時期的香腸及腸衣之間，微生物多樣性及豐度均有較大差異，正常香腸和腸衣微生物多樣性及豐度均較高，發(fā)黏香腸微生物多樣性較低，Lactobacillus和Leuconostoc為其優(yōu)勢菌群，在種的水平上分類，則是Lactobacillus_paraplantarum、Leuconostoc_mesenteroides_subsp_mesenteroides_J18為優(yōu)勢菌群。

關(guān)鍵詞：天然腸衣香腸；微生物多樣性；高通量測序技術(shù)

隨著社會生活節(jié)奏加快，香腸需求巨大，特別是天然腸衣的乳化香腸作為烤腸、早餐腸等，出現(xiàn)在各類飲食場所。然而，天然腸衣的香腸貨架期短，特別是在夏季，一般在3 d以內(nèi)，否則極容易出現(xiàn)發(fā)黏、發(fā)酸等腐敗現(xiàn)象。除香腸外，其它類型的加工肉制品在貯藏時，亦有類似情況發(fā)生。香腸腐敗給生產(chǎn)企業(yè)帶來極大的困擾，由于貨架期短，生產(chǎn)企業(yè)無法規(guī)?；瘋湄浖伴L距離運輸，嚴重影響經(jīng)濟效益和企業(yè)發(fā)展。處理此類棘手問題成為當前香腸生產(chǎn)企業(yè)面臨的共性問題，目前此方面研究報道較少。本文以此為出發(fā)點，研究貯藏至不同時期的香腸菌群組成狀況及豐度，為香腸生產(chǎn)企業(yè)有針對性的解決香腸腐敗問題，延長產(chǎn)品貨架期提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1材料

香腸采購自天津某肉制品生產(chǎn)企業(yè)，分別取噴淋抗菌劑的正常香腸（A）、未噴淋抗菌劑的正常香腸（B）及發(fā)黏香腸（C）和腸衣（D）。

1.1.2主要試劑和儀器

DNA提取試劑盒：DNA Tissue Ki（tQIAGEN，Germany）。PCR儀：ABI GeneAmpR9700型。

1.2方法

1.2.1香腸樣品微生物基因組DNA提取與PCR擴增

取不同香腸各3根，參照Miambi等（2003）的方法［1］，無菌條件下取各香腸的腸衣部分，并取生產(chǎn)香腸使用的腌漬腸衣。以上樣品均截取10 g剪碎，放于50 mL生理鹽水中，搖床振搖30 min，于4℃，4 000 r/min，離心10 min，取上清液20 mL于10 000 r/min，4℃條件下離心20 min，取沉淀于1.5 mL離心管，參照DNA Tissue Kit（QIAGEN，Germany）試劑盒說明書提取總的細菌DNA，溶于TE緩沖液，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，-20℃條件貯藏備用。

采用引物27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，533R 5'-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3'，擴增細菌16SrRNA的V1-V3區(qū)。PCR反應(yīng)體系為：5× FastPfu緩沖液4 μL，5 μmol/L的正向引物0.8 μL，5 μmol/L的反向引物 0.8 μL，DNA 10 ng，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，加ddH2O至總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，26個循環(huán)；最終72℃延伸5 min，冷卻至10℃。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，上樣量為3 μL。

1.2.2生物信息學(xué)分析

PCR產(chǎn)物采用Miseq高通量測序平臺進行測序。提取高質(zhì)量序列進行生物信息學(xué)分析。生物信息學(xué)分析：（1）操作單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析：使用QIIME分析平臺進行序列的生物信息學(xué)分析，與Silva數(shù)據(jù)庫中已比對的16S核糖體序列數(shù)據(jù)庫進行比對，對相似性在97%以上的序列進行歸并，生成分類操作單元OTU；（2）菌群分類學(xué)分析：將OTU中全部序列與Silva數(shù)據(jù)庫進行比對，找出其最相近且可信度達80%以上的種屬信息。并將每一個OTU中的所有序列進行類比，找出同一OTU中的不同序列的最近祖先的種屬信息。根據(jù)silva庫中的參考序列對OTU進行種屬鑒定。根據(jù)分類學(xué)比對結(jié)果，在從門至屬水平上對樣品中群落結(jié)構(gòu)進行菌群多樣性和豐度分析，采用R軟件（R i386 3.0.1）進行繪圖分析。

2　結(jié)果與分析

2.1微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在Phylum（門）的水平上，各組樣品的微生物群落構(gòu)成及其相對豐度如圖1所示。

所有樣品均包含F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門）和Proteobacteria（變形菌門）兩個主要的門，腸衣D中含有少量Bacteroidetes（擬桿菌門）。腐敗香腸C含有大量的Firmicutes，占門分類上總微生物含量的94.95%，腸衣中Firmicutes的OTU占總OTU的70.11%。由圖1可見，在門的水平上，各樣品的微生物組成有較大差異，而正常香腸A和B的微生物組成在門的水平上差異較小。

在目（Order）的水平上，各組樣品的微生物群落構(gòu)成及其相對豐度如圖2所示。

圖1　香腸及腸衣樣品中微生物群落在門水平上的相對豐度Fig.1　Relative abundance of bacterial phyla in microbiota of sausages and casing

圖2　香腸及腸衣樣品中微生物群落在目水平上的相對豐度Fig.2　Relative abundance of bacterial order in microbiota of sausages and casing

正常香腸樣品A和B中微生物多樣性較高，OTU含量較高的是Lactobacillales（A：41.71%，B：28.39%）、Enterobacteriales（A：21.82%，B：16.64%）、Pseudomonadales（A：15.48%，B：8.76%）、Vibrionales（A：9.07%，B：40.80%），而腐敗香腸C的微生物菌群多樣性較低，豐度最高的是Lactobacillales，其OTU占總OTU的94.70%；腸衣D的微生物多樣性較高，主要由Lactobacillales（25.18%）、Clostridiales（41.76%）、Enterobacteriales組成（15.51%），腸衣中還含有一定量的Vibrionales、Alteromonadales、Selenomonadales等。

在屬（Genus）的水平上，各組樣品的微生物群落構(gòu)成及其相對豐度如圖3所示。

由圖3可見，在屬（Genus）的水平上，A和B兩種正常香腸的微生物群落中OTU含量最高的是Streptococcus、Kluyvera、Vibrio（B：40.77%）、Lactococcus、Leuconostoc等屬的微生物；而腐敗香腸C的微生物群落在屬水平分類上與正常香腸有較大差異，腐敗香腸中含量較高的微生物主要為Lactobacillus（51.19%）、Leuconostoc（36.94%），其次Weissella、Kluyvera等，根據(jù)其基因序列在種的水平上進一步與數(shù)據(jù)庫已有序列比對發(fā)現(xiàn)，香腸C中的乳酸菌主要為Lactobacil－lus_paraplantarum，明串珠菌主要為Leuconostoc_mesenteroides_subsp._mesenteroides_J18；腸衣D中含量最高的微生物為Peptostreptococcus（37.73%），其次為Lactobacillus、Vagococcus、Plesiomonas等屬的微生物。

2.2香腸及腸衣樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)差異性比較

將豐度在前100位的微生物進行各組間豐度相似性聚類得到圖4。

該圖可通過顏色梯度及相似程度反映幾種樣品在屬水平上群落組成的相似性及各屬微生物OTU的含量。由圖4可見，A和B兩種香腸樣品的微生物群落組成有較高的相似性，而腐敗香腸C和腸衣的微生物群落與正常香腸相比有較大的差異。

基于距離矩陣進行的主坐標分析如圖5所示。

圖3　香腸及腸衣樣品中微生物群落在屬水平上的相對豐度Fig.3　Relative abundance of bacterial genus in microbiota of sausages and casing

圖4　香腸及腸衣樣品中微生物群落熱圖分析Fig.4　Heatmap of sausages and casing

圖5　香腸及腸衣樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的主坐標分析Fig.5　PCoA plots based on unweighted Unifrac metrics

通過上述門、目及屬水平的分析以及微生物群落結(jié)構(gòu)的heatmap分析已初步表明不同香腸樣品及腸衣的微生物群落結(jié)構(gòu)有較大差異。為進一步分析其差別，對每一樣品的OTU信息構(gòu)建了未加權(quán)的Unifrac歐氏距離矩陣（unweighted Unifrac distance matrix）?；谶@一矩陣進行了主坐標分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA），由圖5可見，該分析前兩個主成分分別解釋了總變量的49.19%和38.36%，前兩個主成分共計為87.55%。在X軸的方向上，A和B香腸距離較近，表明A和B香腸的前兩個主成分因素是一致的，而C和D在Y軸的方向上距離較遠，說明Y因素導(dǎo)致C和D之間的微生物群落結(jié)構(gòu)的不同。

3　討論

本研究采用高通量測序技術(shù)分析香腸及腸衣微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)貯藏至不同時期的香腸及腸衣之間，微生物多樣性及豐度均有較大差異。兩種正常香腸微生物多樣性及豐度較為相似；腸衣微生物多樣性也較高，但其微生物組成與正常香腸有較大差異；而腐敗香腸C微生物多樣性較低，優(yōu)勢腐敗菌由Lactobacillus（乳酸菌屬）和Leuconostoc（明串珠菌屬）組成。產(chǎn)品的微生物腐敗是微生物從較低的初始菌數(shù)生長至106～107CFU/g的過程，在此期間，微生物之間通過拮抗、互惠共生或群體感應(yīng)［2］等相互影響，腐敗菌在增殖過程中產(chǎn)酸、產(chǎn)黏液、產(chǎn)生異味等導(dǎo)致香腸的感官方面出現(xiàn)腐敗特性，在此過程中，具有較強競爭力并適應(yīng)此種腐敗環(huán)境的Lactobacillus、Leuconostoc等微生物大量生長繁殖，形成穩(wěn)定的腐敗菌菌相。

研究表明，真空、MPA（氣調(diào)包裝）及有氧條件下，肉制品中的特定腐敗菌主要是乳酸菌［3-5］、腸膜明串珠菌［6-7］及 Weissella、Carnobacteriumdivergens，B.thermosphacta［8］等腐敗菌。本研究與上述報道一致，但上述報道主要針對的是微生物在屬水平上的分類，本研究進一步對腐敗菌在種水平上進行分類，發(fā)現(xiàn)腐敗香腸中的特定腐敗菌主要為Lactobacillus_paraplantarum、Leuconostoc_mesenteroides_subsp_mesenteroides_J18，明確揭示了導(dǎo)致此類天然腸衣香腸腐敗的微生物。

加工肉制品因原料肉的品種、成分等不同，適合生長繁殖的微生物種類也不同，腐敗菌構(gòu)成也因此不同。除原料肉外，輔料、香辛料及其它添加物都會帶來一定種類和數(shù)量的微生物，在加工過程中不可避免地會造成二次污染，使得成品腐敗微生物的菌相構(gòu)成更加復(fù)雜。在貯藏過程中，腐敗微生物的菌相構(gòu)成發(fā)生改變，其中一種或幾種微生物會成為優(yōu)勢菌群，最終成為導(dǎo)致肉和肉制品腐敗的優(yōu)勢腐敗菌；而其它種類則數(shù)量較少，甚至在相互競爭中逐漸消亡。這就是本研究中幾種類型香腸及腸衣微生物多樣性發(fā)生重大變化的原因，到貯藏后期，真正起主導(dǎo)作用的只是Lactobacillus_paraplantarum、Leuconostoc_mesenteroides_ subsp_mesenteroides_J18，其它微生物在競爭中消亡。但此兩種微生物在初始微生物中含量較低（OTU所占比例均在1.00%以下），是何原因?qū)е逻@兩種微生物在腐敗香腸中占據(jù)了絕對的優(yōu)勢，仍需結(jié)合微生物代謝學(xué)及環(huán)境微生物學(xué)等做進一步的研究。其腐敗規(guī)律的揭示，將對在生產(chǎn)及貯藏中減少天然腸衣香腸的微生物污染，延長產(chǎn)品的貨架期有著重要的意義。

參考文獻：

［1］Miambi E，Guyot JP，Ampe F.Identification，isolation and quantification of representative bacteria from fermented cassava dough using an integrated approach of culture-dependent and culture-independent methods［J］.International Journal of Food Microbiology，2003，82（2）：111-120

［2］Ammor MS，Michaelidis C，Nychas G-JE.Insights into the role of quorum-sensingin food spoilage［J］.Journal of Food Protection，2008，71（7）：1510-1525

［3］Borch E，Kant-Muermans ML，Blixt Y.Bacterial spoilage of meat and cured meat products［J］.International Journal of Food Microbiology，1996，33（1）：103-115

［4］Samelis J，Kakouri A，Rementzis J.Selective effect of the product type and the packaging conditions on the species of lactic acid bacteria dominating the spoilage microbial association of cooked meats at 4℃［J］.Food Microbiology，2000，17（3）：329-340

［5］Pothakos V，Devlieghere F，Villani F，et al.Lactic acid bacteria and their controversial role in fresh meat spoilage［J］.Meat Science，2015，109：66-74

［6］ Hastings JW，Stiles ME，vonHoly A.Bacteriocins of Leuconostocs isolated from meat［J］.International Journal of Food Microbiology，1994，24（1/2）：75-81

［7］Hu P，Zhou GH，Xu XL，et al.Characterization of the predominant spoilage bacteria in sliced vacuum-packed cooked ham based on 16S rDNA-DGGE［J］.Food Control，2009，20（2）：99-104

［8］Korkeala HJ，Bj?rkroth KJ.Microbiological spoilage and contamination of vacuum-packaged cooked sausages［J］.Journal of Food Protection，1997，51（6）：302-303

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.027

基金項目：國家自然科學(xué)基金（31501442）；天津市重點支撐項目（14ZCZDNC00015）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費項目（201303082-3）；天津科技大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金（2014CXLG03）

作者簡介：滕安國（1982—），男（漢），實驗師，碩士，研究方向：肉品加工與質(zhì)量控制。

*通信作者：張芹（1981—），女（漢），助理研究員，碩士，研究方向：食品微生物。

收稿日期：2016-03-28

Application of High-throughput Sequencing to Analyze Microbial Composition of Sausages with Natural Casing

TENG An-guo，QI Xiao-na，ZHANG Qin*，WANG Wen-hang
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：Microbial diversity and abundance among sausages with natural casing stored to different periods were analyzed by Miseq high-throughput sequencing technology.The results showed that the microbial diversity and abundance were relatively high in normal sausages and natural casing.However，the microbial diversity in spoilage sausage was low，the bacteria enriched in spoilage sausage were from genus Lactobacillus and Leuconostoc.Classified at the level of species，Lactobacillus_paraplantarum and Leuconostoc_mesenteroides_subsp_mesenteroides_J18 were the dominant bacteria in spoilage sausage.

Key words：sausages with natural casing；microbial diversity；high-throughput sequencing