蔡嘉華，尹嵩杰，陳超，王淑美，梁生旺

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FTIR-ATR結合膜富集技術測定中藥材地龍中微量銅的含量

蔡嘉華1，2，3，尹嵩杰1，2，3，陳超1，2，3，王淑美1，2，3，梁生旺1，2，3

（1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質量評價技術重點研究室，廣東 廣州 510006；3.廣東高校中藥質量工程技術研究中心，廣東 廣州510006）

摘要：目的利用傅里葉變換-衰減全反射紅外光譜（FTIR-ATR）結合膜富集技術，建立中藥材地龍中微量銅質量分數(shù)的快速、經(jīng)濟的測定方法。方法首先，對30批校正集樣品進行濕法消解，利用銅與金屬絡合劑1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚（PAN）發(fā)生絡合反應，優(yōu)化各種反應條件，包括pH、PAN用量、反應時間。再將絡合物抽濾富集在微孔濾膜上，采集其FTIR-ATR光譜，經(jīng)9點平滑、一階導數(shù)9點平滑等預處理后，利用隨機森林回歸算法建立其銅質量分數(shù)的定量校正模型。校正集按3∶1隨機分配為訓練集和測試集，對模型進行參數(shù)優(yōu)化和評價。利用優(yōu)化后模型預測廣東、廣西和福建3個產(chǎn)地地龍樣品中銅的質量分數(shù)，并與ICP-MS測定結果進行比較。結果 最優(yōu)模型預測3個產(chǎn)地地龍樣品的質量分數(shù)在5.85～6.98 mg/kg之間，與ICP-MS分析結果相比，相對誤差均小于20%。結論本方法利用膜富集技術提高了FTIR-ATR的檢測靈敏度，為中藥材重金屬元素的定量分析提供了一種新方法。

關鍵詞：膜富集；FTIR-ATR；隨機森林；地龍；重金屬

現(xiàn)今工業(yè)發(fā)展、環(huán)境污染等問題導致了中藥材重金屬污染問題日益嚴重，故中藥材的安全性問題益發(fā)受到中藥質量控制研究工作的重視［1-2］。在2015年版《中國藥典》編制大綱中對提高中藥安全性控制水平特別提出了一條：“要大幅增加和完善安全性檢查項目，制定內源性有毒成分和外源性重金屬及有害殘留物的控制方法和限度”［3］。

地龍有清熱定驚、通絡、平喘、利尿的功效，是用于治療高熱神昏、驚癇抽搐、關節(jié)痹痛、高血壓等的一味常用嶺南道地藥材。地龍本身對泥土中的重金屬元素具有富集的特性［4-5］，或是因在加工炮制、儲存運輸?shù)冗^程受到了重金屬的污染等，頻繁被查出重金屬含量超標［1-2］?！吨袊幍洹分杏涊d地龍中重金屬的檢測方法為“通則0821第二法”［3］，即利用重金屬離子與硫代乙酰胺的顯色反應原理進行比色結果所得，標準為重金屬的總質量分數(shù)不得超過30 mg/kg。本方法雖然快速簡單，但是檢測準確度受主觀因素影響太大，且標準只限定了重金屬的總質量分數(shù)，并沒有具體到每一種元素；而每種重金屬元素對人體產(chǎn)生危害的限量都是不一樣的，即使總質量分數(shù)達到標準，個別也可能超出安全限量范圍。傳統(tǒng)的金屬離子檢測方法原子吸收光譜法（AAS）、原子發(fā)射光譜法（AES）、電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）等，雖均有較高的靈敏度和準確度，但是其分析成本高、儀器昂貴，一般條件的實驗室難以承擔。

本文以傅里葉變換-衰減全反射紅外光譜（FTIR-ATR）結合膜富集技術［6-8］，對中藥地龍中銅元素質量分數(shù)進行測定，即通過濕法硝解將所含的銅元素全部轉為游離態(tài)，然后與絡合劑在一定條件下進行絡合反應，最后將絡合物富集于微孔濾膜之上，并采集光譜，應用隨機森林算法建立Cu質量分數(shù)的定量校正模型。本法大大提高了紅外光譜的分析靈敏度［9-11］，使紅外光譜對重金屬元素的微量分析成為可能，并具有快速、經(jīng)濟的特點，為中藥材重金屬定量分析提供了一種新方法。

1 儀器與試藥

Tensor 37型傅里葉變換紅外光譜儀（德國BRUKER公司，安裝有OPUS7.2紅外光譜軟件），DLATGS檢測器，水平3次全反射ATR附件，光譜范圍400～4 000 cm-1，掃描間隔為2 cm-1，掃描次數(shù)為16次；PHS-3C數(shù)顯酸度計（上海雷磁儀器廠）；JJ-1A電動攪拌器（江蘇精密公司，100 W，0～3 000 r/min）；水系WX型微孔濾膜（上海新亞凈化器件廠，0.22 μm）。

200 mg/L銅離子標準液、1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚（PAN）、1 mol/L HCl、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，按文獻［12］方法配制；實驗用水全部為超純水，所用試劑均為分析純。

地龍藥材飲片采購自廣州清平藥材市場，經(jīng)廣東藥科大學李書淵教授鑒定為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）去除內臟的干燥全體，產(chǎn)地分別為廣東、廣西和福建。

2 方法與結果

2.1 校正集樣品的前處理和光譜采集

為提高定量模型的適用范圍，本文采用合成樣品，擴大校正集樣本的濃度范圍。取產(chǎn)地為廣東的地龍藥材1 g（所含Cu元素質量分數(shù)經(jīng)中國廣州分析測試中心應用ICP-MS準確測定），精密稱定，粉碎后置于150 mL錐形瓶中，加HNO3和HClO4的混合酸（體積比4∶1）20 mL，進行濕法硝解。待硝解液冷卻，過濾除去泥沙，用超純水多次洗滌濾渣，將濾液合并后加入一定體積的銅離子標準液，即得合成樣品溶液。重復上述操作，配制合成樣品的質量濃度范圍為5～500 mg/L，共30份。將樣品溶液以NaOH中和至中性，然后以緩沖液調pH至9.5，置于電動攪拌器下，以800 r/min的速度一邊攪拌一邊緩慢加入PAN絡合劑11 mL，攪拌反應7 min后，抽濾，將絡合物富集于0.22 μm的微孔濾膜上，晾干，標記，采其光譜數(shù)據(jù)。同時做試劑空白。

2.2 絡合反應條件的優(yōu)化

本試驗中絡合反應的條件，包括pH值、絡合劑用量、反應時間等，都對絡合物的生成產(chǎn)生影響，因此必須進行優(yōu)化。

如圖1所示，Ⅰ為空白濾膜的紅外吸收光譜，Ⅱ為試劑空白的紅外吸收光譜，Ⅲ為Cu-PAN絡合物的紅外吸收光譜。通過對比3個光譜，發(fā)現(xiàn)在1 174、1 010、907、787 cm-14處波長點只有絡合物有紅外吸收而空白濾膜和試劑沒有，因此可以認為是絡合物的特征吸收。選定其中1個吸收較明顯的波長點1 174 cm-1作為參考指標，通過單因素分析，分別考察了絡合反應不同的pH、PAN用量和反應時間生成Cu-PAN的FTIR-ATR光譜圖。

圖1　空白濾膜（Ⅰ）、試劑空白（Ⅱ）和Cu-PAN絡合物（Ⅲ）的紅外吸收光譜圖Figure 1 　IR absorption spectra of microporous filter membranes（Ⅰ），reagent blank（Ⅱ）and Cu-PAN complex compound（Ⅲ）

2.2.1 pH值的選擇 金屬絡合劑與金屬離子發(fā)生絡合反應都有其相應的pH范圍，根據(jù)文獻［6-7］將考察的范圍設置為7.5～10，結果如圖2所示。從圖2中可以看出，在所選取的Cu-PAN絡合物特征吸收1 174 cm-1的波長點上，同一質量濃度的銅離子溶液在不同pH下反應絡合反應所產(chǎn)生的絡合物光譜吸光度大小具有明顯的差異。從pH 7.5到9.5，反應所產(chǎn)生絡合物濃度不斷增大并在pH值為9.5時達到最大，在pH為10時絡合物減少，說明銅離子和PAN的絡合反應最適酸堿度在pH為9.5附近的弱堿環(huán)境，當堿性繼續(xù)增強反而不利于絡合物的形成，原因可能是銅離子的水解影響了絡合物的生成。故選定9.5為銅離子與PAN絡合反應的pH值。

2.2.2 PAN用量的選擇 從試劑空白實驗所采得光譜可以看出，試劑會產(chǎn)生明顯的試劑峰，如果絡合劑PAN用量過大，很可能會掩蓋絡合物在某些波段的吸收，在利用全譜建模時，就會影響模型的預測準確性；

圖2　pH7.5～10環(huán)境下所生成Cu-PAN的FTIR-ATR光譜圖（從上往下依次為pH 9.5、9.0、8.0、8.5、7.5、10）Figure 2 　FTIR-ATR spectra of Cu-PAN in pH7.5-10（pH 9.5，9.0，8.0，8.5，7.5，10 from the top to down）

因此，必須在保證PAN的用量能把銅離子完全絡合的情況下，不因其過量而產(chǎn)生干擾。本文根據(jù)實驗銅離子標準液和藥材地龍中含銅元素的量，確定對PAN用量的考察范圍為10～12.5 mL，結果如圖3所示。從圖3可看出，同一質量濃度的銅離子標準液和不同用量的絡合劑反應所產(chǎn)生絡合物的光譜吸收強弱是有差異的。加入絡合劑用量為10到11 mL時，生成絡合物的量緩慢增加，從11 mL開始，所產(chǎn)生絡合物的量隨著PAN用量增加而下降，因此選擇最適PAN用量為11 mL。

圖3　PAN用量為10～12.5 mL時所生成Cu-PAN的FTIRATR光譜圖（從上往下依次為11、11.5、10.5、10、12、12.5 mL）Figure 3 　FTIR-ATR spectra of Cu-PAN with PAN of 10-12.5mL（11，11.5，10.5，10，12，12.5 mL from the top to down）

2.2.3 反應時間的確定 根據(jù)文獻［12］所記載的方法，考察了反應時間為2～25 min的絡合物生成效果，結果如圖4所示。從絡合物的FTIR-ATR光譜可以看出，隨著同一質量濃度的銅離子標準液和PAN進行絡合反應時間的不同，反應所產(chǎn)生絡合物的光譜吸收強弱具有差異。從2 min到7 min的反應時間內，絡合物不斷地生成，并在7 min達到最多，從7 min開始緩緩下降，趨于平緩。由此可知在2 min時絡合反應并沒有進行完全，在7 min左右基本達到最大絡合程度，之后可能隨著劇烈的攪拌，少部分已經(jīng)生成的絡合物再次分解，因此絡合物的量緩緩下降，最后趨于平緩，基本達到動態(tài)平衡。因此，選取銅離子和PAN絡合反應的時間為7 min。

圖4　反應時間為2～25 min時所生成Cu-PAN的FTIR-ATR光譜圖（從上往下依次為7、12、15、20、25、2 min）Figure 4 FTIR-ATR spectra of Cu-PAN in reaction time of 2-25 min（7，12，15，20，25，2 min from the top to down）

2.3 隨機森林校正模型

紅外光譜源于多種化學基團的倍頻和合頻吸收，不容易用某一特征峰進行紅外光譜定量分析，基團含量信息與其待測組分含量和性質指標之間也不能用簡單的數(shù)學關系式來定量，因此化學計量學方法常被用于解決紅外光譜定量分析中的多元校正難題［13］。本文以隨機森林算法建立FTIR-ATR光譜的多元校正模型。

隨機森林（random forest，RF）是由一系列決策樹分類器h（x，θk），k=1，...，n組成的分類器集合，由Leo Breiman和Adele Cutler共同提出［14］。RF算法首先對樣本的訓練集進行有放回抽取k個相互獨立的自助樣本集，即bootsrap過程，而未被抽到的樣本組成了k個用來預測分類結果正確率的袋外數(shù)據(jù)，然后對每個bootsrap樣本構建ntree個決策模型構成RF，用RF對未知樣本進行判別分類，最終結果按照分類器投票結果所得，回歸的情況下，為決策樹輸出值的平均值［15］。

影響RF定量模型預測精度的主要有2個參數(shù)，分別是特征變量數(shù)（mtry）和決策樹個數(shù)（ntree）［16-17］，本文采用網(wǎng)格搜索方法，對 mtry和ntree 2個參數(shù)分別在10～1 000和10～3 000范圍內進行優(yōu)化。本文以校正集的原始光譜（OS）、9點平滑光譜（9S）和一階導數(shù)9點平滑光譜（1D9S）及其對應的濃度數(shù)據(jù)，分別歸一化后，按3∶1隨機分配成訓練集和測試集，運行1 000次，以結果均值評價模型性能。

本文采用Abhishek Jaiantilal編寫的 RF Mex/ Standalone工具包，在 MATLAB2010b軟件中完成RF建模。

2.4 模型優(yōu)化與評價

模型評價指標包括相關系數(shù)（R）、均方根誤差（RMSE）和平均相對誤差（MRE）。R越趨近于1，RMSE和MRE越趨近于0，模型的精度越高。其計算方法見本課題組已發(fā)表的論文［18-19］。

本文采用網(wǎng)格搜索方法對mtry和ntree 2個參數(shù)分別在10～1 000和10～3 000范圍內進行優(yōu)化，運行1 000次，以訓練集和測試集的R、RMSE和MRE作為模型評價指標，結果如表1所示。篩選出OS光譜的最優(yōu)模型的R、RMSEC和MRE分別為0.988 5、0.362 4和0.232 1，模型參數(shù)mtry為40，ntree為500，對測試集的預測結果 R、RMSEP和MRE分別為0.966 5、0.024 8和0.258 6；9S光譜的最優(yōu)模型的R、RMSEC和MRE分別為0.986 7、0.332 2和0.135 2，模型參數(shù)mtry為840，ntree為500，測試集的R、RMSEP和MRE分別為0.945 1、0.033 8和 0.306 2；1D9S光譜的最優(yōu)模型的 R、RMSEC和MRE分別為0.983 3、0.353 9和0.225 7，模型參數(shù) mtry為800，ntree為500，測試集的 R、RMSEP和MRE分別為0.779 5、0.039 7和0.335 2。

從以上結果可知，1D9S光譜模型的預測效果并不理想，原因可能是導數(shù)光譜在消除基線和其他背景干擾的同時，把有用的光譜信息也一并去除了；相比之下，9S光譜和OS光譜所建模型的預測效果更佳，說明在本試驗中，原始光譜包含的大量細節(jié)信息都比較重要。綜合考慮，本文選擇OS光譜建立的最優(yōu)模型進行后續(xù)計算。

2.5 樣品測定

分別取廣東、廣西和福建3個產(chǎn)地的地龍藥材飲片1 g，精密稱定，粉碎后經(jīng)相同處理，包括濕法硝解、凈化、絡合、富集等過程，最后采集光譜。每個樣品平行測定6次，取平均光譜代入校正模型計算，預測Cu元素的質量分數(shù)。同時將該3批藥材送中國廣州分析測試中心進行電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）檢測，測定Cu元素的準確質量分數(shù)。結果列于表2。

從表2可以看出，3個產(chǎn)地地龍所含銅元素質量分數(shù)的預測相對誤差均低于20%，說明本方法具有較好的準確性，可對實際樣品進行測定。

表1 RF模型參數(shù)優(yōu)化與評價結果Table 1 Optimization and evaluation results of RF model（ˉx±RSD，n=1 000）

表2 最佳RF模型對3批地龍藥材的預測結果Table 2 Prediction results of Pheretimae samples in optimal RF model

3 討論

紅外光譜多以透射譜形式出現(xiàn)，一般不直接用于微量或痕量分析；而衰減全反射（ATR）屬于內反射光譜，它通過增加全反射的次數(shù)，增強了吸收譜帶的強度，提高了分析靈敏度；同時，本文采用了膜富集技術，更加有效地提高了分析靈敏度，為中藥微量重金屬元素檢測提供了新方法。在今后工作中，我們將對絡合劑、配制絡合劑用溶劑、微孔濾膜、緩沖溶液、其他離子干擾等因素進行深入討論，以進一步完善本方法。

本文以膜富集技術結合隨機森林回歸模型對地龍飲片中的微量銅元素進行定量分析，最優(yōu)模型對訓練集和測試集的預測結果的R、RMSE和MRE分別為0.988 5、0.362 4、0.232 1和0.966 5、0.024 8、0.258 6，對3批不同產(chǎn)地的實際樣品預測相對誤差均小于20%，取得較好結果。本方法有望成為中藥材重金屬檢測的一種快速、準確、經(jīng)濟的新方法。

參考文獻：

［1］韓小麗，張小波，郭蘭萍，等.中藥材重金屬污染現(xiàn)狀的統(tǒng)計分析［J］.中國中藥雜志，2008，33（18）：2041-2048.

［2］趙連華，楊銀慧，胡一晨，等.我國中藥材中重金屬污染現(xiàn)狀分析及對策研究［J］.中草藥，2014，45（9）：1199-1206.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版四部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：101.

［4］李薇，沈克，楊潔瑜，等.廣地龍對重金屬富集特性的初步研究［J］.中藥材，2007，30（5）：519-521.

［5］吳波.參環(huán)毛蚓對重金屬鎘離子的生理響應及其變化規(guī)律的研究［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2010.

［6］朱碧琳，胡慧廉，JIBRAN IQBAL，等.膜富集-可見漫反射光譜法測定池塘水和維生素B12藥片中痕量鈷［J］.理化檢驗：化學分冊，2015，51（2）：172-175.

［7］張曉芳，朱碧琳，李煒，等.表面活性劑-膜富集-紫外可見漫反射光譜法測定水中的痕量鉛［J］.光譜學與光譜分析，2015，35（7）：1944-1948.

［8］邵學廣，寧宇，劉鳳霞，等.近紅外光譜在無機微量成分分析中的應用［J］.化學學報，2012，70（20）：2109-2114.

［9］NING Yu，LI Jihui，CAI Wensheng，et al.Simultaneous determination of heavy metal ions in water using nearinfraredspectroscopywithpreconcentrationbynanohydroxyapatite［J］.SpectrochimActaAMolBiomol Spectrosc，2012，96（12）：289-294.

［10］LI Jihui，ZHANG Yan，CAI Wensheng，et al.Simultaneous determination of mercury，lead and cadmium ions in water using near-infrared spectroscopy with preconcentration by thiol-functionalizedmagnesiumphyllosilicateclay［J］. Talanta，2011，84（3）：679-683.

［11］SHENG Nan，CAI Wensheng，SHAO Xueguang.An approach by using near-infrared diffuse reflectance spectroscopy and resin adsorption for the determination of copper，cobalt and nickel ions in dilute solution［J］.Talanta，2009，79（2）：339-343.

［12］朱碧琳.膜富集-可見漫反射光譜法測定痕量重金屬的方法研究［D］.上海：華東理工大學，2014.

［13］杜一平，潘鐵英，張玉蘭.化學計量學應用［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2008：1-7.

［14］BREIMAN L.Random forests［J］.Mach Learn，2001，45 （1）：5-32.

［15］劉孝良.基于半監(jiān)督學習的隨機森林算法研究與應用［D］.青島：中國海洋大學，2013.

［16］武曉巖，李康.基因表達數(shù)據(jù)判別分析的隨機森林方法［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2006，23（6）：491-494.

［17］李欣海.隨機森林模型在分類與回歸分析中的應用［J］.應用昆蟲學報，2013，50（4）：1190-1197.

［18］王偉偉，魏偉偉，宋向崗，等.不同預處理方法對苯丙酮尿癥FTIR/ATR光譜篩查模型的影響［J］.光譜學與光譜分析，2015，35（5）：1218-1221.

［19］魏偉偉，王偉偉，宋向崗，等.應用多模型共識偏最小二乘法和FTIR/ATR光譜技術建立苯丙酮尿癥的篩查模型［J］.分析科學學報，2015，31（2）：257-260.

（責任編輯：劉曉涵）

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0325-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016040803

收稿日期：2016-04-08

基金項目：國家自然科學基金 （81274059）；廣東省自然科學基金（S2012010009166）；廣州市珠江科技新星基金（2014J2200021）；廣東省教育廳優(yōu)秀青年教師基金資助項目（Yq2013102）

作者簡介：蔡嘉華（1990—），女，2013級碩士研究生，Email：jiahuacai@163.com；通信作者：陳超（1981—），男，教授，碩士生導師，從事中藥質量控制研究，Email：gdpuchenchao@163.com；梁生旺（1954—），男，教授，碩士生導師，從事中藥質量控制研究，Email：swliang371@163.com。

Quantitative analysis on Cu content in pheretimae by FTIR-ATR spectra combining with membrane enrichment technology

CAI Jiahua1，2，3，YIN Songjie1，2，3，CHEN Chao1，2，3，WANG Shumei1，2，3，LIANG Shengwang1，2，3
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.State Administration of TCM，P.R.China，Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica，Guangzhou 510006，China；3.Engineering and Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universites of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China）

AbstractObjective To establish a rapid economic method for the determination of Cu content in the TCM pheretimae by FTIR-ATR spectra combined with membrane enrichment technology.Methods 30 calibration samples were processed by wet digestion and complexed by PAN a metal complexing agent for Cu.The complexing conditions including pH PAN quantity and reaction time were optimized with characteristic absorption of complex compounds as index.Then complex compounds were filtered in microporous membranes and the FTIR-ATR spectra of which were collected processed by 9-point smoothing and 9-point smoothing coupled with first differential etc.for the calibration.A calibration model of Cu content in pheretimae was established using random forest algorithm in which the calibration set was randomly assigned as training set and test set in 3∶1 ratio and the parameters were optimized as well.Cu contents

網(wǎng)絡出版時間：2016-06-12 15：13 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160612.1513.003.htmlof pheretimae in Guangdong Guangxi and Fujian were predicted by optimized model and compared with ICP-MS results.Resluts The prediction concentrations in pheretima samples of three different roots using optimized model were between 5.85-6.98 mg/kg with relative error less than 20%compared with ICP-MS results.Conclusion A new method for the quantitative analysis of heavy metals in TCM was established and the sensitivity of FTIR-ATR was improved combined with membrane enrichment technology.The content of microscale Cu could be predicted in pheretimae properly.

Key wordsmembrane enrichment FTIR-ATR random forest pheretima heavy metals