陳能，姚楠，許學(xué)猛，李鋼，曾得明，陳國(guó)材

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參麥注射液關(guān)節(jié)腔注射對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響

陳能1，2，姚楠3，許學(xué)猛1，李鋼4，曾得明1，2，陳國(guó)材1，2

（1.廣東省第二中醫(yī)院 骨科，廣東 廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，廣東 廣州
510405；3.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州
510095；4.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院教務(wù)處，廣東廣州518172）

摘要：目的研究參麥注射液對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的干預(yù)作用，并探討其作用機(jī)理。方法行前交叉韌帶切除法（ACLT）復(fù)制兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，予膝關(guān)節(jié)腔注射參麥注射液、透明質(zhì)酸鈉4周后，取膝關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)軟骨組織，用ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，RT-qPCR檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)均明顯升高（P＜0.01），軟骨組織IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，參麥注射液組和透明質(zhì)酸鈉組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），軟骨組織IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA均顯著降低（P＜0.05）。參麥注射液組與透明質(zhì)酸鈉組各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論參麥注射液對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與下調(diào)關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α水平，降低軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：兔膝骨關(guān)節(jié)炎；參麥注射液；白介素-1β；白介素-6；腫瘤壞死因子-α

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種中老年人常見的慢性、進(jìn)展性的關(guān)節(jié)退行性疾病，以滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕±砀淖?。盡管目前對(duì)該病開展了多方面的研究，但其發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚。關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉是該病常用的治療手段，臨床與實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了其良好療效。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷能保護(hù)軟骨細(xì)胞，有效抑制軟骨退變［1-2］。參麥注射液由紅參、麥冬提取加工制成，含有多種人參皂苷［3］。研究表明［4］，人參皂苷能有效降低炎性細(xì)胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶水平，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，延緩KOA的惡化。本研究通過(guò)建立兔KOA模型，并用參麥注射、透明質(zhì)酸鈉干預(yù)，觀察相關(guān)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，探討藥物的作用機(jī)理。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性新西蘭兔32只，體質(zhì)量2～2.5 kg，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2011-0015。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與對(duì)照品

參麥注射液（規(guī)格：50 mL，雅安三九藥業(yè)有限公司）；透明質(zhì)酸鈉注射液（規(guī)格：2.5 mL：25 mg，山東正大福瑞達(dá)制藥有限公司）。

1.3 主要試劑

兔白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；TRIzol（美國(guó) Invitrogen公司）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國(guó)Fermentas公司）；MaximaTMSYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2X）（美國(guó)Fermentas公司）；特異性引物（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）。

1.4 主要儀器及設(shè)備

IQTM5型熒光定量 PCR儀（美國(guó) Bio-Rad公司）；Bio-RAD 680酶標(biāo)儀（美國(guó) Bio-Rad公司）；5424型小型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；-80 ℃ 超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）；SmartSpec plus核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Milli Q Plus超級(jí)純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模

取SPF級(jí)雌性新西蘭兔32只，按體質(zhì)量大小隨機(jī)分成4組，取8只為正常對(duì)照組行假手術(shù)處理，其余均行前交叉韌帶切除法（ACLT）復(fù)制兔KOA模型［5］。造模手術(shù)后連續(xù)3 d按20萬(wàn)U Bid青霉素肌注以預(yù)防感染。造模術(shù)后7 d，在明確無(wú)發(fā)生感染情況下，驅(qū)使動(dòng)物每天進(jìn)行30 min奔跑活動(dòng)。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

成功復(fù)制KOA動(dòng)物模型24只，模型動(dòng)物按配伍組設(shè)計(jì)隨機(jī)分組方法分為：模型組8只，參麥注射液組8只，透明質(zhì)酸鈉組8只，以上各組動(dòng)物分別關(guān)節(jié)腔注射無(wú)菌生理鹽水、參麥注射液、透明質(zhì)酸鈉，每周1次，每次0.3 mL，連續(xù)注射4周。

2.3 動(dòng)物取材

末次給藥1周后，戊巴比妥鈉注射處死動(dòng)物后，首先向膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.5 mL無(wú)菌生理鹽水，反復(fù)抽吸3次，然后抽取關(guān)節(jié)腔沖洗液0.5 mL，置于-20℃下冷凍保存。然后無(wú)菌操作下沿造模手術(shù)切口暴露膝關(guān)節(jié)腔，用手術(shù)刀取下股骨遠(yuǎn)端與脛骨近端軟骨。

2.4 實(shí)驗(yàn)觀察

2.4.1 膝關(guān)節(jié)形態(tài)觀察 處死動(dòng)物后暴露膝關(guān)節(jié)腔，肉眼觀察滑膜及軟骨形態(tài)。

2.4.2 膝關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），按說(shuō)明書操作步驟處理各組膝關(guān)節(jié)液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2.4.2 膝關(guān)節(jié)軟骨IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達(dá)檢測(cè) 采用TRIzol、氯仿和異丙醇等試劑提取每個(gè)膝關(guān)節(jié)軟骨的總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定A260/ A280比值，算出RNA的濃度和純度。按照Fermentas公司RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，加入上述提取的總RNA，合成第一鏈cDNA。

根據(jù)GenBank提供的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)利用Beacon Designer 7.91生物軟件，用于擴(kuò)增新西蘭兔內(nèi)參18S（GenBank accession no. NR_033238）以及 IL-1β（GenBank accession no. M26295）、IL-6（GenBank accession no.DQ680161）、TNF-α（GenBank accession no.NM_001082263）基因的引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。設(shè)計(jì)的引物序列如表1所示。

表1 擴(kuò)增基因的引物信息Table 1 Information of PCR primers

將cDNA 1 μL、dd H2O 9.5 μL、特異性引物F和R各1 μL、MaximaTMSYBR Green/Fluorescein 12.5 μL混合后共25 μL放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。步驟1：94℃×5 min；步驟2：94℃×30 s→55℃×30 s→72℃×50 s（45個(gè)循環(huán)）；步驟3：72℃×7 min。運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 膝關(guān)節(jié)形態(tài)觀察

見圖1。正常對(duì)照組關(guān)節(jié)滑液透明質(zhì)稍黏稠，軟骨表面光滑，色淡紅，關(guān)節(jié)囊無(wú)粘連。模型組關(guān)節(jié)滑液明顯增多，色淡黃，關(guān)節(jié)表面欠光滑，軟骨邊緣骨贅形成，滑膜明顯增生，關(guān)節(jié)囊粘連。參麥注射液組關(guān)節(jié)滑液稍增多，質(zhì)稀，軟骨完整，色白，滑膜無(wú)明顯增生，關(guān)節(jié)囊無(wú)粘連。透明質(zhì)酸組關(guān)節(jié)滑液稍增多，質(zhì)稀，軟骨完整，色白，滑膜稍增生，關(guān)節(jié)囊部分粘連。

A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.參麥注射液組；D.透明質(zhì)酸鈉組。圖1 膝關(guān)節(jié)形態(tài)觀察Figure 1 Morphology of knee joint

3.2 ELISA法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α水平

結(jié)果見表2。與正常對(duì)照組比較，新西蘭兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，參麥注射液組和透明質(zhì)酸鈉組新西蘭兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）。

表2 各組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α水平Table 2 Levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in synovial fluid in different groups（±s，n=8）　　ρ/（pg·mL-1）

表2 各組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α水平Table 2 Levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in synovial fluid in different groups（±s，n=8）　　ρ/（pg·mL-1）

與正常對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01。

組別　IL-1β　IL-6　TNF-α正常對(duì)照組　16.42±0.73　17.24±0.73　18.83±0.90模型組　23.48±1.47##　24.08±1.26##　25.73±0.79##參麥注射液組　19.03±0.72**19.13±0.95**20.77±0.90**透明質(zhì)酸鈉組　18.52±1.03**19.51±1.45**20.88±1.44**

3.3 膝關(guān)節(jié)軟骨組織相關(guān)基因的表達(dá)

結(jié)果見表3。與正常對(duì)照組比較，新西蘭兔軟骨組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，參麥注射液組和透明質(zhì)酸鈉組新西蘭兔軟骨組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA均顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達(dá)Table 3 Expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in cartilage in different groups（±s，n=8）

表3 各組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達(dá)Table 3 Expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in cartilage in different groups（±s，n=8）

與正常對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05。

組別　IL-1β　IL-6　TNF-α正常對(duì)照組　1.00±0.46　1.00±0.51　1.00±0.54模型組　6.00±2.61##　1.96±1.03##　2.40±1.65##參麥注射液組　3.83±1.20*　1.17±0.34*　1.39±0.62*透明質(zhì)酸鈉組　4.13±1.55*　1.30±0.47*　1.16±0.55*

4 討論

KOA是一種以膝關(guān)節(jié)滑膜增生、軟骨退行性變、繼發(fā)性骨質(zhì)增生、骨贅形成為主要病理特征的關(guān)節(jié)疾病。目前圍繞KOA已展開了許多研究，細(xì)胞因子失衡、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）降解、生物力學(xué)改變等是常見的學(xué)說(shuō)。研究表明［6］，炎性細(xì)胞因子升高是KOA的始發(fā)因素，并貫穿于疾病的整個(gè)過(guò)程。

IL-1β、IL-6、TNF-α是關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程中促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要炎性細(xì)胞因子［7］。傅欣等［8］研究發(fā)現(xiàn)在兔骨性關(guān)節(jié)炎模型中，隨著時(shí)間延長(zhǎng)關(guān)節(jié)軟骨損傷進(jìn)行性加重，關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α水平呈高表達(dá)。黃金剛等［9］研究表明IL-1β能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞在短期內(nèi)高表達(dá)MMP-13、Adamts-4和Adamts-5而直接降解細(xì)胞外基質(zhì)。王玉彬等［10］研究表明在OA患者關(guān)節(jié)軟骨中，TNF-α不僅在表層，甚至在中、深層軟骨細(xì)胞中均呈高表達(dá)；在中、后期的病變軟骨中，IL-6在全層均有高表達(dá)，IL-6表達(dá)增多還將刺激MMP表達(dá)，導(dǎo)致大量軟骨基質(zhì)降解，成纖維細(xì)胞膠原合成亦受阻，進(jìn)一步加重軟骨損傷。

關(guān)節(jié)液由關(guān)節(jié)囊內(nèi)層滑膜分泌，正常情況下起到營(yíng)養(yǎng)、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)的作用。當(dāng)發(fā)生關(guān)節(jié)炎時(shí)，關(guān)節(jié)液中炎性細(xì)胞因子水平升高，刺激MMP合成與分泌，介導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解，當(dāng)破壞達(dá)到軟骨細(xì)胞層，關(guān)節(jié)液中的炎性細(xì)胞因子又誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分泌多種物質(zhì)加速軟骨基質(zhì)降解，并且激活軟骨細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致KOA的進(jìn)一步發(fā)展。因此下調(diào)炎性細(xì)胞因子水平，將可能有效抑制KOA發(fā)生和發(fā)展。

郭偉文等［11］通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明參麥注射液關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔注射可通過(guò)降低關(guān)節(jié)液中的 TNF-α、IL-1β、MMP-3水平。郭玉海等［12］通過(guò)臨床試驗(yàn)表明參麥注射液與透明質(zhì)酸鈉均可有效降低關(guān)節(jié)液中NO水平，改善患膝關(guān)節(jié)功能，兩者療效無(wú)明顯差異。溫振杰等［13］通過(guò)臨床試驗(yàn)證實(shí)參麥注射液與透明質(zhì)酸鈉關(guān)節(jié)腔注射，均能明顯改善退行性關(guān)節(jié)炎癥狀和體征，且療效無(wú)明顯差別。然而，目前尚未有關(guān)于參麥注射液與透明質(zhì)酸鈉治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)表明透明質(zhì)酸鈉和參麥注射液均能顯著下調(diào)兔KOA關(guān)節(jié)液中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，降低關(guān)節(jié)軟骨IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達(dá)，并且這兩種藥物的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。透明質(zhì)酸鈉是治療KOA的常用藥物，通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射補(bǔ)充外源性透明質(zhì)酸鈉能起到潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、抗炎、修復(fù)軟骨創(chuàng)傷等多種作用。參麥注射液由紅參和麥冬提取而成，人參中含有多種人參皂苷，其中人參皂苷Rg1、Rb1、Rg3已證實(shí)具有抑制軟骨細(xì)胞凋亡、保護(hù)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)、延緩 KOA疾病進(jìn)程的作用［1-2，14-16］。而麥冬皂苷類成分、高異黃酮衍生物也證實(shí)了具有抗炎活性［17］，但對(duì)于KOA作用的研究尚未有相關(guān)報(bào)道。因此，參麥注射液干預(yù)兔KOA模型可能是通過(guò)藥物中的人參皂苷類成分發(fā)揮主要作用，其通路機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，參麥注射液可調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)液及軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨、延緩KOA的作用，其療效與透明質(zhì)酸鈉相當(dāng)。

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（責(zé)任編輯：幸建華）

中圖分類號(hào)：R285.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-8783（2016）03-0339-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016032203

收稿日期：2016-03-22

基金項(xiàng)目：廣東省科技廳社會(huì)發(fā)展領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B021800214）；廣東省中醫(yī)優(yōu)勢(shì)病種突破項(xiàng)目（粵中醫(yī)函［2015］19號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：陳能（1987—），男，博士研究生，主要從事中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)病研究；通信作者：許學(xué)猛（1964—），男，主任醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)病研究，Email：xuxuemeng@163.com。

Effect of shenmai injection on the expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in rabbits with knee osteoarthritis

CHEN Neng1，2，YAO Nan3，XU Xuemeng1，LI Gang4，ZENG Deming1，2，CHEN Guocai1，2

（1.Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangzhou 510095，China；2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development in Traditional Chinese Medicine，Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of TCM，Guangzhou 510095，China；4.Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 518172，China）

AbstractObjective To study the therapeutic effect of shenmai injection in rabbits with knee osteoarthritis KOA and its potential mechanism.Methods KOA was induced in rabbits by anterior cruciate ligament transection ACLT .Then shenmai and hyaluronic acid were administrated by intra-articula injection.After four weeks the rabbits were killed and synovial fluid and cartilage were collected.The levels of IL-1β IL-6 and TNF-α in synovial fluid were detected by ELISA.The expression of IL-1β IL-6 and TNF-α mRNA in cartilage was detected by real-time quantitative PCR.Results Compared with the normal control group the expressions of IL-1β IL-6 and TNF-α in synovial fluid and cartilage were significantly increased in the model group P＜0.01 .However the expressions of these cytokines in synovial fluid and cartilage were

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obviously decreased in model mice when treated with shenmai and hyaluronic acid P＜0.05 .There was no statistical difference between shenmai group and hyaluronic acid group P＞0.05 .Conclusion Shenmai injection has a protective effect on rabbit knee articular cartilage which may be related to down-regulation of the expression of IL-1β IL-6 and TNF-α in synovial fluid and cartilage.

Key wordsrabbits with knee osteoarthritis shenmai injection interleukin-1β interleukin-6 tumor necrosis factor-α