全吉淑，王玉嬌，尹基峰，高峰，尹學(xué)哲，*（.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉3300；.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉33000）

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草蓯蓉多糖對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用

全吉淑1，王玉嬌1，尹基峰2，高峰1，尹學(xué)哲2，*
（1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000）

摘要：研究草蓯蓉多糖（BRPS）對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）所致HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用。以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，采用四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞存活率；比色法檢測(cè)培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性以及細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）水平；蛋白印跡法測(cè)定細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38）活化水平。結(jié)果表明，BRPS在質(zhì)量濃度12.5 mg/L～50 mg/L范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響，對(duì)細(xì)胞安全。而H2O2誘導(dǎo)使HepG2細(xì)胞存活率和抗氧化能力下降，細(xì)胞內(nèi)ERK和JNK磷酸化水平升高。與H2O2模型組相比，BRPS預(yù)處理可提高細(xì)胞存活率；降低培養(yǎng)液中LDH、AST和ALT活性；降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量，升高細(xì)胞中SOD活性和GSH含量，降低細(xì)胞內(nèi)ERK和JNK磷酸化水平。提示，BRPS對(duì)H2O2所致HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激具有抑制作用，減輕其細(xì)胞損傷。

關(guān)鍵詞：草蓯蓉；多糖；H2O2；氧化應(yīng)激；HepG2

細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的提高能夠損傷細(xì)胞甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此，自由基與多種疾病的關(guān)系已越來(lái)越引起人們的重視［1-2］。草蓯蓉（BoschniakiarossicaFedtsch. et Flerov），俗稱不老草，為列當(dāng)科草蓯蓉屬多年生寄生性草本植物，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、滋補(bǔ)強(qiáng)身、潤(rùn)腸止血、延年益壽的功效；用于治療腎虛陽(yáng)痿、腰膝冷痛、膀胱炎、功能性子宮出血、腎炎以及腎臟和膀胱出血等疾?。?］。草蓯蓉作為傳統(tǒng)中藥，其保肝作用研究已有一定積累［3-5］，但將其有效成分作用于肝細(xì)胞的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。草蓯蓉多糖是其重要活性成分，它無(wú)毒，具有免疫增強(qiáng)和抗氧化等功能［5-6］。因此，本試驗(yàn)選人HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，利用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激，研究草蓯蓉多糖對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用，為闡明草蓯蓉多糖保肝機(jī)制提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

人HepG2細(xì)胞：南京凱基生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）：Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）：Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdelyde，MDA）試劑盒：南京建成科技有限公司；小鼠細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）多克隆抗體、兔c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）多克隆抗體、兔p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38）多克隆抗體、兔p-ERK多克隆抗體、兔p-JNK多克隆抗體、兔p-p38多克隆抗體：美國(guó)Abcam公司。

1.2儀器

D1320型超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；3-30K型離心機(jī)：Sigma公司；RT-2100型酶標(biāo)儀：深圳雷杜公司；DYY-12型電泳儀、DYCP-31D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳儀：北京六一儀器廠；Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽：美國(guó)Bio-Rad公司；UVP凝膠成像分析儀：美國(guó)UVP公司。

1.3方法

1.3.1草蓯蓉多糖（Boschniakia rossica polysaccharides，BRPS）的制備［5］

采用醇沉法提取BRPS，用Sevag法除蛋白質(zhì)，最終得率為4.4%，多糖含量為67.3%。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及傳代［7］

細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖活躍的細(xì)胞進(jìn)行傳代并分組。

1.3.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率［8］

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入BRPS溶液使其質(zhì)量終濃度分別為200、100、50、25、12.5 mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸凈培養(yǎng)液，加入5 g/L MTT溶液，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。以細(xì)胞存活率≥90%為標(biāo)準(zhǔn)確定BRPS對(duì)細(xì)胞的安全濃度［8］。

細(xì)胞存活率/%=實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組×100

另取一批細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組。對(duì)照組、H2O2組（模型組）及BRPS高、低劑量組（質(zhì)量濃度分別為50、25mg/L）。對(duì)照組換入正常培養(yǎng)液；H2O2組加入H2O2使其質(zhì)量濃度為300 μmol/L；BRPS干預(yù)組中加入BRPS使其質(zhì)量濃度達(dá)到相應(yīng)值，2 h后再加入300 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。損傷12 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.3.4細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、ALT、AST活性的檢測(cè)［9］

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按上述方法分組并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。收集培養(yǎng)液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH、ALT、AST活性。

1.3.5細(xì)胞MDA、GSH含量和SOD活性的測(cè)定

細(xì)胞在6孔板中進(jìn)行分組并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。用胰蛋白酶消化，收集和破碎細(xì)胞，離心取上清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH、SOD水平［9］。

1.3.6蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞ERK、JNK、p38活化水平［9］

收集、破碎細(xì)胞，并提取總蛋白。以20 μg為上樣量，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后，一抗孵育過(guò)夜，加相應(yīng)二抗再反應(yīng)1 h，加發(fā)光底物顯跡，采集圖像并進(jìn)行灰度分析。

1.3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS16.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用單因素方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1BRPS對(duì)HepG2細(xì)胞的安全濃度范圍

MTT分析法是檢測(cè)細(xì)胞活性的常用方法。如圖1所示。

圖1　BRPS對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.1　Effect of BRPS on cell viability of HepG2 cells

質(zhì)量濃度在12.5 mg/L～50 mg/L范圍時(shí)，BRPS不顯示細(xì)胞毒作用，細(xì)胞存活率≥90%。質(zhì)量濃度高于100 mg/L時(shí)，BRPS具有一定的細(xì)胞毒作用。因此，本研究選25 mg/L和50 mg/L為干預(yù)計(jì)量研究BRPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用。

2.2BRPS對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞存活率的影響

H2O2為一種活性氧，可引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，增高氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡［9］。如圖2所示。

圖2　BRPS對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞存活率的影響Fig.2　Effect of BRPS on cell viabilities of cells with oxidative stress

與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），經(jīng)BRPS干預(yù)后細(xì)胞存活率與H2O2組比較增高（P＜0.05）。表明，BRPS干預(yù)降低了H2O2所致的細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力。

2.3BRPS對(duì)培養(yǎng)液中ALT、AST、LDH釋放的影響

肝細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)胞內(nèi)酶如LDH、ALT、AST等釋放到細(xì)胞外，使培養(yǎng)液中胞內(nèi)酶活性增高，其活性可反映細(xì)胞損傷的程度［9］。如表1所示。

表1　BRPS對(duì)培養(yǎng)液中ALT、AST、LDH釋放的影響（x±s，n=6）Table 1　Effect of BRPS on releases of ALT，AST and LDH to culture fluid（x±s，n=6）

對(duì)照組培養(yǎng)液中LDH、ALT、AST活性較低；與對(duì)照組比較，H2O2組培養(yǎng)液LDH、AST、ALT活性顯著升高（P＜0.05）；與H2O2組比較，BRPS組培養(yǎng)液LDH、ALT、AST活性顯著降低（P＜0.05）。

2.4BRPS對(duì)細(xì)胞SOD、GSH、MDA水平的影響

細(xì)胞MDA可反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，而SOD和GSH是細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶和抗氧化劑［9］。如表2所示。

表2　BRPS對(duì)細(xì)胞MDA、SOD、GSH水平的影響（x±s，n=6）Table 2　Effect of BRPS on levels of MDA，SOD and GSH （x±s，n=6）

與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞MDA含量顯著升高（P＜0.05），SOD活性與GSH含量顯著降低（P＜0.05）；與H2O2組比較，BRPS組細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著降低（P＜0.05），50 mg/L BRPS組（高劑量組）細(xì)胞SOD活性與GSH含量顯著升高（P＜0.05）。25 mg/L BRPS組（低劑量組）SOD活性與GSH含量有增高趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.5BRPS對(duì)細(xì)胞MAPK蛋白激活的影響

MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要有ERK、JNK及p38 MAPK［9］。如圖3所示。

圖3　BRPS對(duì)細(xì)胞MAPK蛋白激活的影響Fig.3　Effect of BRPS on activation of MAPKs of cells

蛋白印跡結(jié)果顯示，H2O2雖不影響ERK和JNK總蛋白的表達(dá)，但誘導(dǎo)細(xì)胞p-ERK和p-JNK的表達(dá)（P＜0.05）。與H2O2組比較，50 mg/L BRPS組p-ERK 和p-JNK的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。H2O2損傷2 h時(shí)，H2O2組p38蛋白激活并不顯著（P＞0.05），50 mg/L BRPS對(duì)p38蛋白活化水平也無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

3　討論

氧化應(yīng)激損傷是機(jī)體遭受各種有害刺激時(shí)，氧化與抗氧化體系的平衡狀態(tài)被打破所導(dǎo)致的組織、器官等的損傷［10］。氧化應(yīng)激是各種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中共同的病理生理基礎(chǔ)，因此，抗氧化劑作為肝臟疾病的防治措施是可行的［11］。在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中，氧化應(yīng)激是重要環(huán)節(jié)和機(jī)制。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激時(shí)，胞內(nèi)生成大量氧自由基，引發(fā)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，引起一系列的自由基鏈反應(yīng)；并大量損耗內(nèi)源性抗氧化體系，造成GSH含量和SOD活性的降低［1-2，10-11］。此外，受到各種因素的損害時(shí)，細(xì)胞不能維持其結(jié)構(gòu)的完整性，膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ALT、AST、LDH等大量釋放到胞外［8，11］。因此，當(dāng)細(xì)胞受到H2O2損傷時(shí)，細(xì)胞存活率下降、轉(zhuǎn)氨酶外釋、MDA生成和細(xì)胞內(nèi)抗氧化活力下降等可綜合反映細(xì)胞損害的程度［10-11］。本結(jié)果表明，BRPS能降低H2O2所致細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率；降低培養(yǎng)液中LDH、ALT和AST活性；降低細(xì)胞MDA水平，升高細(xì)胞SOD活性和GSH含量；降低ERK和JNK蛋白的活化水平。表明，BRPS對(duì)H2O2所致HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激具有抑制作用，可減輕其細(xì)胞損傷。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.002

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81160539；81360651）

作者簡(jiǎn)介：全吉淑（1968—），女（朝鮮），教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物的活性研究。

*通信作者

收稿日期：2015-04-07

Inhibitory Effect of Polysaccharides from Boschniakia Rossica on Oxidative Stress in HepG2 Cells

QUAN Ji-shu1，WANG Yu-jiao1，YIN Ji-feng2，GAO Feng1，YIN Xue-zhe2，*

（1.Medical College of Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China；2.Affiliated Hospital of Yanbian University，Yanji 133000，Jilin，China）

Abstract：Inhibitory effect of polysaccharides from Boschniakia rossica（BRPS）on cellular oxidative stress induced by hydrogen peroxide（H2O2）in HepG2 cell line was investigated.The cellular oxidative stress model was established in HepG2 cells with H2O2，and then the cell viabilities were detected with MTT assay.Lactate dehydrogenase（LDH），alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），malondialdelyde （MDA），superoxide dismutase（SOD）and reduced glutathione（GSH）were measured by the spectrophotometric method.The activation of extracellular signal-regulated kinase（ERK），c-Jun N-terminal kinase （JNK），p38 mitogen-activated protein kinase（p38）were determined with the western blotting method.Results showed that BRPS had no toxic effect on cultured HepG2 cells at the concentrations of 12.5 mg/L-50 mg/L. However，H2O2decreased the cell viability and antioxidant activities，and increased activation of ERK and JNK.In HepG2 cells with H2O2-induced oxidative stress，the administration of BRPS increased the cell viability，reduced LDH，ALT and AST leakage，reduced the MDA formation，increased the SOD and GSH levels，and suppressed the activation of ERK and JNK.Taken together，BRPS had the inhibitory effect on oxidative stress induced by H2O2in HepG2 cells，and could relieve the oxidative damage of HepG2 cells.

Key words：Boschniakia rossica；polysaccharides；H2O2；oxidative stress；HepG2