趙孝先，高玲，楊文，黃建麗，趙凱，，*（.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北石家莊0500；.河北凱盛醫(yī)藥科技有限公司，河北石家莊05005；.江西歐氏藥業(yè)有限責(zé)任公司，江西新余8004）

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響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖脫色工藝研究

趙孝先1，高玲1，楊文2，黃建麗3，趙凱2，3，*
（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北石家莊050011；2.河北凱盛醫(yī)藥科技有限公司，河北石家莊050035；3.江西歐氏藥業(yè)有限責(zé)任公司，江西新余338004）

摘要：選擇不同大孔吸附樹(shù)脂對(duì)香菇多糖提取液脫色，發(fā)現(xiàn)DA201-CⅡ樹(shù)脂具有較好的脫色率，且對(duì)多糖的吸附也較少；在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，以香菇多糖提取液濃度、樹(shù)脂用量和溫度為自變量，脫色率為響應(yīng)值，確定了利用DA201-CⅡ樹(shù)脂對(duì)香菇多糖提取液脫色的最佳工藝條件：香菇多糖提取液濃度為1.9mg/mL，樹(shù)脂用量為11g/100mL，溫度為51℃，脫色率達(dá)到最高為80.04%，多糖保留率最高為93.45%。

關(guān)鍵詞：香菇多糖；大孔吸附樹(shù)脂；響應(yīng)面法；脫色

香菇多糖（Lentinan，LNT）是從傘菌科真菌香菇（Lentinus edodes）的子實(shí)體中分離到的一種β-1，3-葡聚糖，具有廣泛的藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤、抗衰老作用、提高免疫和刺激干擾素形成、對(duì)化學(xué)物質(zhì)所致肝損傷具有保護(hù)作用以及作為L(zhǎng)AK細(xì)胞活性向上調(diào)節(jié)劑（LURA）等，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［1-5］。在香菇多糖的提取液中，色素、雜蛋白以及一些小分子物質(zhì)是主要的雜質(zhì)，色素的來(lái)源主要有3個(gè)方面：1）原料本身帶有的；2）菌體代謝所產(chǎn)生的；3）發(fā)酵液中某些成分的相互反應(yīng)。目前多香菇多糖的脫色工藝主要有活性炭吸附法［6-9］、雙氧水氧化法［10-11］、樹(shù)脂吸附法［12-14］等，但脫色效果均不是很理想。本試驗(yàn)探討了大孔吸附樹(shù)脂對(duì)香菇多糖提取液中色素的脫色研究，以便為采用樹(shù)脂吸附法脫色進(jìn)行工業(yè)化設(shè)計(jì)及生產(chǎn)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

D3520、X-5、S-8、AB-8樹(shù)脂：購(gòu)于南開(kāi)大學(xué)化工廠；DA201-CⅡ樹(shù)脂：購(gòu)于江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司。TU-1800S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HHS-4S電子恒溫不銹鋼水浴鍋：余姚市上通溫控儀器廠；TGL-15B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FA2004電子分析天平：上海精科天平公司。

香菇多糖提取液：自制［15-17］。

1.2方法

1.2.1多糖含量測(cè)定

采用校正的苯酚-硫酸法［18］，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定香菇多糖含量。多糖保留率按以下公式計(jì)算。

1.2.2色素測(cè)定

采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處的吸光度［19］。脫色率按以下公式計(jì)算。

1.2.3樹(shù)脂預(yù)處理

大孔樹(shù)脂的預(yù)處理：工業(yè)級(jí)新樹(shù)脂使用前必須進(jìn)行預(yù)處理，以去除樹(shù)脂中可能含有的未聚合的單體、致孔劑及分裂物等毒性物質(zhì)［20］。

大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)法預(yù)處理：

1）用95%乙醇在室溫條件下浸泡24 h，其間每隔15 min攪拌1次，每次浸泡2 h后濾出乙醇，加入新乙醇，最后用去離子水洗凈；

2）用4%鹽酸溶液室溫浸泡3 h，再用去離子水洗凈；

3）用5%Na0H溶液室溫浸泡3 h，再用去離子水洗凈；

4）用去離子水室溫浸泡24 h，使樹(shù)脂充分溶脹備用。

1.2.4樹(shù)脂篩選

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過(guò)的各種大孔吸附樹(shù)脂20 g，分別置于250 mL磨口三口瓶中，加入多糖濃度為2× 10-3g/mL的溶液100 mL，恒溫振蕩，每1 h測(cè)定各樹(shù)脂的脫色率、多糖保留率。

1.2.5單因素條件確定

準(zhǔn)確配置一定濃度的多糖溶液100 mL于錐形瓶中，按照一定比例加入大孔樹(shù)脂，調(diào)節(jié)至一定溫度后振蕩，每1 h測(cè)定各樹(shù)脂的脫色率、多糖保留率。

1.2.6響應(yīng)面試驗(yàn)

利用單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)香菇多糖大孔樹(shù)脂脫色工藝進(jìn)行優(yōu)化，以香菇多糖初始濃度、脫色溫度、樹(shù)脂加入量設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)。Box-Behnken中心組合試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1　 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1　Factors，levels and cade of variables for response surface design

2　結(jié)果與討論

2.1樹(shù)脂篩選

在靜態(tài)吸附條件下，利用D3520、S-8、X-5、AB-8、DA201-CⅡ樹(shù)脂對(duì)香菇多糖提取液進(jìn)行脫色研究，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　 脫色率及多糖保留率Fig.1　Decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖1中可以發(fā)現(xiàn)，在6種樹(shù)脂中，D3520、S-8、X-5 3種大孔吸附樹(shù)脂的脫色效果相差不是很大，大孔吸附樹(shù)脂AB-8、DA201-CⅡ的脫色效果藥明顯優(yōu)于其余3種樹(shù)脂，大孔吸附樹(shù)脂X-5、DA201-CⅡ的多糖保留率要明顯優(yōu)于其余3種樹(shù)脂，綜合考慮脫色率和多糖保留率，試驗(yàn)選擇DA201-CⅡ大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色工藝優(yōu)化。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1脫色溫度

以脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，考察了脫色溫度對(duì)脫色效果和多糖損失的影響。分別選取了20、30、40、50℃和60℃5個(gè)脫色溫度進(jìn)行大孔樹(shù)脂脫色試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以發(fā)現(xiàn)，脫色率隨著溫度升高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，脫色率達(dá)到最大值80.05%，當(dāng)溫度繼續(xù)增加時(shí)，脫色率出現(xiàn)了下降趨勢(shì)；而多糖保留率隨著溫度的增加而出現(xiàn)緩慢的下降。這是由于高溫會(huì)抑制大孔吸附樹(shù)脂的吸附能力，導(dǎo)致其對(duì)色素和多糖的吸附量的減少。綜合考慮脫色率和多糖保留率。選取50℃作為中心水平。

2.2.2樹(shù)脂加入量

以脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，考察了樹(shù)脂加入量對(duì)脫色效果和多糖損失的影響。分別選取了2.5、5.0、10、20、40 g/100 mL 5個(gè)樹(shù)脂加入量進(jìn)行大孔樹(shù)脂脫色試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2　脫色溫度對(duì)脫色率和多糖保留率的影響Fig.2　The effects of extraction temperature on decolorization rate and polysaccharide retention rate

圖3　樹(shù)脂加入量對(duì)脫色率和多糖保留率的影響Fig.3　The effects of addition resin on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖3可以發(fā)現(xiàn)，隨著樹(shù)脂加入量的增加，脫色率也隨之增大，而多糖保留率會(huì)隨著樹(shù)脂加入量的增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是由于足夠量的樹(shù)脂，雖然可以充分吸附色素，但是對(duì)多糖的吸附也會(huì)增大。綜合考慮脫色率和多糖保留率。選取10 g/mL作為中心水平。

2.2.3香菇多糖提取液濃度

以脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，考察了香菇多糖提取液濃度對(duì)脫色效果和多糖損失的影響。分別選取了0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL和8.0 mg/mL 5個(gè)香菇多糖提取液濃度進(jìn)行大孔樹(shù)脂脫色試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　香菇多糖提取液濃度對(duì)脫色率和多糖保留率的影響Fig.4　The effects of lention concentration on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖4可以發(fā)現(xiàn)，隨著香菇多糖提取液濃度的增加，脫色率也逐漸增大，當(dāng)香菇多糖初始濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí)，脫色率達(dá)到最大（79.16%），繼續(xù)增加濃度時(shí)，脫色率無(wú)明顯變化。多糖保留率則隨著香菇多糖提取液濃度的增加呈現(xiàn)出緩慢的下降，基本保持在93%左右。綜合考慮脫色率和多糖保留率。選取2 mg/mL香菇多糖提取液濃度作為中心水平。

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

從單因素試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，3個(gè)因素對(duì)脫色率的影響非常明顯，對(duì)多糖保留率的影響不顯著。因此，以脫色率為響應(yīng)值Y，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Test design and results of response surface analysis

對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：

Y=79.99+0.31A+0.59B-0.44C-0.20AB+0.035AC-0.72BC-2.94A2-2.89B2-3.94C2

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　回歸模型方差分析Table 3　Variance analysis of regression model

續(xù)表3　 回歸模型方差分析Continue table 3　Variance analysis of regression model

回歸模型P＜0.0001，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.258 0，不顯著，說(shuō)明該模型成立。回歸模型中一次項(xiàng)B、C、二次項(xiàng)BC、A2、B2、C2對(duì)Y值的影響顯著。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.992 0，說(shuō)明擬合程度好，校正決定系數(shù)R2adj=0.981 7。由F值可知，各因素對(duì)多糖脫色率的影響大小順序?yàn)锽（樹(shù)脂加入量）＞C（濃度）＞A（脫色溫度）。

2.4響應(yīng)面分析及最優(yōu)脫色條件確定

根據(jù)回歸方程做出相應(yīng)面分析圖及等高線，見(jiàn)圖5～圖7，Y為脫色率。

圖5　響應(yīng)面法（脫色溫度、樹(shù)脂用量）立體分析圖和等高線圖Fig.5　The graph of response surface methodology（decoloration temperature，addition resin）including 3D and corresponding contour map

圖6　響應(yīng)面法（脫色溫度、香菇多糖提取液濃度）立體分析圖和等高線圖Fig.6　The graph of response surface methodology（decoloration temperature，lention concentration）including 3D and corresponding contour map

圖7　響應(yīng)面法（樹(shù)脂用量、香菇多糖提取液濃度）立體分析圖和等高線圖Fig.7　Thegraphofresponsesurfacemethodology（additionresin，lentionconcentration）including3Dandcorrespondingcontourmap

回歸模型中Y的最大估值為80.64%，與之對(duì)應(yīng)的自變量脫色溫度（A）、樹(shù)脂加入量（B）和香菇多糖提取液濃度（C）分別為50.59℃、10.55 g/100 mL、1.94 mg/mL。根據(jù)實(shí)際操作，選取脫色溫度（A）=51℃，樹(shù)脂加入量（B）=11 g/100 mL，香菇多糖提取液濃度（C）=1.9 mg/mL。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

在優(yōu)化后的脫色條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明DA201-CⅡ樹(shù)脂對(duì)香菇多糖脫色率為80.04%，多糖保留率為93.45%，與預(yù)測(cè)者接近，及擬合度良好。

3　結(jié)論

采用了響應(yīng)面分析法對(duì)香菇多糖提取液進(jìn)行了大孔樹(shù)脂脫色研究。通過(guò)樹(shù)脂篩選得到了適合香菇多糖脫色的大孔樹(shù)脂DA201-CⅡ；利用單因素試驗(yàn)與Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)。對(duì)脫色工藝進(jìn)行了因素考察優(yōu)化。通過(guò)二次回歸獲得了各個(gè)因素的回歸模型，并得到了最優(yōu)脫色條件：脫色溫度（A）=51℃，樹(shù)脂加入量（B）=11 g/100 mL，香菇多糖提取液濃度（C）= 1.9mg/mL。其脫色率為80.04%，多糖保留率為93.45%，該結(jié)果為樹(shù)脂吸附法脫色進(jìn)行工業(yè)化設(shè)計(jì)及生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.024

作者簡(jiǎn)介：趙孝先（1968—），男（漢），主治醫(yī)師，學(xué)士，從事藥物研發(fā)與臨床應(yīng)用。

*通信作者：趙凱（1965—），男（漢），正高級(jí)工程師，博士，主要從事藥物研究與開(kāi)發(fā)工作。

收稿日期：2015-05-19

Optimizaition of Decolorization of Lentinan Using Response Surface Methodology

ZHAO Xiao-xian1，GAO Ling1，YANG Wen2，HUANG Jian-li3，ZHAO Kai2，3，*

（1.The Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，Hebei，China；2.Hebei Kingsci Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Shijiazhuang 050035，Hebei，China；3.Jiangxi Ourshi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Xinyu 338004，Jiangxi，China）

Abstract：The application of macroporous adsorption resin to purify lentinan，it was found that macroporous adsorption resin DA201-CⅡhad the highest decolorization rate and the lowest polysaccharide retention rate.With decolorization rate as the response value，the influence of amount of lention concentration，addition resin，and decoloration temperature on the process of decolorization were investigated systematically by using one-factor experitments and Box-Behnken design.The results showed that the optimum decolorizing conditions of lentinan by resin DA201-CⅡwere as follows：lention concentration 1.9 mg/mL，addition resin 11 g/100 mL，decoloration temperature 51℃.Under this condition，the decolorization rate and retention rate of polysaccharide were 80.04%and 93.45%.

Key words：lentinan；macroporous adsorption resin；response surface methodology；decolorization