張祎，趙婷婷，趙炳涵，王策，潘卓，王昕

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130025）

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發(fā)芽糙米富集GABA的超聲波處理條件優(yōu)化

張祎，趙婷婷，趙炳涵，王策，潘卓，王昕*

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130025）

摘要：采用單因素和響應(yīng)面試驗研究超聲波對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響，結(jié)果表明：超聲波輔助處理對發(fā)芽糙米富集GABA的最佳處理條件為pH6.0、溫度40℃、在發(fā)芽17 h時進行超聲波處理，超聲波處理時長16 min、超聲頻率30kHz，此條件下發(fā)芽糙米中得到的GABA含量平均值為77.56mg/100g；影響因素按大小順序為超聲波處理時長、超聲波處理時刻、超聲波處理頻率。利用響應(yīng)面法得到GABA含量的數(shù)學(xué)模型的理論值是77.91 mg/100 g，實測值與模型基本相符，模型可靠。

關(guān)鍵詞：發(fā)芽糙米；GABA；響應(yīng)面法；超聲波

糙米含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)，且富集了多種長壽因子［1］。其中γ－氨基丁酸由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化而來，具有醒酒、健腦、降壓、防止動脈硬化等生理功能［2－3］，因而它被廣泛應(yīng)用在食品和制藥工業(yè)中［4－5］。發(fā)芽后的糙米，由于機體內(nèi)谷氨脫羧酶等內(nèi)源酶被激活，催化一系列生理生化反應(yīng)，進而使GABA含量也大大提高［6］。

有實驗表明，超聲波能量作用于酶分子，可使酶分子的構(gòu)象發(fā)生改變，進而改變酶的生物活性［7］。同時超聲波處理情況下，植物細胞壁周圍物質(zhì)降解，細胞內(nèi)Ca2+和H+濃度增加，可以有效激活GAD酶活性，顯著促進GABA在發(fā)芽過程中的積累［8］。目前國內(nèi)外多近年來人們大多用化學(xué)方法處理糙米，來研究化學(xué)成分對糙米發(fā)芽過程中營養(yǎng)組分的影響［9-12］，利用物理方法處理發(fā)芽糙米的研究不多，其中有關(guān)超聲波預(yù)處理對糙米發(fā)芽影響的報道也很少［13］。本文主要針對發(fā)芽糙米內(nèi)GABA含量進行研究，探討出超聲波對發(fā)芽糙米富集GABA的最優(yōu)條件，進而使超聲波處理條件得到優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

糙米：購于天貓五谷商鋪。

無水乙醇、次氯酸鈉、硼酸、氯化鈉、硼酸鈉、重蒸酚均購于長春市浩迪試劑有限公司。

1.2儀器設(shè)備

WF-130萬能粉碎機：北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司；MM721AAU-PW微波爐：廣州美的生活電器制造有限公司；JJ200型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；HH數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋；DHP060電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海實驗儀器廠有限公司；101A-1BT型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海實驗儀器有限公司；探頭式超聲波流體處理器：美國Misonix公司。

1.3方法

1.3.1發(fā)芽糙米制備方法

糙米→消毒→清洗→浸泡→發(fā)芽→超聲波處理→檢測

1.3.2糙米發(fā)芽

取經(jīng)挑選、除雜、均勻的糙米3.0 kg左右，漂洗干凈，用1%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min對其表面消毒，然后用去離子水沖洗5次，并用去離子水作浸泡處理，采用浸泡3 h，斷水15 min，再浸泡3 h工藝，之后于32℃通氣培養(yǎng)36 h（通氣量為1.0 L/min）［14］。

1.3.3發(fā)芽糙米的干燥

將發(fā)芽糙米清洗、瀝干后，取等量米用微波干燥方式對發(fā)芽糙米分別進行干燥。本實驗干燥后發(fā)芽糙米水分含量為（14±0.5）%，達到安全貯藏水分要求。

1.3.4發(fā)芽糙米GABA含量測定方法

參照許建軍［15］和陳恩成［16］的方法，將干燥后的發(fā)芽糙米粉，稱取1.0 g，用60%乙醇定容至5 mL后，振蕩浸提2 h，過濾。取濾液0.5 mL，依次加入0.2 mL 0.2 mol/L pH9.0的硼酸緩沖液，1 mL 6%的重蒸酚溶液，0.4 mL有效氯為9%的次氯酸鈉，充分振蕩；沸水浴10 min后，立即冰浴20 min并不斷地振蕩，直至有藍綠色化合物出現(xiàn)，然后加入2 mL 60%的乙醇，然后從高到低依次于645 nm下比色，測吸光值A(chǔ)。同時另取同體積未加濾液的樣液（補加0.5 mL水），作為樣品基本空白，與標準曲線相比較定量。

2　超聲波處理單因素試驗

比較超聲波處理對發(fā)芽糙米GABA含量的影響，并選擇較優(yōu)的處理方式。變化超聲波處理時長、時刻、頻率、溫度、pH因素中的一個，固定其余因素水平研究各因素對發(fā)芽糙米GABA含量的影響。選取各因素的最佳水平，為響應(yīng)面優(yōu)化最佳超聲波處理方式提供理論依據(jù)。采用Excel軟件繪制單因素試驗圖，采用Design－Expert8.0對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析。

2.1超聲波處理時長對發(fā)芽糙米中GABA含量影響

稱取糙米30.0 g，固定超聲波處理時刻為0 h、頻率為30 kHz、溫度為40℃、pH為6.0，分別用超聲波處理0、5、10、15、20、25、30 min，考察超聲波處理時長對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響，如圖1所示。

圖1　超聲波處理時長對發(fā)芽糙米中GABA含量影響Fig.1　Eeffect of ultrasonic treatment duration on GABA in germinated brown rice

圖1可見，超聲波處理可促進發(fā)芽糙米中GABA含量的增加。隨著超聲波處理時長的增加，發(fā)芽糙米中GABA的含量逐漸增加，當超聲處理時長為15 min時，發(fā)芽糙米中GABA的含量達到最大值；隨著超聲波處理時長的增加，可能導(dǎo)致部分GABA發(fā)生降解。因此初步確定最佳超聲波處理時長為15 min。

2.2超聲波處理時刻對發(fā)芽糙米中GABA含量影響

稱取糙米30.0 g，固定超聲波處理時長為15min、頻率為30 kHz、溫度為40℃、pH為6.0，超聲波處理時刻分別為糙米發(fā)芽0、4、8、12、16、20、24 h，考察超聲波處理時刻對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響，如圖2所示。

圖2　超聲波處理時刻對發(fā)芽糙米中GABA含量影響Fig.2　Eeffect of ultrasonic treatment time on GABA in germinated brown rice

由圖2可見，隨著超聲波處理時刻的延長，發(fā)芽糙米中GABA的含量逐漸增加；在超聲波處理時刻為發(fā)芽16 h時，發(fā)芽糙米中GABA的含量達到最大值；隨著超聲波處理時刻的延長，可能導(dǎo)致部分GABA在發(fā)芽過程中發(fā)生降解。因此初步確定最佳超聲波處理時刻為16 h。

2.3超聲波處理頻率對發(fā)芽糙米中GABA含量影響

稱取糙米30.0 g，固定超聲波處理時長為15 min、處理時刻為16 h、溫度為40℃、pH為6.0，超聲波頻率分別為10、15、20、25、30、35、40、45 kHz，考察超聲波頻率對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響，如圖3所示。

圖3　 　超聲波處理頻率對發(fā)芽糙米中GABA含量影響Fig.3　Effect of ultrasonic treatment frequency on GABA in germinated brown rice

由圖3可見，隨著超聲波頻率的增加，發(fā)芽糙米中GABA的含量逐漸增加；因為頻率越高，空化效應(yīng)越大，越利于GABA的富集，在超聲波頻率為30 kHz時，發(fā)芽糙米中GABA的含量達到最大值；隨著超聲波頻率的增加，可能產(chǎn)生瞬間高溫，導(dǎo)致部分GABA被破壞。因此初步確定最佳超聲波頻率為30 kHz。

2.4超聲波處理時溫度對發(fā)芽糙米中GABA含量影響

稱取糙米30.0 g，固定超聲波處理時長為15 min、處理時刻為16 h、頻率為30 kHz、pH6.0，超聲波處理溫度分別為10、20、30、40、50、60、70℃，考察超聲波處理溫度對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響，如圖4所示。

圖4　超聲波處理時溫度對發(fā)芽糙米中GABA含量影響Fig.4　Effect of ultrasonic treatment temperature on GABA in germinated brown rice

由圖4可見，隨著超聲波處理溫度的增加，發(fā)芽糙米中GABA的含量逐漸增加；在超聲波處理溫度為50℃時，發(fā)芽糙米中GABA的含量達到最大值；之后隨著超聲波處理溫度的升高，高溫導(dǎo)致用于合成GABA的谷氨酸脫羧酶活性降低。因此初步確定最佳超聲波頻率為50℃。

2.5超聲波處理時pH值對發(fā)芽糙米中GABA含量影響稱取糙米30.0 g，固定超聲波處理時長為15 min、處理時刻為16 h、頻率為30 kHz、溫度為40℃，超聲波處理時pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，考察超聲波處理時pH值對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響，如圖5所示。

圖5　超聲波處理時pH值對發(fā)芽糙米中GABA含量影響Fig.5　Effect of ultrasonic treatment pH on GABA in germinated brown rice

由圖5可見，隨著超聲波處理時pH值的增加，發(fā)芽糙米中GABA的含量逐漸增加；在超聲波處理時pH值為6.0時，發(fā)芽糙米中GABA的含量達到最大值；之后隨著超聲波處理時pH的增加，發(fā)芽糙米中GABA的含量下降；一定的酸或堿性條件下導(dǎo)致谷氨酸脫羧酶活性降低，進而減緩了GABA的合成速度被破壞。并初步確定最佳超聲波處理時pH值為6.0。

3　超聲波處理對發(fā)芽糙米GABA富集條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

3.1分析因素選擇及確定方案

根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取超聲波時長X1、超聲波時刻X2和超聲頻率X3進行三因素三水平響應(yīng)面試驗，并以+1、0、-1分別表示自變量的高、中、低水平，GABA含量為響應(yīng)值（目標函數(shù)Y），試驗設(shè)計見表1。

表1　響應(yīng)面法因素水平表Table 1　Variables and levels in response surface design

取15個試驗點分為12個析因點和3個零點，其中，析因點為自變量，取值在X1、X2、X3構(gòu)成的三維頂點上，零點為區(qū)域的中心點，零點重復(fù)3次，估計試驗誤差。響應(yīng)面分析結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面分析及試驗結(jié)果Table 2　The analysis of response surface methodology and test results

3.2模型建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到GABA預(yù)測值Y對X1、X2、X3的二次多項式回歸方程如下：Y=75.512+10.083 75X1+ 8.642 5X2+3.471 25X3-0.2X1X2+0.227 5X1X3-0.805X2X3-13.459 8X12-13.893 2X22-3.344 75X32，式中：X1為超聲波處理時長；X2為超聲波處理時刻；X3為超聲頻率；方程中各項系數(shù)的絕對值直接反映了各因素對多酚得率的影響程度，系數(shù)的正負反映了影響的方向。

回歸方程可信度分析見表3。

表3　 回歸方程可信度分析Table 3　Reliability analysis for the regression equation

其中R2=0.975 5，表明97.55%的數(shù)據(jù)可以用此方程來解釋，說明方程可靠性較高。CV值越低顯示試驗穩(wěn)定性越好，本試驗中CV值為5.61%說明試驗操作可信。綜上說明了此方程可以用來分析和預(yù)測超聲波對GABA含量的影響的工藝結(jié)果。

模型系數(shù)顯著性檢驗和結(jié)果見表4。

表4　 模擬系數(shù)顯著性檢驗和結(jié)果Table 4　Simulation Significant test of regression coefficients and the results

表明各因素對GABA含量的影響不同，各因素對模型影響程度大小依次是X1＞X2＞X3，即超聲波處理時長影響最大，超聲波處理時刻次之，超聲波處理頻率影響較少。該分析結(jié)果與方差F值分析結(jié)果一致。

3.3響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y與對應(yīng)的試驗因素X1（超聲波處理時長）、X2（超聲波處理時刻）、和X3（超聲頻率）構(gòu)成的一個空間三維曲面圖，把各因素交互關(guān)系直觀的反映了出來對響應(yīng)值Y的影響。采用Design Expert 8.0軟件以回歸方程式繪制響應(yīng)面和等高線圖，如圖6～圖8所示。

圖6　DH＝f（X1，X2）的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6　Response surface and contour plot of DH＝f（X1，X2）

圖7　DH＝f（X1，X3）的響應(yīng)面和等高線Fig.7　Response surface and contour plot of DH＝f（X1，X3）

圖8　DH＝f（X2，X3）的響應(yīng)面和等高圖Fig.8　Response surface and contour plot of DH＝f（X2，X3）

圖6為超聲波處理時長和超聲波處理時刻對GABA含量的影響。由圖6曲面圖可知，當超聲頻率一定時，隨著超聲波處理時長的增加，GABA含量出現(xiàn)先增后減的趨勢，曲線較陡；隨著超聲波處理時刻的增加，GABA含量出現(xiàn)先增后減的趨勢，曲線較陡；由圖6等高線可知，超聲波處理時長和超聲波處理時刻的交互作用不顯著。圖7為超聲波處理時長和超聲頻率對GABA含量的影響。由圖7曲面圖可知，超聲波處理時刻一定時，隨著超聲波處理時長的增加，GABA含量出現(xiàn)先增后減的趨勢，曲線較陡；隨著超聲頻率的增加，GABA含量變化不明顯，曲線平滑；由圖7等高線可知，超聲波處理時長和超聲波處理時刻的交互作用不顯著。圖8為超聲波處理時刻和超聲頻率對GABA含量的影響。由圖8曲面圖可知，超聲波處理時長一定時，隨著超聲波處理時刻的增加，GABA含量出現(xiàn)先增后減的趨勢，曲線較陡；隨著超聲頻率的增加，GABA含量變化不明顯，曲線平滑；由圖8等高線可知，超聲波處理時長和超聲波處理時刻的交互作用不顯著。

3.4確定最佳工藝條件

由響應(yīng)面分析可知，回歸模型存在最大值，GABA含量的最大值為77.91 mg/100 g，最高點位于試驗設(shè)計范圍內(nèi)，最大值對應(yīng)各因素：X1=15.67，X2=16.53，X3= 30.67，即超聲波處理發(fā)芽糙米的最佳條件為：超聲波處理時長15.67 min，超聲波處理時刻16.53 h，超聲頻率30.67 kHz。為檢測RSM法的可靠性，采用上述最佳條件進行驗證性試驗，結(jié)合實際操作條件，將最佳工藝條件修正為：pH6.0、溫度40℃、超聲波處理時長16 min、超聲波處理時刻17 h、超聲頻率30 kHz，在此條件下進行3平行實驗，發(fā)芽糙米GABA含量平均含量為77.56 mg/100 g，基本相符，說明回歸方程能真實反映各因素對GABA含量的影響，優(yōu)化結(jié)果可靠，對于發(fā)芽糙米富集GABA條件有指導(dǎo)意義。

4　結(jié)論

通過響應(yīng)面分析可以得出，在超聲波處理對發(fā)芽糙米中GABA含量的各影響因素（超聲波處理時間、超聲波處理時刻、超聲波處理頻率）中，以超聲波處理時長和超聲波處理時刻對GABA含量影響最為顯著，各因素之間交互作用明顯，通過軟件優(yōu)化得出超聲波對發(fā)芽糙米GABA富集的最佳工藝條件為pH6.0、溫度40℃、超聲波處理時長16 min、超聲波處理時刻17 h、超聲頻率30 kHz，GABA含量為77.56 mg/100 g，與模型預(yù)測值77.91 mg/100 g基本相符，可信度高。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.009

作者簡介：張祎（1994—），女（漢），本科生，研究方向：食品科學(xué)與工程。

*通信作者：王昕（1970—），女，教授，博士，研究方向：食品保藏與加工理論新技術(shù)。

收稿日期：2015-04-27

Optimization of Ultrasonic Treatment for Enriching GABA in Germinated Brown Rice

ZHANG Yi，ZHAO Ting-ting，ZHAO Bing-han，WANG Ce，PAN Zhuo，WANG Xin*

（College of Agriculture and Biology Engineering，Jilin University，Changchun 130025，Jilin，China）

Abstract：One-factor-at-a-time and response surface methodology（RSM）was used to study the effect on the content of GABA given by the ultrasonic.The result showed that the best condition is that when the brown rice was treated by the 30 kHz ultrasonic which was maintained around pH6 at 40℃after 17-hour germination.The above conditions displayed different effects as the following order：ultrasonic assisted extraction lasting time，extraction time，extraction frequency.The average content of GABA was 77.56 mg/100 g which correspond to the model and the model was reliable.

Key words：germinated brown rice；GABA；response surface methodology；ultrasonic treatment