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云南省恙蟲病與腎綜合征出血熱混合感染的診斷及分析

亞紅祥，張?jiān)浦?/p>

云南省地方病防治所/云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大理671000;

摘要：目的調(diào)查云南省不明原因發(fā)熱患者中是否存在恙蟲病與腎綜合征出血熱混合感染病例。方法采用間接免疫熒光法和膠體金法檢測不明原因發(fā)熱患者血清中的恙蟲病東方體(OT)抗體及腎綜合征出血熱(HFRS)病毒抗體，用巢式PCR擴(kuò)增患者血液中的OT 基因sta56片斷與漢坦病毒(HV)基因L片斷。結(jié)果79例患者中，實(shí)驗(yàn)室確診HFRS 5例、恙蟲病3例、HFRS與恙蟲病混合感染4例；巢式PCR檢測到HV L片斷核酸2例(DLR2和DLR6), 序列分析兩者間的同源性100%，DLR2與老撾漢城病毒L0199株核苷酸序列同源性最高為94.6%, 與中國漢城病毒L99株的同源性80.5%, 與云南漢坦病毒YN06-256的同源性69.8%。結(jié)論首次證實(shí)云南省存在恙蟲病與腎綜合征出血熱混合感染病例，其HFRS病原體遺傳進(jìn)化關(guān)系與老撾漢城病毒L0199株密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：恙蟲病；腎綜合征出血熱；不明原因發(fā)熱；混合感染；云南省

腎綜合征出血熱( Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)和恙蟲病(Scrub typhus，ST)分別由漢坦病毒(Hantavirus,HV) 和恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi,OT)感染引起的嚴(yán)重危害人類健康的自然疫源性疾病[1-2]。在早期臨床上兩病常常缺乏特異性，極易發(fā)生誤診，延誤治療可致多臟器受累，甚至死亡[3-6]。我國HFRS和恙蟲病疫區(qū)分布較為廣泛，病例數(shù)較多，疫情十分嚴(yán)重，目前已成為非常突出的公共健康問題[7-8]。恙蟲病是威脅旅游者健康的重要傳染病之一[9]，云南為我國旅游大省，又是恙蟲病流行的主要省份，近年來恙蟲病病例較多[8,10]，腎綜合征出血熱病例也時有發(fā)生[11-12]，然而恙蟲病與腎綜合征出血熱混合感染較為罕見?，F(xiàn)將恙蟲病與腎綜合征出血熱混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷及分析如下：

1材料與方法

1.1材料2010-2013年收集到云南省各醫(yī)療機(jī)構(gòu)送檢的不明原因發(fā)熱患者(起病急，持續(xù)發(fā)熱3天以上, 發(fā)病前3周內(nèi)有野外活動史)血液79份，分離血清用于抗體檢測和RNA提取，血塊用于核酸提取，并收集病例資料。

1.2方法

1.2.1間接免疫熒光試驗(yàn)(Indirect immunoinfluscent assay, IFA)用PBS從1∶16開始對患者血清作系列稀釋至1∶512，將各稀釋度血清分別加至OT(Karp型)抗原片(中國CDC傳染病所)和HFRS病毒(HV)抗原片(浙江省CDC)孔內(nèi)，放入濕盒37 ℃孵育45 min，用PBS洗片3次，每次1～2 min，吹干，加入熒光素標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(KPL公司)，放入濕盒37 ℃孵育30 min，用PBS洗片3次，每次1～2 min，吹干，用Nikon熒光顯微鏡觀察結(jié)果。分別以HV IgG效價(jià)≥32和OT IgG效價(jià)≥64作為陽性參考值。

1.2.2膠體金免疫試驗(yàn)(Colloidal gold immunoassay assay,CGIA)參照膠體金法腎綜合征出血熱病毒(HV)抗體診斷試劑盒(廈門市波生生物技術(shù)有限公司，批號：H12061901)和膠體金法恙蟲病東方體(OT)抗體檢測試劑盒(廈門市波生生物技術(shù)有限公司，批號：H12090304)說明書操作，分別進(jìn)行HV抗體IgG和IgM及OT抗體IgG和IgM檢測。

1.2.3巢式PCR (nPCR)檢測用基因組DNA提取試劑盒(百泰克公司)對患者血塊提取總DNA，應(yīng)用文獻(xiàn)[13]中的引物(上海生工公司合成)及條件對OTsta56基因進(jìn)行擴(kuò)增。用QIAamp viral RNA Mini kit(Qiagen公司)對患者血清提取總RNA，應(yīng)用文獻(xiàn)[14]中的引物(上海生工公司合成)對HV L片斷進(jìn)行擴(kuò)增，并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)，利用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA。PCR反應(yīng)總體積為25 μL, 應(yīng)用Promega公司GoTaqGreen Master Mix(2×)試劑盒在Biometra TProfessional PCR儀中進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，以無菌水為陰性對照，無陽性對照。第一次擴(kuò)增時取6 μL被檢標(biāo)本DNA或cDNA為模板，第二次擴(kuò)增時取第一次擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL作為模板。取二次PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測，DNA標(biāo)準(zhǔn)為DL2000。

1.2.4基因序列測定及分析PCR陽性產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行序列測定。將所得到的序列通過Internet網(wǎng)進(jìn)入美國國家生物技術(shù)信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)站點(diǎn)后，利用BLAST工具以及采用DNAstar中的MegAlign軟件對序列進(jìn)行同源性比較，運(yùn)用MEGA6.06軟件Neighbor-joinjing法(Bootstrap值設(shè)定為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果

2.1病例資料收集到病例79份資料，年齡在5～71歲，男∶女性別為41/38，其中農(nóng)民55例、學(xué)生10例、其他和職業(yè)不明的14例，2010年17例、2011年14例、2012年33例、2013年發(fā)病15例；均有發(fā)熱，體溫在38～41℃，多數(shù)呈弛張熱型，持續(xù)發(fā)熱4～26 d，伴有畏寒、寒戰(zhàn)、咳嗽、咳痰、全身酸痛、乏力、食欲減退、腰痛、結(jié)膜充血、尿少、肝脾腫大、皮疹、焦痂或潰瘍等；病前1～3周到過田間勞作或野外活動，一些居住區(qū)可見老鼠活動。

2.2IFA檢測對79例患者血清進(jìn)行HV IgG抗體檢測，結(jié)果抗體效價(jià)≥1∶32的有12例，陽性率15.19%。對HV IgG抗體效價(jià)≥1∶16的18例患者血清進(jìn)行OT IgG抗體檢測，結(jié)果有10例抗體效價(jià)≥1∶64(陽性率58.82%)。同時檢測到HV和OT IgG抗體的有4例(表1，2)。

2.3膠體金法檢測對HV IgG抗體效價(jià)≥1∶16的18例患者血清分別進(jìn)行HV 抗體IgG和IgM及OT抗體IgG和IgM檢測，結(jié)果HV抗體陽性11例(僅IgG陽性2例、僅IgM陽性3例、兩種抗體均陽性6例)，OT抗體陽性10例(僅IgG陽性3例、僅IgM陽性1例、兩種抗體均陽性6例)(表1)。同時檢測到HV和OT IgM抗體的有4例(表2)。

2.4nPCR檢測及序列分析對IFA檢測到HV IgG抗體效價(jià)≥1∶16的18例患者標(biāo)本分別進(jìn)行nPCR OT 基因sta56片斷和HV 基因L片斷檢測，結(jié)果有2例擴(kuò)增到約390 bp大小的L基因目的片斷(圖1)，OT 基因sta56片斷擴(kuò)增均為陰性。

根據(jù)漢坦病毒L基因部分序列應(yīng)用MegAlign軟件將測序獲得的樣本序列(353 bp)與GenBank中的已知的漢坦病毒L基因部分核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果序列DLR2與DLR6的同源性100%，DLR2(基金序列注冊號：KF977219)與老撾漢城病毒L0199株的同源性最高，為94.6%；與漢城病毒Humber株的同源性82.2%, 與中國漢城病毒L99株的同源性80.5%, 與云南漢坦病毒YN06-256的同源性69.8%。

表1　IFA與CGIA 檢測HV和OT抗體結(jié)果

Note: a, CGIA -positivefor IgG or IgM, and IgG and IgM; b, Calculated as (No.of CGIA-positive for HV / no.of IFA-positive for HV)×100 or (No.of CGIA-positive for OT / no.of IFA-positive for OT)×100.

表2HV和OT抗體檢測同時陽性結(jié)果

Tab.2Antibody of HV and OT positive concurrently between IFA and CGIA

No.patientsIFAtitersHVIgGOTIgGCGIAdetectionHVIgMOTIgMDLR11∶1281∶512PositivePositiveDLR21∶2561∶512PositivePositiveDLR131∶321∶128PositivePositiveDLR141∶641∶64PositivePositive

2.5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹將DLR2核苷酸序列(353 bp)與GenBank中的已知的漢坦病毒L基因部分核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示DLR2病

Note: M: DL2000 DNA Marker; 1: DLR1; 2: DLR2; 3: DLR3; 4: DLR4; 5: DLR5; 6: DL6; 7: DLR7; 8: DLR8; 9: DLR9.

圖1nPCR擴(kuò)增HV基因L片斷部分結(jié)果

Fig.1Partial result of nPCR detection by HV L segment specific primers

毒與老撾漢城病毒L0199株在同一分支上，親緣關(guān)系最近, 與中國漢城病毒L99株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與云南漢坦病毒YN06-256的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)(圖2)。

圖2　根據(jù)HV L基因部分序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.6病例診斷IFA和CGIA兩種方法檢測HV抗體結(jié)果中相符的有11例，符合率91.67%；檢測OT抗體結(jié)果中相符的有10例，符合率100%(表1)。根據(jù)《恙蟲病預(yù)防控制技術(shù)指南》(2009年中控疾發(fā)1號文件)和《流行性出血熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》(ws278-2008)，結(jié)合患者病例資料和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果進(jìn)行綜合分析，臨床病例HFRS 2例、恙蟲病3例，實(shí)驗(yàn)室確診病例HFRS 5例、恙蟲病3例、HFRS和恙蟲病混合感染病例4例(表3)。

3討論

云南省地處中國西南邊陲, 位于東經(jīng)97°31′39″-106°11′47″和北緯21°8′32″-29°15′18″，屬高原地形, 海拔在76.4～6740 m, 以熱帶和亞熱帶氣候?yàn)橹?，年降雨量均? 000 mm以上。該省與恙蟲病高發(fā)的緬甸、老撾、越南接壤，地理和自然環(huán)境復(fù)雜多樣，存在恙蟲病、HFRS等多種自然疫源性疾病[12,15]。該省恙蟲病和HFRS分布較為廣泛，許多地區(qū)同時存在恙蟲病和HFRS流行區(qū)，家鼠為恙蟲病和HFRS的主要傳染源和宿主動物，兩病均可經(jīng)恙螨傳播，恙蟲病的流行高峰為5～11月，這也正與當(dāng)?shù)豀FRS的流行高峰期一致[12,16]，致使兩者共同感染同一機(jī)體成為可能。近年來云南恙蟲病病例增多，局部地區(qū)時有恙蟲病暴發(fā)疫情發(fā)生[17-18]，HFRS疫區(qū)范圍不斷擴(kuò)大，發(fā)病數(shù)也明顯上升，恙蟲病和HFRS患者時有被誤診[19-20]，通常需要借助實(shí)驗(yàn)室檢測手段才能對它們進(jìn)行診斷與鑒別。

表3　實(shí)驗(yàn)室確診病例資料

本次研究應(yīng)用膠體金和IFA方法對患者血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，結(jié)合患者臨床發(fā)病情況和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果進(jìn)行綜合分析，實(shí)驗(yàn)室確診HFRS患者5例、恙蟲病患者3例、HFRS和恙蟲病混合感染患者4例，這是首次證實(shí)云南地區(qū)存在恙蟲病與HFRS混合感染病例。在臨床上恙蟲病和HFRS常常表現(xiàn)不典型，易與其它發(fā)熱性疾病相混淆[19-20]。兩病具有一些相同的臨床表現(xiàn)，如發(fā)熱，頭痛，肌肉酸痛，結(jié)膜充血等，致使兩者難以區(qū)分[4-5,21]。若恙蟲病與HFRS混合感染于同一患者，更加增添了臨床醫(yī)生對病人的診斷難度，同時也可能加大對患者機(jī)體的損害程度，應(yīng)引起醫(yī)務(wù)工作者的高度重視。

云南素有動植物王國之稱，宿主動物和媒介種類繁多，鼠類異常豐富，以往已證實(shí)鼠中存在HV和OT[16,22-23 ]，人們深受恙蟲病和HFRS的危害[12,16]。該省主要存在以褐家鼠和黃胸鼠為主要宿主動物的家鼠型HFRS疫源地[16]，其HFRS病原體為漢城型病毒。本次檢測發(fā)現(xiàn)云南省大理患者感染的HFRS病毒DLR2株與老撾黃胸鼠中漢城病毒L0199株的同源性最高為94.6%，而與中國L99株和云南YN06-256株的同源性分別為80.5%和69.8%，提示DLR2株可能為漢城病毒的一個新的亞種。本次流行的HFRS病毒與老撾黃胸鼠中的漢城病毒L0199株親緣關(guān)系較近, 提示本次流行的病毒很有可能與東南亞國家老撾漢城病毒的傳入有關(guān)。以往已證實(shí)云南黃胸鼠中存在漢坦病毒，該省黃胸鼠數(shù)量龐大，人們隨時都有機(jī)會與黃胸鼠發(fā)生直接或間接接觸，然而本次發(fā)生的HFRS患者是否由當(dāng)?shù)厮拗鲃游稂S胸鼠傳播所致，還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。本次發(fā)現(xiàn)具有重要的流行病學(xué)意義，為今后HFRS疫源地深入調(diào)查及宿主動物與疾病關(guān)系的研究提供科學(xué)線索。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.011

中圖分類號：R376

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0266-05

收稿日期：2015-05-15；修回日期:2015-08-01

Cases with coinfected hemorrhagic fever with renal syndrome and scrub typhus in Yunnan, China

YA Hong-xiang,ZHANG Yun-zhi

(YunnanInstituteofEndemicdiseasesControlandPrevention/YunnanCenterofVirusandRickettsiaResearch/YunnanKeyLaboratoryofNaturalFocusDisease,Dali671000,China)

Abstract:We identified the pathogen of patients with fever with unknown origin and determine whether they were coinfected cases with scrub typhus (ST) and hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Yunnan, China. Seventy-nine blood samples from patients with fever of unknown origin were collected and sera were tested for antibody of OT and HV with indirect immunoinfluscent assay (IFA) and colloidal gold immunoassay assay(CGIA), respectively. OT sta56 gene and HV L gene in blood of patients were examined by nested PCR (nPCR), and sequenced and analyzed the homology with other known sequences. The 5 out of 79 patients were HFRS cases, 3 were scrub typhus cases, and 4 were coinfected cases with scrub typhus and HFRS. HV gene L fragments were amplified successfully by nPCR in 2 cases (DLR2 and DLR6); the homology was 100% through comparing their L gene sequence. DLR2 shared highest homology (reach up to 94.6%) with Seoul virus L0199 strains from Laos, while the homology of DLR2 compared with Seoul virus L99 strains from China and HV YN06-256 strains from Yunnan of China was only up to 80.5% and 69.8%, respectively. It was the first evidence that there were coinfected cases with scrub typhus in Yunnan, and the HFRS pathogen is closely related to Laos Seoul virus L0199 strains in genetic evolution relationship.

Keywords:Scrub typhus; hemorrhagic fever with renal syndrome; fever with unknown origin; coinfection; Yunnan Province

Email: yahongxiang@163.com