王振江　楊濤蓮　王緒霖

(天津中醫(yī)藥大學(xué)2012級博士研究生，天津　300193)

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實 驗 研 究

調(diào)脂保肝湯對非酒精性脂肪肝模型大鼠肝功能、血脂及血糖代謝影響的實驗研究

王振江楊濤蓮1王緒霖2

(天津中醫(yī)藥大學(xué)2012級博士研究生，天津300193)

【摘要】目的觀察中藥調(diào)脂保肝湯對非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型大鼠肝功能、血脂及血糖代謝的影響，探討其治療NAFLD的作用機制。方法將44只Wistar大鼠隨機分為空白組12只和模型組32只，空白組予普通飼料喂養(yǎng)，模型組予高脂飼料喂養(yǎng)。以隨機選取2只大鼠達到預(yù)期NAFLD病理組織學(xué)時間為準(zhǔn)，造模8周。造模成功后，模型組大鼠再隨機分為高劑量組、低劑量組及對照組，每組10只。高劑量組予相當(dāng)于生藥0.15 g/mL的調(diào)脂保肝湯濃縮中藥液灌胃，低劑量組予相當(dāng)于生藥0.075 g/mL的調(diào)脂保肝湯濃縮中藥液灌胃，對照組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。8周后計算4組大鼠的肝指數(shù)，觀察4組大鼠肝功能指標(biāo)[谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)]、血脂指標(biāo)[甘油三酯(TG)及總膽固醇(TC)]及空腹血糖(FPG)水平。結(jié)果對照組大鼠肝指數(shù)明顯高于空白組(P<0.05)，高、低劑量組大鼠較對照組均可降低肝指數(shù)(P<0.05)，且高、低劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組大鼠ALT、AST及γ-GT水平均高于空白組(P<0.05)，高、低劑量組大鼠較對照組均可降低ALT及AST水平(P<0.05)，且高、低劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高劑量組大鼠較對照組可降低γ-GT水平(P<0.05)，而低劑量組γ-GT水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組大鼠TC、TG及FPG水平均高于空白組(P<0.05)，高、低劑量組較對照組均可降低TC、TG及FPG水平(P<0.05)，高劑量組較低劑量組降低效果更明顯(P<0.05)。結(jié)論調(diào)脂保肝湯對NAFLD療效確切，其作用機制可能與減少肝細(xì)胞脂肪沉積、改善肝功能及糾正血糖、血脂代謝紊亂有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】脂肪肝；中藥療法；調(diào)脂保肝湯；血清學(xué)；病理學(xué)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激性肝臟損傷綜合征，以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性與脂肪貯積為病理學(xué)特征，且無過量飲酒史(折合酒精量每周男性<140 g，女性<70 g)[1]。NAFLD發(fā)病機制尚不十分明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)缺乏對本病特異有效的治療藥物，但中藥具有多靶點、多層次、多途徑、整體性調(diào)節(jié)的特點，逐漸受到臨床的重視[2]。本實驗擬通過研究調(diào)脂保肝湯對NAFLD模型大鼠肝功能、血脂及血糖代謝的影響，探討其治療NAFLD的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠44只，雄性，體質(zhì)量(188±10) g，無特定病原體(SPF)級，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供(動物合格證號：0014091)，飼養(yǎng)于室溫18～24 ℃、明暗各12 h的清潔級動物實驗室。

1.2實驗藥物調(diào)脂保肝湯藥物組成：金錢草30 g，生牡蠣20 g，夏枯草15 g，虎杖15 g，海藻15 g，決明子20 g，何首烏20 g，丹參20 g。由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中藥藥劑科提供。中藥加水約為藥物質(zhì)量的8倍左右，在水中浸泡1 h，每次煎煮 30 min，煎煮3次，煎煮中用冷凝管收集蒸汽中揮發(fā)性的藥物成分，煎煮完畢后，將3次藥液混合，過濾去除藥渣，藥液濃縮(分別濃縮為相當(dāng)于生藥0.15、0.075 g/mL藥液)、滅菌，密封4 ℃冰箱保存，藥液有效期為1周，灌藥時間為8周，每周制取1次。

1.3主要試劑及儀器膽固醇，納瑞增(天津)生物科技有限公司；日立7600型全自動生化分析儀，日本日立公司；湘儀TDZ5-WS型低速離心機，湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；AL104UCT型電子分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司；超薄冰凍切片機，德國Leica公司； B60-32FB3-F01型顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.4實驗方法

1.4.1分組與造模大鼠適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng)7 d后，利用EXCEL軟件隨機數(shù)法將大鼠隨機分為空白組12只和模型組32只?？瞻捉M予自由飲水和進食普通飼料；模型組予自由飲水和進食高脂飼料(84%基礎(chǔ)飼料，4%蛋黃粉，10%豬油，2%膽固醇)，每周稱體質(zhì)量1次，以最后隨機選取2只大鼠達到預(yù)期NAFLD病理組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[3]時間為準(zhǔn)，預(yù)計造模8周。

1.4.2給藥造模8周后，在模型組籠中隨機選擇2只大鼠，肝組織做病理組織學(xué)觀察，達到中、重度NAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，造模成功。模型組利用EXCEL軟件隨機數(shù)法分為高劑量組10只，低劑量組10只，對照組10只。高劑量組予相當(dāng)于生藥0.15 g/mL的調(diào)脂保肝湯濃縮中藥液灌胃(劑量相當(dāng)于成人用量的20倍)，低劑量組予相當(dāng)于生藥0.075 g/mL的調(diào)脂保肝湯濃縮中藥液灌胃(劑量相當(dāng)于成人用量的10倍)，對照組予0.9%氯化鈉注射液灌胃，均按1 mL/100 g灌胃，每日早晨灌胃1次，持續(xù)8周。

1.4.3標(biāo)本采集灌胃8周后，隔夜禁食，先稱體質(zhì)量，以10%水合氯醛0.33 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，解剖大鼠，采用釆血真空管取腹主動脈血樣6～10 mL，于4 ℃下靜置2 h后，3 000 r/min離心15 min，分離血清，分別裝在標(biāo)記號碼的EP管。用無菌鑷子和剪刀將大鼠整個肝臟完整分離，電子天平稱取肝濕質(zhì)量，取新鮮肝臟最大葉小塊肝組織，立刻浸泡于10%中性甲醛固定液中固定，制作成石蠟切片，整個過程在冰盤上操作。

1.5指標(biāo)檢測觀察4組大鼠腹腔內(nèi)大體標(biāo)本情況，計算大鼠的肝指數(shù)[(肝濕質(zhì)量/大鼠質(zhì)量)×100%)]，采用全自動生化分析儀對4組大鼠血清進行肝功能指標(biāo)[谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)]、血脂指標(biāo)[甘油三酯(TG)及總膽固醇(TC)]及空腹血糖(FPG)水平檢測。固定好的肝組織交由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科進行肝臟組織病理學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1脫落情況灌胃第1周由于操作手法不熟練，高劑量組和低劑量組各有1只大鼠因藥液嗆肺死亡，其余順利完成實驗。

2.2大體標(biāo)本觀察剖開大鼠腹腔，肉眼可見，空白組大鼠腹腔脂肪組織少見，肝臟大小正常，呈暗紅色，肝臟包膜無緊張感，切面無油膩感；對照組大鼠腹腔肥大，脂肪組織豐富，肝臟體積明顯增大，色澤呈黃色或泛白色，肝臟包膜緊張，切面油膩，呈典型脂肪肝外觀；高劑量組及低劑量組較對照組腹腔脂肪組織有不同程度減少，肝臟體積減小，色澤呈暗紅色或偏黃色，一部分大鼠肝臟切面有油膩感，高劑量組肝臟外觀與空白組比較接近。

2.34組大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察空白組(見封3，圖1、2)：肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞及肝血竇沿中央靜脈呈放射狀整齊排列；肝細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞大小一致，核圓形，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)較稀疏，核膜清楚，偶見肝細(xì)胞增生；匯管區(qū)無擴大，未見纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤。對照組(見封3，圖3、4)：肝組織結(jié)構(gòu)不清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)尚存；肝細(xì)胞彌漫水樣變性，部分氣球樣變；肝實質(zhì)內(nèi)可見肝細(xì)胞多灶狀壞死，重度彌漫性脂肪變性(占肝細(xì)胞50%～75%)，并見肝細(xì)胞再生及增生；部分肝界板破壞，可見碎屑樣壞死；匯管區(qū)擴大，纖維組織增生，長入肝小葉內(nèi)，并見纖維間隔形成，伴中等慢性炎細(xì)胞浸潤。高劑量組(見封3，圖5、6)：肝組織結(jié)構(gòu)尚清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)存在；肝細(xì)胞輕、中度水樣變性；肝實質(zhì)內(nèi)偶見肝細(xì)胞點灶狀壞死，肝細(xì)胞散在輕、中度脂肪變性(占肝細(xì)胞5%～30%)，并見肝細(xì)胞再生；局灶性肝界板可見輕度碎屑樣壞死；部分匯管區(qū)輕度擴大，纖維組織輕度增生，偶見少量慢性炎細(xì)胞浸潤。低劑量組(見封3，圖7、8)：肝組織結(jié)構(gòu)欠清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)尚存；肝細(xì)胞中度水樣變性，小灶性氣球樣變性；肝實質(zhì)內(nèi)可見肝細(xì)胞點灶狀壞死，肝細(xì)胞中度脂肪變性(占肝細(xì)胞30%～50%)，并見肝細(xì)胞再生及增生；局灶性肝界板可見碎屑樣壞死；匯管區(qū)擴大，纖維組織增生，長入肝小葉內(nèi)，部分伴少量慢性炎細(xì)胞浸潤。

2.44組大鼠肝指數(shù)比較見表1。

表1　4組大鼠肝指數(shù)比較　±s

與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

由表1可見，對照組肝指數(shù)與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對照組高于空白組；高、低劑量組肝指數(shù)與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，均低于對照組，且高、低劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.54組大鼠ALT、AST及γ-GT水平比較見表2。

組 別nALTASTγ-GT高劑量組949.41±11.17△150.29±23.44△0.72±0.42△低劑量組960.41±10.89△170.39±28.02△0.90±0.47對照組1088.23±20.90*225.49±38.36*1.20±0.40*空白組1247.93±15.76149.08±31.140.75±0.45

與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

由表2可見，對照組ALT、AST及γ-GT水平與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對照組均高于空白組；高、低劑量組ALT及AST水平與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，均低于對照組，且高、低劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高劑量組γ-GT水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而低劑量組γ-GT水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.64組大鼠TC、TG及FPG水平比較見表3。

由表3可見，對照組TC、TG及FPG與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對照組高于空白組；高、低劑量組TC、TG及FPG與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，均低于對照組，且高、低劑量組組間比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組均低于低劑量組。

組 別nTCTGFPG高劑量組91.51±0.14△#0.40±0.13△#13.02±1.83△#低劑量組91.69±0.12△0.57±0.13△14.75±0.97△對照組101.87±0.22*0.74±0.17*16.80±1.86*空白組121.50±0.150.40±0.1712.20±2.07

與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05

3討論

近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，NAFLD發(fā)病率呈逐漸增加且有低齡化趨勢，我國上海、廣州等經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)發(fā)病率在15%左右，NAFLD已成為21世紀(jì)全球公共健康問題之一[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對本病具體機制尚不十分明確，基本都處于假說階段，1998年Day發(fā)表的“二次打擊”學(xué)說目前占主要地位[5]。NAFLD患者通常無明顯臨床癥狀，部分可有乏力、消化不良、肝區(qū)隱痛、肝脾大等非特異性癥狀及體征，實驗室檢測則可見肝功能異常、血脂及血糖水平升高等[6]。NAFLD的現(xiàn)代臨床上常應(yīng)用胰島素增敏劑、抗氧化劑、肝解毒劑、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保肝降酶等治療藥物[2]，但治療方法缺乏特異性，療效不盡令人滿意，不良反應(yīng)較多，停藥易復(fù)發(fā)。

根據(jù)NAFLD臨床表現(xiàn)，其應(yīng)歸屬于中醫(yī)學(xué)肝癖、脅痛、積聚等范疇，主要病因多為飲食不節(jié)、勞逸失度、情志失調(diào)、久病體虛、稟賦不足等[7]。調(diào)脂保肝湯是以國醫(yī)大師阮士怡教授臨證思想為指導(dǎo)的組方，阮教授經(jīng)過多年臨床實踐總結(jié)，認(rèn)為本病當(dāng)屬虛實夾雜之證，虛為脾虛、腎虛，實為痰、瘀互結(jié)，并提出滌痰散結(jié)、化瘀補腎的治療大法，臨床取得較好療效[8]。調(diào)脂保肝湯方中以金錢草、生牡蠣為君，利濕散瘀，軟堅散結(jié)；夏枯草、海藻、丹參為臣，助君藥加強活血化痰、軟堅散結(jié)功效，又能清瀉肝熱；決明子、虎杖、何首烏為佐使藥，既助祛濕化痰，又可利水通便，使?jié)嵝坝谐雎罚瑫r何首烏養(yǎng)陰血、補肝腎，使清利而不傷陰，活血而不耗血。諸藥配伍，共奏祛痰化瘀、清熱利濕、軟堅散結(jié)之功效。全方用藥痰瘀同治，使邪毒從二便而解，則氣機暢，痰濕化，瘀血祛，腑氣通，從而恢復(fù)臟腑的正常功能?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參能降低血清和肝組織中TC、TG、游離脂肪酸(FFA)及丙二醛(MDA)含量，降低血清ALT、AST活性，增加超氧化物歧化酶(SOD)活性，增加脂質(zhì)代謝，抗脂質(zhì)過氧化，抵抗肝細(xì)胞脂肪變性[9]；夏枯草對自由基有一定的清除能力，可以防止肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成量[10]；決明子能抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高血清以及肝臟組織內(nèi)SOD抗氧化活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護肝細(xì)胞[11]；虎杖可以改善胰島素抵抗(IR)，增加對胰島素敏感性，減少脂肪動員，減輕肝細(xì)胞氧超載，從而降低血脂，改善肝功能[12]；何首烏醇提取物可提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)/TC比值，明顯降低TC、TG及FFA、游離膽固醇及膽固醇酯的含量，有保護肝臟和抗肝臟纖維化的作用[13]。

本實驗研究結(jié)果顯示，調(diào)脂保肝湯可以有效減少NAFLD模型大鼠腹腔內(nèi)脂肪堆積，降低肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)，減少脂肪在肝臟的沉積，改善肝組織病理學(xué)改變，減輕肝細(xì)胞的脂肪性變。同時，調(diào)脂保肝湯可顯著改善肝功能，降低NAFLD大鼠血清ALT、AST及γ-GT水平，但療效沒有表現(xiàn)出明顯劑量相關(guān)性；糾正血脂、血糖代謝紊亂，降低血TC、TG及FPG水平，且具有一定劑量相關(guān)性趨勢，劑量越高效果越明顯。實驗結(jié)果表明，中藥調(diào)脂保肝湯對NAFLD具有療效確切，其作用機制可能與減少肝細(xì)胞脂肪沉積、改善肝功能及糾正血糖、血脂代謝紊亂有關(guān)。

參考文獻

[1]中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會.非酒精性脂肪性肝病的中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31(2):155-158.

[2]謝晶日，朱韋儒，朱巖.非酒精性脂肪肝的中醫(yī)治療進展[J].中醫(yī)藥信息，2011，28(5):110-111.

[3]中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中華肝臟病雜志，2003，11(2):71.

[4]中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組．中國非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)[J]．中國醫(yī)學(xué)前沿雜志：電子版，2012，4(7)：4-9．

[5]Day CP.Non-alcoholic fatty liver disease: a massive problem[J].Clin Med (Lond)，2011，11(2):176-178.

[6]黃彧，王峰，?？∑?43例脂肪肝臨床表現(xiàn)的診斷意

義[J].臨床肝膽病雜志，2004，20(2):114-115.

[7]中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會.非酒精性脂肪性肝病的中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31(2):155-158.

[8]王化良，李艷梅.阮士怡教授治療內(nèi)科病學(xué)術(shù)思想研究[J].天津中醫(yī)，2002，19(3):4-6.

[9]郭建利，張睦清，韓雪，等．丹參不同組分防治大鼠非酒精性脂肪肝模型作用機制的研究[J]．河北中醫(yī)藥學(xué)報，2012，27(1)：8-9．

[10]李良.夏枯草藥理作用研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51(4)：120-121.

[11]馬路，江夢溪，劉劍剛，等.決明子和山楂組分配伍對兔肝細(xì)胞膜高密度脂蛋白受體活性的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2009，15(1):24-28.

[12]張霖，陳育堯，孫學(xué)剛，等．虎杖苷對非酒精性脂肪肝大鼠保護作用及機制研究[J]．陜西中醫(yī)，2010，31(6)：756-758．

[13]蘇瑋，郭群.何首烏的現(xiàn)代藥理研究概況[J].中草藥，1997，28(2)：119-121.

(本文編輯：石康)

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.02.022

作者簡介：王振江(1986—)，男，醫(yī)師，博士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病防治研究。

【中圖分類號】R285.5；R289.61

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-2619(2016)02-0231-05

(收稿日期：2014-04-25)

Experimental study of Tiaozhi-baogan decoction on liver function and metabolism of glucose and lipid in rats with non-alcoholic fatty liver disease

WANGZhenjiang*,YANGTaolian,WANGXulin.

*2012-GradeDoctorCandidateofTianjinTraditionalChineseMedicineUniversity,Tianjin300193

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of Tiaozhi-baogan decoction on liver function and metabolism of glucose and lipid in rats with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its mechanism of action. Methods 44 Wistar rats were randomly divided into blank group (n=12) and model group (n=32). Rats in blank group were fed with general diet, and rats in model group were fed with high-fat diet for 8 weeks. After successful modeling, rats in model group were randomly divided into high dose , low dose and control group, 10 rats in each group. High dose group were received concentrate liquid of Chinese herbal medicine(crude drug 0.15 g/mL) by gavage, low dose group were received concentrate liquid of Chinese herbal medicine(crude drug 0.075 g/mL) by gavage and control group were received 0.9% sodium chloride injection by gavage. The liver index was calculated in four groups after 8 weeks. The liver functions including alanine transaminase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and gamma glutamyl transferase (γ-GT), the blood lipid parameters including triglyceride (TG) and total cholesterol (TC), and fasting blood-glucose (FPG) were observed in four groups. Results The liver index in control group was obviously higher than that in blank group (P<0.05). The liver indexes in high and low dose group were decreased as compared with those in control group (P<0.05), and there was no statistical difference between high and low dose group (P>0.05). The levels of ALT, AST and γ-GT in control group were higher than those in blank group (P<0.05), and those in high and low dose group was lower than those in control group (P<0.05), and there was no statistical difference between high and low dose group (P>0.05). The level of γ-GT in high dose group was lower than that in control group (P<0.05), and there was no statistical difference between low dose group and control group (P>0.05). The levels of TC, TG and FPG were higher than those in blank group (P<0.05), and those in high and low dose group were decreased as compared with those in control group (P<0.05), the decrease in high dose group was more obvious than that in low dose group (P<0.05). Conclusion Tiaozhi-baogan decoction has exact effect on NAFLD, its mechanism may be related with the decrease of fat deposition in liver cell, the improvement of liver function, and rectify the derangement in blood glucose and lipid.

【Key words】Fatty liver; Traditional Chinese medicine therapy; Tiaozhi-baogan decoction; Serology; Pathology

1天津中醫(yī)藥大學(xué)2013級博士研究生，天津300193

2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科，天津300052