曾敏，魏燾，李柯，王傳花，陳稠薇，王遠亮

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南長沙410128）

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藍莓果酒對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

曾敏，魏燾，李柯，王傳花，陳稠薇，王遠亮*

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南長沙410128）

摘要：探討藍莓果酒延緩秀麗隱桿線蟲壽命的活性物質。以秀麗隱桿線蟲為模式生物，喂食原花青素（proanthocyanidin，PC）（0、1、2、3、4、5mg/mL）和食用乙醇（0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%）的藍莓果酒，測定線蟲壽命、生殖能力和運動能力。與對照組比較，酒精度14%、不同濃度的原花青素的藍莓果酒對線蟲壽命均具有延緩作用，3 mg/mL濃度后線蟲壽命延長（P＜0.05）；對生殖能力和運動能力均有不同程度的增強效果（P＜0.05），但5 mg/mL后，效果不明顯；喂食原花青素3mg/mL、不同酒精度的藍莓果酒的線蟲壽命均會縮短，其作用與酒精度呈正相關關系，生殖能力和運動能力均有不同程度的減弱。藍莓果酒中的原花青素具有延緩線蟲壽命的作用，濃度在3 mg/mL到5 mg/mL作用明顯；酒精的影響會隨著添加濃度的增加而加速線蟲的死亡。

關鍵詞：秀麗隱桿線蟲；藍莓果酒；原花青素；酒精；衰老

目前，已經(jīng)確定藍莓果酒的主要功能成分為原花青素，是一種縮合單寧，廣泛存在于各種植物的核、皮或種籽等部位［3-5］的多酚化合物。關于原花青素的研究較多，如王艷菊［6］等以壽命為試驗終點研究了葡萄籽原花青素對秀麗隱桿線蟲壽命的影響，發(fā)現(xiàn)了原花青素具有延緩線蟲壽命的作用，該試驗結果可間接證明以原花青素為功能成分的產(chǎn)品具有延緩衰老的特性。但并無研究直接證明藍莓果酒具有延緩衰老的作用。目前，國內(nèi)外對于藍莓果酒的研究，主要是針對藍莓果酒主要成分及藍莓果酒發(fā)酵工藝的研究。如陳?。?］等對藍莓花青素抗氧化進行了研究，發(fā)現(xiàn)藍莓花青素有較好的清除DPPH自由基的能力；Jin Gook KIM等［8］也對藍莓果酒的主要原料藍莓果實品質、花青素、總酚含量和抗氧化做了詳細的研究。李立功等［9］采用發(fā)酵法生產(chǎn)藍莓果酒的最佳配方及生產(chǎn)工藝，探索藍莓果酒發(fā)酵最佳工藝；楊曙方等［10］重點研究了藍莓果酒主發(fā)酵工藝。本研究選取國際上公認的在延緩衰老研究領域中具有優(yōu)勢的主要模式生物秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，簡稱線蟲）作為研究對象，以整體動物壽命試驗作為檢測手段［11］，測定喂食藍莓果酒的線蟲平均壽命、產(chǎn)卵數(shù)、頭部擺動頻率和身體彎曲頻率，確定藍莓果酒對線蟲壽命的影響。

1　材料與方法

1.1菌株和線蟲

菌株E.coli OP50、野生型秀麗隱桿線蟲Bristol （N2）：東南大學。

1.2儀器和試劑

藍莓果酒（酒精度14%，總糖115.71 g/L，揮發(fā)酸0.64 g/L，原花青素3 360.63 mg/mL）；PC標準品（純度≥95%）：成都曼斯特生物科技有限公司；食用乙醇：天津市大茂化學試劑廠；MJX-250B-Z電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅試驗有限公司；Motic SMZ-168連續(xù)變倍體式顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；SW-CJ-1FD單人單面超凈工作臺：蘇州凈化儀器廠。

1.3試驗方法

1.3.1線蟲培養(yǎng)

采用Brenber［12］的方法，將雌雄同體線蟲飼養(yǎng)于涂布大腸桿菌OP50（E.coli OP50）線蟲標準培養(yǎng)基（Nematode Growth Medium，NGM）上，NGM配制：3 gNaCl，2.5 g胰蛋白胨，17 g瓊脂粉，加入975 mL蒸餾水，加入5 mg/mL膽固醇溶液（無水乙醇配制）1 mL，在121℃、30 min高壓滅菌后在無菌條件下加入 1 mol/mL K2HPO4-KH2PO4緩沖液25 mL（121℃、30 min高壓滅菌），抽濾滅菌的1 mol/mLMgSO41 mL，1 mol/mL CaCl21 mL。培養(yǎng)溫度20℃，觀察線蟲生長情況，定期將線蟲轉至新的E.coli OP50的NGM培養(yǎng)基中。

1.3.2線蟲同期化

秀麗線蟲同期化培養(yǎng)，由于雌雄同體的秀麗隱桿線蟲在L3期體內(nèi)已經(jīng)儲存有大量的卵子，所以到L4期時雌雄同體的秀麗隱桿線蟲不需要交配就可以直接繁殖出后代。提取20條處于L4期的雌雄同體的秀麗隱桿線蟲至涂有E.coli OP50的NGM培養(yǎng)基平板上，在20℃恒溫條件下培養(yǎng)。一般1 h內(nèi)產(chǎn)卵6個～8個，2 h后將成蟲挑走，將平板置于20℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h～50 h后便可得到同期化的秀麗隱桿線蟲，用于試驗。

1.3.3壽命統(tǒng)計

第一步制作試驗平皿，方法參照［13］，即選用9 cm的培養(yǎng)皿，按每培養(yǎng)皿15 mLNGM培養(yǎng)基制作平板，待瓊脂凝固后，將100 μLOP50菌液均勻涂布約平板2/3，放置于20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待平板形成菌膜。試驗開始前，待測試液均勻涂布于菌膜表面，試液添加量為200 μL。第二步培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，方法參照文獻［14］，具體操作步驟如下：同期化秀麗隱桿線蟲生長至L4期時，將秀麗隱桿線蟲挑至制作好的試驗平板中，對照試驗為只含OP50的NGM平板，每組線蟲數(shù)量均為10±1條，放置于20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第2天觀察線蟲是否死亡，并將存活的線蟲轉移至新平板（制作與初始平板方法相同），并準確記錄下當天線蟲死亡和丟失數(shù)目，直至線蟲全部死亡。確認線蟲死亡的標準是線蟲對外部刺激無應答或顯微鏡下觀察不咽食。所有受試線蟲從卵開始生長記為第0天，對照組和各個試驗組最后一條線蟲死亡時間即為該組線蟲的最長壽命。

a試驗：用酒精度14%、原花青素質量濃度分別為1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg/mL的藍莓果酒喂養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，對照組為只含OP50的NGM平板和14%乙醇水溶液，喂食量均為200 μL，統(tǒng)計秀麗隱桿線蟲壽命。

b試驗：用原花青素濃度3.00 mg/mL、酒精度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%的藍莓果酒喂養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，對照組為只含OP50的NGM平板和原花青素濃度3.00 mg/mL水溶液，喂食量均為200 μL，統(tǒng)計線蟲壽命。

1.3.4生殖能力

參照文獻［15］中的方法，依據(jù)試驗需要做相應改動。本試驗選用直徑為6 cm的培養(yǎng)皿進行試驗，試驗NGM平板制作參照1.3.3，NGM培養(yǎng)基添加量為5 mL，OP50菌液涂布量為30 mL，均勻涂布平板2/3，待測試液量為70μL，均勻涂布菌膜表面。當同期化秀麗隱桿線蟲生長至L4期時挑至制作好的試驗平板，每平板1條線蟲，后放置于（20±2）℃培養(yǎng)24 h，第2天轉至新平板（制作初始平板方法相同），并在顯微鏡下觀察前1天平板上的蟲卵數(shù)量，記錄數(shù)據(jù)。直至線蟲產(chǎn)卵完全結束。

a試驗與b試驗試驗組和對照組設計與1.3.3相同，喂食量為200 μL。

1.3.5運動能力

參照文獻［16］，并作相應改動，試驗平板制作方法同1.3.3。試驗時，將同期化后L4期線蟲挑至平板中，每板數(shù)量為（15±2）條，放置20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，第二天進行觀察。觀察方法如下：挑取狀態(tài)相當?shù)氖茉嚲€蟲至新的NGM平板（無OP50）后，讓線蟲自由運動2 min，然后記錄1 min內(nèi)線蟲頭部擺動的數(shù)目作為頭部擺動頻率指標，1次頭部擺動定義為線蟲頭部從一側擺向另一側后，再擺回來。記錄在20 s內(nèi)身體彎曲的數(shù)目作為身體彎曲頻率指標。1次彎曲定義為線蟲相對于身體長軸方向上1個波長的擺動。

a試驗與b試驗試驗組和對照組設計與1.3.3相同，喂食量為200 μL。

1.4統(tǒng)計學分析

平行試驗3組，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 19.0 （IBM）統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)都以平均值±標準差表示，組間比較采用VNOVA分析。

2　結果與分析

2.1不同成分藍莓果酒對秀麗隱桿線蟲的影響

喂食不同原花青素質量濃度的藍莓果酒的結果見表1。

表1　不同原花青素質量濃度的藍莓果酒秀麗隱桿線蟲的壽命Table 1　Lifespan of C.elegans in different PC concentrations' blueberry wine

從表1得知，原花青素0 mg/mL藍莓果酒組相對于OP50組秀麗隱桿線蟲的壽命較顯著下降。與OP50組相比，喂食不同質量濃度原花青素藍莓果酒的秀麗隱桿線蟲壽命均有所延長，其中1 mg/mL組秀麗隱桿線蟲平均壽命提高了0.8 d，2 mg/mL組提高了0.9 d，3、4、5 mg/mL組分別提高了1.97、2.2、3.1 d。

原花青素對秀麗隱桿線蟲壽命的影響見圖1。

圖1　不同原花青素質量濃度的藍莓果酒秀麗隱桿線蟲生存曲線Fig.1　Survival curves of C.elegans in different PC concentrations' blueberry wine

由圖1可看出秀麗隱桿線蟲的全程生存情況，OP50對照組生存曲線相對于0 mg/mL對照組右移明顯；與OP50組相比，喂食藍莓果酒的秀麗隱桿線蟲各個試驗組的生存曲線均有右移，且原花青素各質量濃度間間隔差異顯著，但低濃度（1、2 mg/mL）組與OP50對照組相比，偏移距離不顯著。以上結果說明藍莓果酒中原花青素在延緩秀麗隱桿線蟲衰老，延長秀麗隱桿線蟲壽命上有較明顯的效果。

喂食不同酒精度的藍莓果酒的結果見表2。

表2　不同酒精度的藍莓果酒秀麗隱桿線蟲壽命Table 2　Lifespan of C.elegans in different alcohol concentrations' blueberry wine

從表2得知，喂食原花青素質量濃度為3 mg/mL，不同酒精度的藍莓果酒，秀麗隱桿線蟲壽命均顯著低于0%組（P＜0.05），且隨著喂食酒精濃度的升高，試驗組的秀麗隱桿線蟲壽命變化不明顯，說明酒精對秀麗隱桿線蟲壽命的損傷能力有所降低。

酒精對秀麗隱桿線蟲壽命的影響見圖2。

結合表2和圖2綜合分析。表2可看出，0%對照組與OP50對照組秀麗隱桿線蟲在平均壽命上沒有明顯差異（P＞0.05），但從圖2可知，0%對照組秀麗隱桿線蟲在生長后期，其生存曲線處于OP50組生存曲線上方，說明單一原花青素喂養(yǎng)秀麗隱桿線蟲也能延長秀麗隱桿線蟲壽命。

原花青素對秀麗隱桿線蟲生殖能力的影響見圖3。

圖2　不同酒精度的藍莓果酒秀麗隱桿線蟲生存曲線Fig.2　Survival curves of C.elegans in different alcohol concentrations'blueberry win

圖3　不同原花青素濃度的藍莓果酒秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響Fig.3　Effect of brood size in different PC concentrations' blueberry wine on C.elegans

秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)反映其繁殖能力，研究這個指標能檢測出藥物對秀麗隱桿繁殖能力的保護作用。由圖3可知，與OP50組相比，單一酒精喂食的0 mg/mL（原花青素質量濃度）對照組產(chǎn)卵數(shù)極顯著減少（P＜0.001），在喂食含原花青素藍莓果酒后產(chǎn)卵數(shù)水平才慢慢恢復，至喂食原花青素質量濃度為2 mg/mL的藍莓果酒，該試驗組產(chǎn)卵數(shù)與OP50組近似（P＞0.05）。SPSS分析表明，喂食原花青素質量濃度為2、3、4 mg/mL的秀麗隱桿線蟲組間差異并不明顯（P＞0.05），當喂食原花青素增至5 mg/mL時，產(chǎn)卵數(shù)相對于OP50組有極顯著增加（P＜0.001）。

酒精對秀麗隱桿線蟲生殖能力的影響見圖4。

圖4　不同酒精度的藍莓果酒秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響Fig.4　Effect of brood size in different alcoholic concentrations' blueberry wine on C.elegans

由圖4可知，喂食原花青素濃度為3 mg/mL，不同酒精度藍莓果酒的產(chǎn)卵數(shù)變化情況，單一原花青素喂食秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)相對于OP50組有所下降，表明了不含酒精的藍莓果酒中仍有抑制秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵的物質存在，經(jīng)加入酒精后，藍莓果酒組間的產(chǎn)卵數(shù)也有較大的浮動，且無線性關系，其原因有待后續(xù)研究。

2.2不同成分藍莓果酒對秀麗隱桿線蟲運動能力的影響

原花青素對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率的影響見圖5。

圖5　不同原花青素質量濃度的藍莓果酒秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率的影響Fig.5　Effect of head thrashes in different PC concentrations' blueberry wine on C.elegans

原花青素對秀麗隱桿線蟲身體彎曲頻率的影響見圖6。

圖6　不同原花青素質量濃度的藍莓果酒秀麗隱桿線蟲的身體彎曲頻率的影響Fig.6　Effect of body bends in different PC concentrations' blueberry wine on C.elegans

運動指標常用來反映神經(jīng)系統(tǒng)基本功能的指標，觀測這個指標可以更直接的檢測出藥物對秀麗隱桿線蟲的抗氧化保護能力。綜合圖5和圖6可知，0 mg/mL組秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率和身體彎曲頻率均顯著低于OP50組（P＜0.05）。與0 mg/mL對照組相比，喂食不同原花青素質量濃度藍莓果酒的后，無論高質量濃度還是低質量濃度秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率和身體彎曲頻率均明顯上升（P＜0.05）。在原花青素濃度為1 mg/mL～4 mg/mL范圍內(nèi)，隨著原花青素濃度升高，秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率和身體彎曲頻率也隨著增大。但是，5 mg/mL組秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率顯著低于4 mg/mL組（P＜0.05），秀麗隱桿線蟲身體彎曲頻率也沒有明顯變化（P＞0.05）。上述結果說明，藍莓果酒中的原花青素對秀麗隱桿線蟲的運動行為有較好的促進作用；在一定質量濃度范圍內(nèi)，此促進作用與濃度呈現(xiàn)正相關。

酒精對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率的影響見圖7。

圖7　不同酒精度的藍莓果酒秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率的影響Fig.7　Effect of head thrashes in different alcohol concentrations' blueberry wine on C.elegans

酒精對秀麗隱桿線蟲身體彎曲頻率的影響見圖8。

圖8　不同酒精度的藍莓果酒秀麗隱桿線蟲的身體彎曲頻率的影響Fig.8　Effect of body bends in different alcohol concentrations' blueberry wine on C.elegans

綜合圖7和圖8可知，在原花青素質量濃度為3 mg/mL的條件下，不同酒精度藍莓果酒對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率和身體彎曲頻率的影響。與未加入酒精的藍莓果酒組（0%組）相比，加入酒精后的藍莓果酒組的秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)試驗頭部擺動頻率和身體彎曲頻率的影響呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，隨著酒精度的升高，頭部擺動頻率和身體彎曲頻率呈梯度顯著下降（P＜0.05）；其中20%組相比15%組，降幅較為顯著（P＜0.05）。在酒精度達到20%后，在觀察中發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲生長中爬行速度減緩。上述結果表明，藍莓果酒中的酒精會使秀麗隱桿線蟲的運動有所遲滯，可以推測酒精對秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)有一定的損傷作用，這種作用也與酒精濃度呈正相關。

3　結論

壽命的延長或許與生殖能力存在固有的逆向關系［17］，因此本研究測定線蟲產(chǎn)卵數(shù)，以了解藍莓果酒對秀麗線蟲在繁殖能力方面所形成的延壽作用。頭部擺動頻率和身體彎曲頻率是線蟲運動能力強弱的直觀表現(xiàn)，反映神經(jīng)系統(tǒng)基本功能的指標，也可以間接反映出線蟲壽命及生存狀態(tài)，因此選用其為觀察指標，觀察難度小、試驗周期短，試驗成本也比較低［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，在延緩線蟲壽命方面，藍莓果酒中的原花青素有著重要的作用，是生物活性成分之一；與之相反，藍莓果酒中的酒精成分會加速線蟲的死亡。本研究通過兩個單因素（原花青素、酒精）試驗，分別使用不同劑量的藍莓果酒干預秀麗線蟲的衰老。結果表明，在壽命方面，原花青素單因素試驗中，隨著濃度上升，線蟲的平均壽命均顯著延長，其作用有一定的濃度上限；酒精單因素試驗發(fā)現(xiàn)，在藍莓果酒延緩線蟲壽命的過程中，酒精產(chǎn)生了負作用。在生殖方面，藍莓果酒中的酒精成分對線蟲產(chǎn)卵能力有明顯的抑制作用，原花青素起到了克服酒精抑制作用，隨著原花青素濃度的提高，線蟲生殖能力逐漸恢復至正常水平，并且出現(xiàn)了產(chǎn)卵高峰期。在運動能力方面，中低酒精度的藍莓果酒喂養(yǎng)的線蟲。頭部擺動和身體彎曲有瞬時性增強的現(xiàn)象，但整時段次數(shù)明顯低于對照組；原花青素對線蟲的運動能力起到了較好的保護作用，但原花青素濃度為5 mg/mL的藍莓果酒，相比4 mg/mL組，保護能力下降，這可能是高濃度對線蟲產(chǎn)生了一定的毒性作用，線蟲可通過降低運動頻率來減少對有毒物質的吸收，從而保障自身的生存狀態(tài)。

按照本研究的結果可以推斷，原花青素是藍莓果酒中的延緩線蟲壽命活性成分之一，但并不是唯一的物質；藍莓果酒中的酒精反而會緩慢損傷線蟲的部分功能，使線蟲衰亡，從而縮短線蟲壽命。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.004

基金項目：2014年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201410537002）；2014年湖南省級大學生研究性學習和創(chuàng)新實驗計劃項目（SCX1407）

作者簡介：曾敏（1992—），男（漢），本科在讀，食品科學與工程專業(yè)，發(fā)酵方向。

*通信作者：王遠亮（1977—），男（漢），教授，碩士生導師，博士，主要從事微生物技術研究。

收稿日期：2015-04-29

The Effect of Blueberry Wine on Lifespan of C.elegans

ZENG Min，WEI Tao，LI Ke，WANG Chuan-hua，CHEN Chou-wei，WANG Yuan-liang*

（College of Food Science and Technology，，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Abstract：Explored the substance of blueberry wine on delaying lifespan of C.elegans.The lifespan assay was carried out on model organism C.elegans.Base on blueberry wine，compounded six feeding group（0，1，2，3，4，5 mg/mL）by add different quality of PC，and establish seven feeding group（0%，5%，10%，15%，20%，25%，30%）by add different volume alcohol.Tested the lifespan，reproductive capacity and movement capacity on C.elegans.Feeding the alcohol content of 14%，compared with control group，the lifespan of C.elegans prolonged with promotion of PC concentration of blueberry wine，lifespan of C.elegans longer after 3mg/mL（P＜0.05）；it had different degrees of enhancement effect to the reproductive ability and movement ability（P＜0.05），while the increasing trend in not obvious when PC≥5mg/mL.Shorten the lifespan of C.elegans，accelerate the C.elegans death after feeding the 3 mg/mL of PC，different alcohol content of blueberry wine，its effect was positively related with alcohol content.The reproductive ability and movement ability weakened when alcohol is the single factor test.PC of blueberry wine have the function of the delay lifespan of C.elegans，concentration in the 3 mg/mL to 5 mg/mL obviously；alcohol of blueberry wine increased accumulation will accelerate the death of C. elegans.

Key words：C.elegans；blueberry wine；proanthocyanidin；alcohol；aging隨著社會的快速發(fā)展，酒精飲料類產(chǎn)品也日益豐富，酒精是酒中不可或缺的組成成分。有研究發(fā)現(xiàn)，酒精對小鼠的精子數(shù)量和質量有比較明顯的毒性作用［1］。長期暴露于低濃度酒精中，對秀麗隱桿線蟲的生殖能力有一定的損傷［2］，藍莓為基質發(fā)酵制作的藍莓果酒作為酒精載體研究果酒對模式生物行為的綜合影響的報道并不多。