王兆華，張大軍

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春　130012)

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山楂葉不同采收期多種有效成分含量的比較

王兆華，張大軍

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春130012)

摘要：目的探索山楂葉最佳采收期。方法HPLC條件：金絲桃苷檢測(cè)采用Shim-pack C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-甲醇-四氫呋喃-5 mL·L-1醋酸溶液(1∶1∶19.4∶78.6)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為363 nm。牡荊素鼠李糖苷檢測(cè)采用Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；四氫呋喃-甲醇-乙腈-乙酸-水(38∶3∶3∶4∶152)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。總黃酮檢測(cè)利用可見(jiàn)分光光度法，以蘆丁對(duì)照品為對(duì)照，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系作顯色劑，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果金絲桃苷進(jìn)樣量在0.080 5～0.402 4 μg范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.999 3)；牡荊素鼠李糖苷進(jìn)樣量在0.418～2.090 μg范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.999 1)。結(jié)論5月采收的山楂葉中牡荊素鼠李糖苷含量最高；8～11月采收的山楂葉中金絲桃苷及總黃酮的含量較高。

關(guān)鍵詞：金絲桃苷；牡荊素鼠李糖苷；總黃酮；山楂葉；采收期；HPLC；分光光度法；含量測(cè)定

山楂葉[1]為rataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.CrataeguspinnatifidaBge.或Crataegus pinnatifida Bge.的干燥葉，是衛(wèi)生部公布的既是食品又是藥品的中藥[2]，是健脾開(kāi)胃、消食化滯、活血化瘀的良藥。山楂葉是常用中藥，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的功效[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，山楂葉黃酮對(duì)心臟、肝臟均具有保護(hù)作用；對(duì)腦缺血亦具有保護(hù)作用，此外，還具有降脂、抗炎、活血化瘀等多種藥理活性[4]，臨床上對(duì)心絞痛等疾病具有良好療效[5]。山楂葉的主要活性成分為黃酮類(lèi)成分，其代表成分有金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素等多種成分[6]。在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮提取物中各種有效成分變化較大，考慮到可能是不同采收季節(jié)所致，故對(duì)不同采收季節(jié)山楂葉的多種成分進(jìn)行了測(cè)定，以探求山楂葉的最佳采收期。

1儀器與試藥

1.1儀器UV-2800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；LC-10 AT高效液相色譜儀，SPD-10A紫外檢測(cè)器(日本島津公司)；KQ-250型超聲波處理器(天津奧特賽恩斯儀器公司)；AE163電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2試藥金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)111521-200303，供含量測(cè)定用)，牡荊素鼠李糖苷對(duì)照品(批號(hào)111668-200602，供含量測(cè)定用)，蘆丁對(duì)照品(批號(hào)100080-200707,供含量測(cè)定用)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；山楂葉樣品5，6，7，8，9，10和11月采自同一生長(zhǎng)區(qū)，曬干，粉碎成細(xì)粉。甲醇、乙腈為色譜純；四氫呋喃、乙酸、硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉等均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1總黃酮含量測(cè)定

2.1.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品19.90 mg，置于100 mL量瓶中，加乙醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得，質(zhì)量濃度為0.199 mg·mL-1。2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1，2，3，4和5 mL，分別置于25 mL量瓶中，依次加水至6 mL，再分別加入質(zhì)量濃度為50 g·L-1的亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，各加質(zhì)量濃度為100 g·L-1的硝酸鋁溶液1 mL，混勻，放置6 min，分別加氫氧化鈉試液10 mL，最后加水定容至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[1,7]。以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：Y=0.477 4X-0.018 4，r=0.999 3。

2.1.3供試品溶液的制備與測(cè)定取山楂葉細(xì)粉約1 g，精密稱(chēng)定，置于索氏提取器中，加三氯甲烷適量，放置30 min后，加熱回流(約3 h)提取至回流液近無(wú)色，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去溶劑，再置于索氏提取器中，加甲醇適量，繼續(xù)提取(約4 h)至近無(wú)色，將提取液蒸干，殘?jiān)酉∫掖既芙?，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品儲(chǔ)備液。取供試品儲(chǔ)備液，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取此液2 mL，置于25 mL量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備項(xiàng)下的方法，自加水至6 mL起依法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮含量，不同采收時(shí)間山楂葉中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，總黃酮在5月時(shí)含量較低，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加，含量逐漸升高，在8～11月趨于平穩(wěn)，11月又有下降的趨勢(shì)。

2.2金絲桃苷含量測(cè)定

2.2.1色譜條件色譜柱：Shim-pack C18(150 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-四氫呋喃-5 mL·L-1醋酸溶液(1∶1∶19.4∶78.6)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：363 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL[3]。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)定金絲桃苷對(duì)照品11.25 mg，置于50 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取此液5.0 mL，置于50 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得，質(zhì)量濃度為22.5 μg·mL-1。

2.2.3供試品溶液的制備與測(cè)定分別精密吸取2.1.3項(xiàng)下山楂葉供試品溶液及上述金絲桃苷對(duì)照品溶液各10 μL，按照2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，不同采收時(shí)間山楂葉中金絲桃苷含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。金絲桃苷在5月時(shí)含量較低，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加，含量逐漸升高，在8～11月趨于平穩(wěn)，11月又有下降的趨勢(shì)。

2.2.4線(xiàn)性關(guān)系考察精密吸取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為22.5 μg·mL-1)4，8，12，16和20 μL，分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以質(zhì)量濃度(C)為縱坐標(biāo)，以峰面積積分值(A)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：Y=1 105 397X-6 593，r=0.999 3，結(jié)果表明，金絲桃苷進(jìn)樣量在0.080 5～0.402 4 μg范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。2.2.5精密度實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為22.5 μg·mL-1的金絲桃苷對(duì)照品溶液10 μL，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果金絲桃苷峰面積的RSD為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液10 μL，每隔3 h進(jìn)樣1次，連續(xù)考察24 h，結(jié)果金絲桃苷峰面積的RSD為0.96%，表明金絲桃苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3牡荊素鼠李糖苷含量測(cè)定

2.3.1色譜條件色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：四氫呋喃-甲醇-乙腈-乙酸-水(38∶3∶3∶4∶152)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL[8]。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取牡荊素鼠李糖苷對(duì)照品7.78 mg，置于50 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得，質(zhì)量濃度為155.6 μg·mL-1。

2.3.3供試品溶液的制備與測(cè)定分別精密吸取2.1.3項(xiàng)下山楂葉供試品溶液及上述牡荊素鼠李糖苷對(duì)照品溶液各10 μL，按照2.3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算牡荊素鼠李糖苷含量。不同采收時(shí)間山楂葉中牡荊素鼠李糖苷含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。牡荊素鼠李糖苷在5月時(shí)含量最高，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加，含量逐漸下降，在8～11月趨于平穩(wěn)，11月有下降的趨勢(shì)。液相色譜圖見(jiàn)圖1。

表1不同采收時(shí)間山楂葉中各成分含量測(cè)定結(jié)果

Tab.1 Results of the active ingredient concentrations of Hawthorn leaves for samples of different harvests (n=3)

采收時(shí)間/月份總黃酮含量/%RSD/%金絲桃苷含量/%RSD/%牡荊素鼠李糖苷含量/%RSD/%55.140.030.0450.0031.0250.01465.960.040.0580.0010.8120.00976.050.040.0910.0020.8140.009810.250.130.1060.0020.7510.008910.340.020.1110.0020.5620.0041010.480.060.1150.0030.5420.0061110.080.110.1030.0030.5510.008

圖1HPLC圖

A.金絲桃苷對(duì)照品；B.山楂葉1；C.牡荊素鼠李糖苷對(duì)照品；D.山楂葉2；1.金絲桃苷；2.牡荊素鼠李糖苷

Fig.1 HPLC chromatogram

A.hyperin；B.hawthorn leaves 1；C.vitexin-2-O-rhamnoside；D.hawthorn leaves 2；1.hyperin；2.Cvitexin rat lee glycoside

2.3.4線(xiàn)性關(guān)系考察精密吸取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液(155.6 μg·mL-1)4，8，12，16和20 μL，分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度(C)為縱坐標(biāo)，以峰面積積分值(A)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：Y=1 253 583X+30 884，r=0.999 1，表明牡荊素鼠李糖苷進(jìn)樣量在0.418～2.090 μg范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積積分值線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.5精密度實(shí)驗(yàn)精確吸取牡荊素鼠李糖苷對(duì)照品溶液(155.6 μg·mL-1)10 μL，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果牡荊素鼠李糖苷的峰面積積分值的RSD為0.79%，表明精密度良好。2.3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精確吸取供試品溶液10 μL，每隔3 h 進(jìn)樣1次，連續(xù)考察24 h，結(jié)果牡荊素鼠李糖苷面積的RSD為0.91%，表明牡荊素鼠李糖苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3討論

山楂葉的主要活性成分為黃酮類(lèi)化合物，代表成分有金絲桃苷、牡荊素鼠李糖苷。山楂葉及山楂葉提取物均收載于2010年版《中國(guó)藥典》一部，山楂葉含量測(cè)定項(xiàng)下測(cè)定總黃酮及金絲桃苷含量；山楂葉提取物含量測(cè)量項(xiàng)下測(cè)定總黃酮及牡荊素鼠李糖苷含量，筆者參考《中國(guó)藥典》，分別對(duì)不同采收時(shí)間的山楂葉中3種成分進(jìn)行了測(cè)定。

《中國(guó)藥典》規(guī)定山楂葉的采收季節(jié)為夏、秋兩季，對(duì)不同時(shí)間采收的山楂葉中總黃酮、金絲桃苷及牡荊素鼠李糖苷含量的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：5月采收的山楂葉中牡荊素鼠李糖苷的含量最高；8～11月采集的山楂葉中金絲桃苷及總黃酮的含量較高。山楂葉牡荊素鼠李糖苷的含量較高時(shí)宜在5月采收；山楂葉金絲桃苷的含量及總黃酮較高時(shí)宜在8～11月采收，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道稍有差別[9-10]，本實(shí)驗(yàn)提示，依據(jù)成分及臨床需要適時(shí)采收山楂葉較適宜。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(編號(hào)：2012X09103201-25)；國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào)：2013ZX09103002-022)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào)：20140311014YY)

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.007

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)04-0350-04

(收稿日期：2015-09-23)

Comparison of the active ingredient contents in hawthorn leaves samples of different harvests

WANG Zhaohua，ZHANG Dajun

(Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province，Changchun 130012，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the suitable time to harvest hawthorn leaves.MethodsHPLC was used and the conditions were as follows:Shim-pack C18(150 mm×4.6 mm，5 μm) column with the mobile phase consisted of acetonitrile-methanol-tetrahydrofuran -5 mL·L-1acetic acid(1∶1∶19.4∶78.6) in the separation of hyperin，and the detection wavelength was set at 363 nm. The separation of vitexin-2-O-rhamnoside was performed on the Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) column with the mobile phase consisted of tetrahydrofuran，acetonitrile， methanol， acetic acid and water(in a ratio of 38∶3∶3∶4∶152). The detection wavelength was set at 330 nm . The content of total flavone in hawthorn leaves was determined by spectrophotometry.To compare with the rutin reference substance，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH was used as the color development reagent. The detection wavelength was set at 500 nm. ResultsThe linear relationship between area and amount was noted for hyperin with the amount of 0.080 5-0.402 4 μg(r=0.999 3)； The linear relationship between area and amount was noted for vitexin-2-O-rhamnoside with the amount of 0.418-2.090 μg(r=0.999 1).ConclusionThe content of vitexin-2-O-rhamnoside in hawthorn leaves which were harvested in May was the highest；The contents of hyperin and total flavone in hawthorn leaves which were harvested from August to November were relatively high. Key words: hyperin；vitexin-2-O-rhamnoside; total flavone；hawthorn leaves；harvest； HPLC； spectrophotometry；content determination