陳 睿，楊范莉，張 琳

(1.陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院，寶雞　721001；2.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安　710061；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽(yáng)　712046)

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響應(yīng)面分析法優(yōu)選桑寄生總黃酮的提取工藝

陳 睿1，楊范莉2，張 琳3

(1.陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院，寶雞721001；2.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安710061；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽(yáng)712046)

摘要：目的 利用響應(yīng)面法優(yōu)化桑寄生總黃酮的提取工藝條件。方法 采用中心組合設(shè)計(jì)方法，分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶媒用量、提取時(shí)間及提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的最佳提取工藝條件。結(jié)果 最佳提取工藝條件為：體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇，液固比為40∶1，回流提取2次，每次1 h。結(jié)論在最佳工藝條件下，桑寄生總黃酮的提取率為1.15%，高于其他條件下的提取率，該工藝條件可為桑寄生總黃酮的工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桑寄生；總黃酮；提取工藝;響應(yīng)面分析法

桑寄生(Taxillusherba)為桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.)，常入藥為干燥葉及莖枝，常寄生于桑、桃、李等多種植物上[1]，分布在我國(guó)的西南、中南、華南等地區(qū)[2]；具有補(bǔ)腎益肝、祛風(fēng)除濕、通經(jīng)安胎等功效，常用于治療腰膝酸軟、筋骨無(wú)力、風(fēng)濕疼痛及胎動(dòng)等[3-4]。文獻(xiàn)報(bào)道，桑寄生中主要含有黃酮和甾體皂苷類化學(xué)成分[5-6]，有研究表明，桑寄生提取物有黃酮類化合物、甾體化合物、有機(jī)酸、胺類化合物、生物堿和氨基酸等[7-8]，其中黃酮類物質(zhì)存在于多種植物藥材中，為一類黃色素、次級(jí)代謝產(chǎn)物[9]，具有廣泛的藥用價(jià)值[10]。但目前對(duì)其主要化學(xué)成分總黃酮的提取工藝研究未見報(bào)道。響應(yīng)面分析法可以找到最佳點(diǎn)，并靈敏考察各因素之間的交互作用[11]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化桑寄生總黃酮的提取工藝，以期高產(chǎn)、高效、節(jié)能地制備桑寄生總黃酮，為桑寄生總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器UV-1102紫外分光光度計(jì)(上海天美責(zé)任有限公司)；R200D電子分析天平(精度0.1 mg，德國(guó)Satorius公司)。

1.2試藥桑寄生藥材，購(gòu)自咸陽(yáng)百姓樂大藥房，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為桑寄生科植物桑寄生的干燥帶葉莖枝；對(duì)照品：蘆丁，批號(hào)為MUST-14101410；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1最大吸收波長(zhǎng)掃描和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作稱取蘆丁對(duì)照品5.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶解，搖勻，定容至10 mL，即得0.5 mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液。

吸取0.3 mL蘆丁對(duì)照品溶液，采用UV-1102型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)在400～700 nm范圍內(nèi)掃描，最終確定其最大吸收波長(zhǎng)。

分別吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.3 mL，置于10 mL試管中，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉(Al(NO)3-NaNO2)顯色法進(jìn)行顯色，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A和濃度C進(jìn)行線性回歸，并繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2桑寄生總黃酮得率的計(jì)算稱取1.0 g桑寄生，按照常規(guī)方法提取后，采用Al(NO)3-NaNO2顯色法進(jìn)行顯色，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光度A計(jì)算出黃酮質(zhì)量的濃度C，即桑寄生總黃酮得率Y，公式為：Y=C×N×V×10-6/m。C：黃酮的質(zhì)量濃度/g·mL-1；V：濾液的體積/mL；m：樣品的質(zhì)量/g；N：稀釋倍數(shù)。

2.3方法學(xué)考察按照 2.2項(xiàng)下提取方法，采用Al(NO)3-NaNO2顯色法分別進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、回收率實(shí)驗(yàn)及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，對(duì)桑寄生總黃酮進(jìn)行方法學(xué)考察研究。2.4單因素實(shí)驗(yàn)按照 2.2項(xiàng)下提取方法，在其他條件不變的情況下，分別進(jìn)行乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶媒用量、提取時(shí)間及提取次數(shù)對(duì)桑寄生總黃酮得率的實(shí)驗(yàn)研究。

2.5響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以方法學(xué)及單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，分別考察3個(gè)因素(考察因子)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶媒量及提取時(shí)間，響應(yīng)值即總黃酮得率Y，采用Design-expert軟件設(shè)計(jì)即3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，由結(jié)果最終確定桑寄生總黃酮提取的最佳工藝。

3結(jié)果

3.1蘆丁對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線采用UV-1102型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)在400～700 nm 處進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，最終確定最大吸收波長(zhǎng)為506 nm。故在506 nm波長(zhǎng)處測(cè)得蘆丁線性回歸方程：Y=10.086X+0.038 4(r=0.999 4)，且蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

3.2方法學(xué)考察

3.2.1精密度實(shí)驗(yàn) 稱取桑寄生1.0 g，按照2.2項(xiàng)下提取方法，吸取6份續(xù)濾液，分別測(cè)定每份的吸光度，并計(jì)算RSD，RSD為0.099 6%，結(jié)果說(shuō)明精密度良好。3.2.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 稱取桑寄生1.0 g，按照2.2項(xiàng)下提取方法，分別在0.5，1，1.5，2，2.5和3 h測(cè)定其吸光度。桑寄生顯色后，2 h內(nèi)吸光度變化不大，表明桑寄生總黃酮顯色后穩(wěn)定性良好。

3.2.3加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱取桑寄生1.0 g，6份。按照2.2項(xiàng)下方法提取，分別吸取1 mL濾液，依次測(cè)定其吸光度，在另外6份濾液中分別加入5 mL蘆丁對(duì)照品溶液，再分別測(cè)定其吸光度，計(jì)算回收率。由表1可知，平均回收率為98.87%，Al(NO)3- NaNO2顯色法測(cè)定桑寄生中黃酮的準(zhǔn)確度較高。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 The results of recovery experiment

取樣量/g原有量/mg蘆丁加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%1.000370.660.0571.6296.198.871.000176.610.0577.61100.298.871.000566.860.0567.89103.298.870.999570.000.0571.01101.298.871.000271.490.0572.4394.598.870.999874.460.0575.4498.098.87

3.2.4重復(fù)性提取黃酮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 稱取桑寄生1.0 g，6份。按照2.2項(xiàng)下提取方法，分別測(cè)定其吸光度，并計(jì)算RSD。RSD為0.438%，說(shuō)明桑寄生總黃酮重復(fù)性較好。

3.3單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1乙醇對(duì)桑寄生總黃酮得率的影響 設(shè)定條件液固比為40∶1，提取時(shí)間為2 h，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于40%時(shí)，桑寄生總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大；乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，桑寄生總黃酮得率達(dá)到最大值；乙醇體積分?jǐn)?shù)大于40%時(shí)，桑寄生總黃酮得率下降。

3.3.2液固比對(duì)桑寄生總黃酮得率的影響 設(shè)定條件乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，提取時(shí)間為2 h，桑寄生總黃酮得率隨著液固比的增加而升高，當(dāng)液固比為30∶1時(shí)，桑寄生總黃酮的得率達(dá)到了最大值，但繼續(xù)增加液固比時(shí)，總黃酮得率開始下降。3.3.3提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響 設(shè)定條件乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，液固比為30∶1，當(dāng)提取時(shí)間在0.5～1.5 h時(shí)，桑寄生總黃酮得率呈上升趨勢(shì)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率開始下降。

3.4采用響應(yīng)面法對(duì)桑寄生總黃酮提取工藝的優(yōu)化

3.4.1合理選取響應(yīng)面分析因素與水平3因素分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)A、液固比B及提取時(shí)間C，3因素及3水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)因素水平表

Tab.2 Factors and levels of the designed experiment

水平A,乙醇體積分?jǐn)?shù)/%B,液固比/mL·g-1C,提取時(shí)間/h-13030∶10.504040∶11.015050∶11.5

3.4.2響應(yīng)面分析方案及結(jié)果采用Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)擬合并進(jìn)而建立數(shù)學(xué)模型，見表3。

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

Tab.3 Experiment program and test results of RSM

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCY/%10110.9902-1-100.81031-100.84040001.12051011.1456-10-11.0307-1100.9258-1011.100910-11.0751001-10.830110001.125120001.115130001.130140001.090150-110.895161100.950170-1-10.870

3.4.3方差分析 經(jīng)Design-Expert 8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，見表4。從表4可以看出，模擬失擬項(xiàng)(P=0.066 1)不顯著，由此可知影響回歸方程失擬平方和的主要原因是實(shí)驗(yàn)誤差的產(chǎn)生。方程的模型值達(dá)極顯著水平(P<0.000 1)，說(shuō)明該模型用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度較高。方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，表明方程有最大值。由P值可知，3個(gè)因素對(duì)桑寄生總黃酮提取率的影響排序?yàn)椋禾崛r(shí)間>液固比>乙醇體積分?jǐn)?shù)。

3.4.4響應(yīng)曲面結(jié)果分析見圖1～3。從圖1可以看出，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)，隨著液固比的升高，提取率增加，當(dāng)液固比達(dá)40∶1時(shí)，提取率增加不明顯；固定液固比，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加時(shí)提取率增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)接近40%時(shí)，提取率達(dá)到最大值。由此可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)接近40%，液固比接近40∶1的區(qū)域有最大提取率。從圖2可以看出，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)，隨著提取時(shí)間的增加，提取率增加，當(dāng)提取時(shí)間接近1 h時(shí)，提取率最大；固定提取時(shí)間，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加時(shí)提取率增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)接近40%時(shí)，提取率最大。由此可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)接近40%，提取時(shí)間接近1 h的區(qū)域有最大提取率。從圖3可以看出，固定液固比，隨著提取時(shí)間的增加，提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間接近1 h時(shí)，提取率最大；而當(dāng)固定提取時(shí)間，隨著液固比的增加，提取率增大，液固比接近40∶1時(shí)，提取率增加不明顯。由此可知，提取時(shí)間接近1 h，液固比接近40∶1的區(qū)域有最大提取率。

表4 方差分析結(jié)果

Tab.4 Results of analysis of variance

方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值模型0.2390.02535.46<0.0001A2.63×10-312.63×10-33.690.0963B9.80×10-319.80×10-313.750.0076C0.01310.01318.530.0035AB6.25×10-616.25×10-68.77×10-30.9280AC01001.000BC4.56×10-314.56×10-36.390.0393A21.99×10-311.99×10-32.790.1385B20.1910.19268.04<0.0001C21.92×10-411.92×10-40.270.6199殘差4.99×10-377.13×10-4失擬性4.02×10-331.34×10-35.520.0661誤差9.70×10-442.43×10-4總離差0.2316

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比對(duì)桑寄生總黃酮提取率的影響

Fig.1 Effect of total flavonoids of ethanol volume fraction and liquid-solid ratio on the extraction rate

圖2 提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桑寄生總黃酮提取率的影響

Fig.2 Effect of total flavonoids of extraction time and ethanol volume fraction on the extraction rate

圖3 提取時(shí)間和液固比對(duì)桑寄生總黃酮提取率的影響

Fig.3 Effect of total flavonoids of extraction time and liquid-solid ratio on the extraction rate

3.4.5提取工藝條件的確定 通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到最大提取率為1.147%，此時(shí)的最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為43.11%，液固比為41.33∶1，提取時(shí)間為1.32 h?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)情況，確定桑寄生總黃酮提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，液固比為40∶1，提取時(shí)間為1 h。

3.4.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，提取條件設(shè)定為體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇，液固比為40∶1，提取時(shí)間為1.32 h，最終計(jì)算出桑寄生總黃酮的平均得率為1.147%。采用上述確定的工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提取率分別為1.148%,1.146%和1.146%，平均為1.146%。

4討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Al(NO)3-NaNO2顯色法對(duì)桑寄生總黃酮含量進(jìn)行方法學(xué)考察。精密度實(shí)驗(yàn)RSD為0.099 6%，精密度較高；加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果為98.87%；顯色在2 h內(nèi)較為穩(wěn)定。另外，對(duì)6份桑寄生總黃酮進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，RSD為0.438%，重復(fù)性較好。

另外，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于40%時(shí)，桑寄生總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)接近40%時(shí)，得率達(dá)到最大值，但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于40%時(shí)，總黃酮得率逐漸減小。響應(yīng)曲面結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)在一定范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮得率增加，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，黃酮得率會(huì)下降。

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件是一種新型有效的設(shè)計(jì)方法，能準(zhǔn)確、快速地得出提取工藝參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面圖客觀全面地分析了因素水平對(duì)桑寄生總黃酮提取率的影響，最終得出最佳的提取工藝為：體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇，液固比為40∶1，提取時(shí)間為1 h。

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doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.012

中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)04-0367-04

(收稿日期：2015-09-09)

Optimization of extraction technology of total flavonoids from Taxilli herba by design-response surface method

CHEN Rui1，YANG Fanli2，ZHANG Lin3

(1.Baoji City Chinese Medicine Hospital of Shaanxi， Baoji 721001，China；2. School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China；3.Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China)

Abstract:ObjectiveTo optimize the extracting process of the total flavonoids of Taxilli herba.MethodsAccording to the center combination method，the effets of ethanol volume fraction， the ratio of solid to liquid，and the extraction time， and the extraction times were studied by central composite design.ResultsThe optimal conditions of extraction were as follows: the ethanol volume fraction was 40%，the ratio of solid to liquid was 40∶1， the extraction was 2 times，the extraction time was 1 h.ConclusionThe actual extraction yield was 1.15%.The method of extraction has higher extraction efficiency compared with other methods. And the method can provide a basis for the industrial production of the total flavonoids from Taxilli herba.

Key words:Taxilli herba；total flavonoids； extraction technique; response surface analysis