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        外翻腸囊法研究奧硝唑?qū)τ丑w在大鼠不同腸段的吸收特性

        2016-07-27 07:22:23王嫦鶴劉雪峰耿慶光
        西北藥學(xué)雜志 2016年4期
        關(guān)鍵詞:奧硝唑糖蛋白

        王嫦鶴, 劉雪峰,王 莉, 耿慶光

        (陜西省食品藥品檢驗(yàn)所,西安 710061)

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        ·藥物分析·

        外翻腸囊法研究奧硝唑?qū)τ丑w在大鼠不同腸段的吸收特性

        王嫦鶴, 劉雪峰,王莉, 耿慶光

        (陜西省食品藥品檢驗(yàn)所,西安710061)

        摘要:目的考察奧硝唑在大鼠各腸段的吸收特性及奧硝唑兩手性對(duì)映體在大鼠不同腸段吸收的差異性。方法采用大鼠外翻腸囊法,以HPLC手性色譜柱法測(cè)定奧硝唑在不同腸段的吸收量以及S-奧硝唑及R-奧硝唑的同一腸段腸吸收量,并分別計(jì)算吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp),同法考察了P-蛋白抑制劑(維拉帕米和環(huán)孢素A)對(duì)奧硝唑腸吸收特性的影響。結(jié)果奧硝唑在不同腸段吸收均呈線性,符合零級(jí)藥物吸收速率,吸收趨勢(shì)為空腸>回腸>結(jié)腸。在空腸段兩對(duì)映體以近于1∶1的比例同時(shí)吸收,吸收速率不存在顯著差異,隨著供試液中奧硝唑質(zhì)量濃度的上升,Ka呈線性增加(R2>0.99),Paap基本保持不變,P-蛋白抑制劑對(duì)奧硝唑的腸吸收沒有顯著性影響(P>0.05)。結(jié)論奧硝唑在不同腸段的吸收有差異,空腸部位是吸收的最佳部位(P<0.05),S-奧硝唑與R-奧硝唑在腸道中吸收速率不存在顯著差異,吸收以被動(dòng)擴(kuò)散機(jī)制為主,奧硝唑不是P-糖蛋白的底物。

        關(guān)鍵詞:奧硝唑;腸外翻;對(duì)映體;P-糖蛋白

        奧硝唑是硝基咪唑類藥物,結(jié)構(gòu)中有一個(gè)手性中心,故有一對(duì)手性對(duì)映體。目前臨床上使用的大多是奧硝唑的消旋體,其抗厭氧菌的作用比甲硝唑更強(qiáng)[1]。研究報(bào)道[2],左旋奧硝唑[S-(-)-1-(3-氯-2-羥丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑]是奧硝唑的L-型對(duì)映體,其藥動(dòng)學(xué)特性優(yōu)于奧硝唑的消旋體,但毒性、中樞抑制作用均低于右旋體和消旋體。因此,左旋奧硝唑的研究和應(yīng)用也越來越受到研究者的重視[3]。為深入探討奧硝唑的腸吸收特性,本文采用大鼠腸外翻模型,研究了奧硝唑在不同腸段的吸收及奧硝唑S-奧硝唑和R-奧硝唑在腸道中的吸收情況,為闡明奧硝唑?qū)τ丑w的腸吸收動(dòng)力學(xué)機(jī)制、指導(dǎo)臨床用藥和提高臨床療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1儀器與材料

        1.1儀器島津Nexera UHPLC LC-30A高效液相色譜儀(含New LC-30AD泵系統(tǒng)、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱、SPD-20A紫外檢測(cè)器、CBM-20A控制器、Empower色譜數(shù)據(jù)理系統(tǒng));Chiralcel OB-H手性色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,日本Daicel Chemical IND公司);Allegra 64R低溫高速離心機(jī)(美國(guó) Beckman Coulter 公司);JXDC-20型氮吹儀(上海凈信科技有限公司);Direct-Q3型超純水機(jī)(默克化工技術(shù)(上海)有限公司);DK-98-IIA恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司);AB135-S型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司); XH-C型渦旋振蕩器(南京東邁科技儀器有限公司);混合氣體(95%O2,5%CO2)。

        1.2試藥奧硝唑消旋體對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):100608-201102);左旋奧硝唑?qū)φ掌?S-奧硝唑,中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):100874-200501);右旋奧硝唑?qū)φ掌?R-奧硝唑,光學(xué)質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99. 5%)由南京圣和藥業(yè)有限公司提供;鹽酸維拉帕米(verapamile,Ver,中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):100223-200102);環(huán)孢素A(cycloporine,CsA,中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):30495-200202);甲醇、正己烷和異丙醇均為德國(guó) Merck公司色譜純?cè)噭?/p>

        1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠,體質(zhì)量250±20 g,西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK(陜)2012-003)。

        2實(shí)驗(yàn)方法

        2.1色譜條件色譜柱:Daicel Chiralcel OB-H手性柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:正己烷-異丙醇-甲醇(95∶1∶4);進(jìn)樣體積:5 μL;柱溫:30 ℃;流速:0.5 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):318 nm。

        2.2溶液的配制臺(tái)氏液(Tyrode液):稱取氯化鈉8.0 g,氯化鉀0.2 g,碳酸氫鈉1.0 g,磷酸二氫鈉0.05 g,氯化鎂0.1 g,加蒸餾水溶解;稱取氯化鈣0.2 g,加蒸餾水溶解;稱取葡萄糖1.0 g,加蒸餾水溶解;混勻,用蒸餾水定容至1 L即得。

        混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:分別精密稱取S-奧硝唑和R-奧硝唑?qū)φ掌愤m量,用流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1的溶液作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

        奧硝唑供試液:精密稱取奧硝唑?qū)φ掌愤m量,加臺(tái)氏液超聲溶解并定容,分別制備成質(zhì)量濃度約為5,10,25,50和100 mg·L-1的等系列溶液作為奧硝唑供試液。

        含Ver的奧硝唑供試液:精密稱取奧硝唑?qū)φ掌愤m量,加適量臺(tái)氏液超聲溶解,向其中分別加入Ver適量,用臺(tái)氏液定容,制備成含100 μg·mL-1的Ver及5,25和50 μg·mL-1奧硝唑的供試液。

        含CsA的奧硝唑供試液:精密稱取奧硝唑?qū)φ掌愤m量,加適量臺(tái)氏液超聲溶解,向其中分別加入CsA適量,用臺(tái)氏液定容,制備成含100 μg·mL-1的CsA及5,25 和50 μg·mL-1奧硝唑的供試液。

        2.3大鼠翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分組,每組5只,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,自由飲水。采用文獻(xiàn)報(bào)道[4]的翻轉(zhuǎn)腸囊法實(shí)驗(yàn)。在給藥后 30,45,60,90,120和180 min從腸囊內(nèi)取樣1 mL,同時(shí)補(bǔ)充相同體積的空白臺(tái)氏液。樣品置于5 mL帶蓋離心試管中,加入乙酸乙酯200 μL,漩渦振蕩3 min,以13 000 r·min-1離心5 min;分取上層有機(jī)層,用乙酸乙酯重復(fù)萃取2次,合并有機(jī)層,氮吹儀吹干除去乙酸乙酯;加流動(dòng)相200 μL溶解,以0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液5 μL進(jìn)樣分析,測(cè)定樣品中S-奧硝唑及R-奧硝唑含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將腸管縱向剖開,自然攤于濾紙上,測(cè)量長(zhǎng)度和寬度,記錄腸段吸收面積A。

        2.4線性實(shí)驗(yàn)取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為0.5~150 μg·mL-1的系列溶液作為線性溶液。分別精密量取該系列溶液5 μL,按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸。R-奧硝唑回歸方程:Y=34 716X-6.4×105(r=0.999 5),線性范圍:0.5~150 μg·mL-1;S-奧硝唑回歸方程:Y=34 598X-6.4×105(r=0.999 2),線性范圍:0.5~150 μg·mL-1。

        2.5數(shù)據(jù)處理

        2.5.1藥物累積吸收量按照下式計(jì)算。

        Q為藥物各時(shí)間的累積吸收量,Cn為n時(shí)間點(diǎn)的實(shí)際檢測(cè)質(zhì)量濃度,Vs為取樣體積,Ci為樣品質(zhì)量濃度。

        3結(jié)果

        3.1高效液相測(cè)定方法Chiralcel OB-H手性柱可用于分離含有酰胺基、芳香基團(tuán)、羰基、硝基、磺?;⑶杌土u基類化合物。流動(dòng)相中甲醇和異丙醇的變化對(duì)分離度影響較大,且異丙醇的比例過小會(huì)出現(xiàn)溶液分層現(xiàn)象。臺(tái)氏液對(duì)奧硝唑的測(cè)定無干擾,專屬性較好,見圖1。

        圖1奧硝唑手性分離HPLC圖

        A.奧硝唑?qū)φ掌? B.腸吸收液樣品; C.臺(tái)氏液空白; 1.R-奧硝唑; 2.S-奧硝唑

        Fig.1 HPLC chromatograms of ornidazole analyzed by chiral chromatographic column

        A.reference substance of ornidazole;B.sample of intestinal absorption; C.blank sample; 1.R-ornidazole; 2.S-ornidazole

        3.2奧硝唑在不同腸段的吸收情況取同一大鼠的不同腸段置于2.2項(xiàng)下25 μg·mL-1的奧硝唑供試液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,奧硝唑在空腸、回腸和結(jié)腸均有不同程度的吸收,并且在同一腸段累計(jì)吸收量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈線性增加,兩對(duì)映體在180 min內(nèi)均未呈現(xiàn)飽和?;貧w分析結(jié)果表明,兩對(duì)映體在不同腸段的吸收與時(shí)間呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2) 均大于 0.9,符合零級(jí)藥物吸收速率。

        奧硝唑在空腸段的Ka和Papp分別為0.039±0.012 μg·cm-2·min-1和0.001 3±0.000 4 cm·min-1,均高于回腸段0.020±0.008 μg·cm-2·min-1和0.000 75±0.000 16 cm·min-1(P<0.05)以及結(jié)腸段0.009 8±0.002 6 μg·cm-2·min-1和0.000 39±0.000 09 cm·min-1(P<0.05)。結(jié)果表明,奧硝唑在不同腸段吸收趨勢(shì)為:空腸>回腸>結(jié)腸。3.3S-奧硝唑和R-奧硝唑在腸道中的吸收差異取大鼠的空腸部位置于2.2項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的奧硝唑供試液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,S-奧硝唑或R-奧硝唑在空腸中的累積吸收量(Q)隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈線性增加。隨著時(shí)間的增長(zhǎng),S-奧硝唑與R-奧硝唑在腸道中吸收速率不存在顯著差異,而是以接近于1∶1的比例同時(shí)吸收;隨著供試液中奧硝唑質(zhì)量濃度的上升,Ka呈線性增加(R2>0.99),Paap基本保持不變,表明奧硝唑的吸收以被動(dòng)擴(kuò)散機(jī)制為主。結(jié)果見表1。

        3.4P-gp抑制劑對(duì)奧硝唑腸吸收的影響取大鼠的空腸部位置于2.2項(xiàng)下含Ver和CsA的奧硝唑供試液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,相對(duì)于空白組,含Ver的奧硝唑供試液在空腸中的Ka和Papp分別為0.059±0.016 μg·cm-2·min-1和0.001 8±0.000 9 cm·min-1,稍高于空白組的0.049±0.012μg·cm-2·min-1和0.001 3±0.000 4 cm·min-1,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。含CsA的奧硝唑供試液在空腸中的Ka和Papp分別為0.048±0.015 μg·cm-2·min-1和0.000 9±0.000 6 cm·min-1,與空白組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表1空腸中S-奧硝唑與R-奧硝唑的吸收特性比較

        Tab.1 Comparison of the absorption characteristics of S-ornidazole and R-ornidazole at jejunum

        ±s,n=3)

        4討論

        文獻(xiàn)報(bào)道[5-6],由于離體腸囊體外時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)失去生理活性,導(dǎo)致腸囊的通透性發(fā)生變化,因此目前離體組織實(shí)驗(yàn)多在60~90 min內(nèi)。研究結(jié)果表明,奧硝唑在空腸、回腸和結(jié)腸均有吸收,各個(gè)腸段Papp均大于1×10-4cm·min-1,空腸是奧硝唑腸吸收的最佳部位。隨著供試液中奧硝唑質(zhì)量濃度增加,藥物吸收速率常數(shù)Ka呈線性增加(R2>0.94),其表觀滲透系數(shù)Paap不變,表明奧硝唑的吸收以被動(dòng)擴(kuò)散吸收機(jī)制為主。

        大鼠翻轉(zhuǎn)腸囊吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,S-奧硝唑與R-奧硝唑在腸道中的吸收速率基本一致,不存在顯著性差異。有研究報(bào)道[7],S-奧硝唑和R-奧硝唑在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性存在一定的差異,奧硝唑口服給藥后,S-奧硝唑和R-奧硝唑的t1/2分別為2.49和3.42 h,AUC分別為168.21和207.19 μg·min·mL-1,這些差異可能與S-奧硝唑與R-奧硝唑在大鼠體內(nèi)的代謝速度不同有關(guān)。

        本實(shí)驗(yàn)中,空腸段是奧硝唑吸收的最佳部位,選取空腸進(jìn)一步探究了P-蛋白抑制劑對(duì)奧硝唑吸收的影響。從數(shù)據(jù)結(jié)果可知,P-蛋白抑制劑對(duì)奧硝唑的吸收沒有明顯影響,結(jié)果說明奧硝唑不是P-糖蛋白的底物。參考文獻(xiàn):

        [1]田懷平, 馬小亞, 王美納.奧硝唑在兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和生物利用度研究[J].西北藥學(xué)雜志,2005,20(3):104-106.

        [2]孫繼紅,王志強(qiáng),顧興麗,等.左旋和右旋奧硝唑?qū)π∈笾袠猩窠?jīng)系統(tǒng)毒副作用的比較研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(4):343-347.

        [3]陳憶冰,李健和,黎銀波,等.左旋奧硝唑氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[J].西北藥學(xué)雜志,2006,22(3):141-142.

        [4]董宇,張英豐,楊慶,等.戊己丸提取物不同配伍的腸外翻吸收研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2010,26(10):1377-1382.

        [5]郭竹君,崔志清,段宏泉.縛管翻轉(zhuǎn)腸囊法研究委陵菜黃酮在大鼠小腸內(nèi)的吸收行為[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,15(3):348-350.

        [6]何卉,陳西敬,王廣基.藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體在反式白藜蘆醇腸道吸收中的作用[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(4):324-328.

        [7]陳燕,石濤,柳曉泉,等.左旋和右旋奧硝唑在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,37(1):41-44.

        基金項(xiàng)目:陜西省社會(huì)科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):13G020)

        作者簡(jiǎn)介:王嫦鶴,女,博士,副主任藥師

        *通信作者:耿慶光,女,副主任藥師

        doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.013

        中圖分類號(hào):R945

        文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

        文章編號(hào):1004-2407(2016)04-0371-04

        (收稿日期:2015-09-22)

        Study on the absorption characteristics of ornidazole enantiomers at different intestine segments by isolated in vitro-everted intestine model

        WANG Changhe, LIU Xuefeng, WANG Li, GENG Qingguang*

        (Shaanxi Institute for Food and Drug Control, Xi′an 710061, China)

        Abstract:Objective To study the absorption characteristics of ornidazole and the absorption difference of ornidazole enantiomers at different intestine segments by isolated in vitro-everted sac intestine model, and to investigate the effect of P-inhibitors to ornidazole intestinal absorption.Methods Rat in vitro-everted intestine sac was used to determine the characteristics of ornidazole.The concentration of ornidazole and its enantiomers at different intestine segments were determined by HPLC equipped with chiral chromatographic column.Then the constant of absorption rate(Ka) and the apparent permeability coefficient(Papp) were calculated.Same method was applied in investigating the impact of the P-glycoprotein inhibitors(verapamil and cyclosporin A) on the absorption of ornidazole in intestinal segments.Results The absorption of ornidazole in different intestinal segments showed a linear absorption and complied with the zero order kinetics.The descending order of ornidazole absorption was jejunum, ileum and colon.There was no significant difference among the absorption rate of the two enantiomers.Ka increased linearly(R2>0.99) and Paapremained unchanged with the rise of concentration for ornidazole in solution at jejunum.P-protein inhibitors had no significant effect on the intestinal absorption(P>0.05).Conclusion The absorption of ornidazole in different intestinal segments was different and the Ka and Paapat jejunum were significantly higher than that at the other segments of intestine (P<0.05).There was no significant difference between S-ornidazole and R-ornidazole in the intestinal absorption rate and met the passive transport mechanism.Ornidazole would not be the substrate of P-protein inhibitor.

        Key words:ornidazole; intestinal eversion; enantiomer; P-protein inhibitor

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