葉　寧，王晶晶，朱明利，劉壽榮

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不同PCR引物檢測(cè)膽囊結(jié)石中納米細(xì)菌效果的研究

葉寧1,2，王晶晶1,2，朱明利2，劉壽榮2

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州310053；;2.杭州市西溪醫(yī)院，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州西溪醫(yī)院，杭州310023

摘要：目的評(píng)價(jià)不同PCR引物檢測(cè)膽囊結(jié)石患者膽汁和結(jié)石中納米細(xì)菌(NB)的臨床價(jià)值。方法對(duì)30例結(jié)石標(biāo)本、43例膽汁標(biāo)本采用間接免疫熒光染色、透射電鏡掃描和PCR檢測(cè)標(biāo)本中的NB。結(jié)果PCR引物1、2檢測(cè)NB陽(yáng)性率分別為56.1%和86.4%，培養(yǎng)物間接免疫熒光染色(CIIFS)陽(yáng)性率為54.5%，對(duì)比評(píng)價(jià)表明引物1特異性更高，與CIIFS結(jié)果一致率高，兩者陽(yáng)性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P > 0. 05)，引物1檢測(cè)NB的敏感性為75.0%，特異性為66.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值為73.0%，陰性預(yù)測(cè)價(jià)值為69.0%。引物1未培養(yǎng)組陽(yáng)性率為29.6%，培養(yǎng)組陽(yáng)性率為50%，兩者陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，培養(yǎng)后可明顯提高NB的檢出率。引物1結(jié)石組陽(yáng)性率為46.7%，膽汁組陽(yáng)性率為63.9%，兩者陽(yáng)性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)CR引物1檢測(cè)膽囊結(jié)石患者NB結(jié)果與CIIFS有較高的一致性，培養(yǎng)后可明顯提高NB的檢出率，為NB相關(guān)疾病的檢測(cè)提供了一種快速、可靠的方法，具有重要的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：納米細(xì)菌；膽囊結(jié)石；聚合酶鏈反應(yīng)

納米細(xì)菌(nanobacteria,NB)是由芬蘭科學(xué)家Kajander等發(fā)現(xiàn)的直徑為50～500 nm的微小細(xì)菌，具有獨(dú)特的生物礦化作用，能在菌體周圍產(chǎn)生堅(jiān)硬的礦化外殼?，F(xiàn)已知NB能感染牛、人類及其它哺乳動(dòng)物，引起人獸共患病。研究表明NB具有細(xì)胞毒性，可以產(chǎn)生細(xì)胞毒素、細(xì)胞因子等參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)，是人類諸如膽囊結(jié)石、肝硬化、牙結(jié)石、胎盤鈣化等鈣化性疾病的病因。NB對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，不能在一般培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，可在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，但其增殖非常緩慢，培養(yǎng)周期長(zhǎng)達(dá)數(shù)周。由于NB特殊的生物學(xué)性狀，其鑒定一般采用免疫熒光、免疫組化聯(lián)合透射電鏡、鈣染色等多種方法。據(jù)我們[1]以及其他學(xué)者研究[2-5]發(fā)現(xiàn)PCR用于檢測(cè)NB具有快速、簡(jiǎn)便、成本低的特點(diǎn)。為此，我們擬在免疫熒光、透射電鏡等結(jié)果的基礎(chǔ)上，同時(shí)采用兩套PCR引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增和結(jié)果對(duì)比，以研究PCR檢測(cè)膽囊結(jié)石患者NB的臨床價(jià)值。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象取杭州市西溪醫(yī)院2013年10月至2014年12月手術(shù)中獲得的膽結(jié)石標(biāo)本30份，患者年齡22～84歲，男12例，女18例。無菌術(shù)中抽取或術(shù)后T管引流膽汁標(biāo)本43份，患者年齡22～76歲，男21例，女22例，其中膽囊結(jié)石患者36例，非膽囊結(jié)石患者7例(4例為膽囊癌，1例為膽囊息肉，2例為膽囊結(jié)石術(shù)后T管引流(6個(gè)月以上，B超證實(shí)無復(fù)發(fā))。

1.2主要儀器與試劑浙江大學(xué)分析測(cè)試中心Hitachi H-7650型透射電鏡，SLAN-96P Real-time system型PCR儀，Bio-Rad Sub-cell GT system型電泳儀，Thermo CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Bio-Rad GelDoc XR型凝膠成像系統(tǒng)，OLYMPUS BX51型顯微鏡。

RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(γ-FBS)為Sigma公司產(chǎn)品，Sheep anti-mouse IgG-FITC為Boster公司產(chǎn)品，Mouse anti-nanobacteria mAb 8D10及陽(yáng)性質(zhì)控玻片購(gòu)于芬蘭Nanobac Oy公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒為杭州博日公司產(chǎn)品，Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)和100 bp DNA Ladder Marker為TAKARA公司產(chǎn)品，Millipore Millex-GP針頭濾器為Millipore公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1NB的培養(yǎng)無菌收集膽汁1 mL用生理鹽水稀釋5倍，術(shù)中無菌收集膽結(jié)石200 mg研磨后，鹽酸脫礦，NaOH中和后生理鹽水稀釋10倍。10 000xg，4 ℃離心40 min，取管底2 mL混勻依次經(jīng)0.45 μm、0.22 μm濾器過濾；加入2倍體積含10%γ-FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4周。以RPMI 1640培養(yǎng)基、含10%γ-FBS的RPMI1640培養(yǎng)基、生理鹽水加RPMI1640培養(yǎng)基作陰性對(duì)照。

1.3.2NB的鑒定

1.3.2.1透射電鏡檢查(TEM)PBS離心洗滌后2.5%戊二醛4℃固定24 h；PBS洗滌后1%的鋨酸溶液固定1-2 h。PBS洗滌后濃度梯度乙醇各處理15 min，100%乙醇處理20 min，純丙酮處理20 min，包埋，切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染5～10 min，透射電鏡觀察。

1.3.2.2培養(yǎng)物間接免疫熒光染色(CIIFS)涂片70 ℃干烤10 min，用含10%FBS的PBS封閉40 min。一抗37 ℃孵育60 min，PBS洗滌后二抗室溫孵育40 min。PBS洗滌后用雙蒸水洗滌，晾干。50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2.3PCR測(cè)定DNA提取嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。引物1：上游：GGAGGAACACCAG

TGGCGAAGG，下游：GCCCGTAAGGCAATGAGGAC。引物2：上游：CGGCAGACGGGTGAGTAA，下游：GGCTGCTGGCACGAAGTT。由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。引物1、2擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為511 bp、386 bp。25 μL反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μL，引物0. 2 μmoL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，取5 μL于2%瓊脂糖凝膠電泳，GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α= 0.05。

2結(jié)果

2.1NB的形態(tài)學(xué)觀察和體外培養(yǎng)鑒定結(jié)石和膽汁經(jīng)體外培養(yǎng)3～4周后，大部分標(biāo)本管底肉眼可見白色沉淀聚集，陰性對(duì)照未見生長(zhǎng)，透射電鏡觀察NB大小約100 nm～500 nm，呈球狀或桿狀，菌體外周可見大量礦化物，呈毛刺狀，表面可見附著大量針狀結(jié)晶(見圖1)。

圖1　透射電鏡負(fù)染法(120 000×)

2.2兩對(duì)PCR引物和CIIFS的檢測(cè)結(jié)果比較CIIFS檢測(cè)中，NB陽(yáng)性者在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，呈散點(diǎn)狀或聚集成簇狀，而PBS陰性對(duì)照則未見綠色熒光。

采用引物1、引物2對(duì)膽囊結(jié)石患者培養(yǎng)前后的標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物1、2擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為511 bp、386 bp，結(jié)果如圖2、圖3所示，陰性對(duì)照組均未檢出NB。

M: 100 bp DNA marker; 1-5: NB; N: Negative control.

M: 100 bp DNA marker; 1-8: NB;N: Negative control.

引物1和CIIFS結(jié)果對(duì)比：引物1陽(yáng)性率56.1%，CIIFS陽(yáng)性率54.5%。36例CIIFS陽(yáng)性標(biāo)本中PCR陽(yáng)性有27例(75.0%)，30例CIIFS陰性標(biāo)本中PCR陰性有20例(66.7%)。與CIIFS法相比，PCR引物1檢測(cè)NB的敏感性為75.0%，特異性為66.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值為73.0%，陰性預(yù)測(cè)價(jià)值為69.0%。優(yōu)勢(shì)性檢驗(yàn)：P=1.000，P>0.05，尚不能認(rèn)為引物1陽(yáng)性率高于CIIFS的陽(yáng)性率。一致性kappa=0.418，P=0.001，CIIFS與引物1結(jié)果一致性中等。

引物2和CIIFS結(jié)果對(duì)比：引物2陽(yáng)性率86.4%，CIIFS陽(yáng)性率54.5%。36例CIIFS陽(yáng)性標(biāo)本中PCR陽(yáng)性有35例(97.2%)，30例CIIFS陰性標(biāo)本中PCR陰性有8例(26.7%)。與CIIFS法相比，PCR引物2檢測(cè)NB的敏感性為97.2%，特異性為26.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值為61.4%，陰性預(yù)測(cè)價(jià)值為88.9%。一致性kappa=0.254，P=0.005，CIIFS與引物2結(jié)果一致性尚可。

2.3NB培養(yǎng)前后引物1 PCR系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果比較

采用引物1檢測(cè)膽囊結(jié)石患者培養(yǎng)前后標(biāo)本，未培養(yǎng)組陽(yáng)性率為29.6%，培養(yǎng)組陽(yáng)性率為50%，χ2=5.101，P=0.024，說明培養(yǎng)后可明顯提高NB的陽(yáng)性率。

2.4膽汁與結(jié)石引物1 PCR結(jié)果比較采用引物1檢測(cè)了膽囊結(jié)石患者結(jié)石、膽汁標(biāo)本，結(jié)石組陽(yáng)性率為46.7%，膽汁組陽(yáng)性率為63.9% ，χ2=1.970，P=0.160，引物1結(jié)石、膽汁NB陽(yáng)性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3討論

自Kajander等1990年發(fā)現(xiàn)NB以來，許多學(xué)者對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)NB感染可能是膽囊結(jié)石的病因。例如Wang L等[6]將NB注射入動(dòng)物膽囊可誘導(dǎo)產(chǎn)生結(jié)石；劉亞楠等[7]將膽汁中培養(yǎng)出的NB感染日本大耳白兔，在短期內(nèi)即形成膽囊結(jié)石，被感染的兔子膽汁培養(yǎng)出的NB能再次感染大耳白兔并致膽結(jié)石形成，與Wang L等人的研究一致。我們?cè)隗w外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)NB，培養(yǎng)管底部有肉眼可見白色沉淀物生長(zhǎng)，這與我們[8]以及其他研究結(jié)果[9-11]相符。

NB生長(zhǎng)緩慢，無典型的形態(tài)學(xué)特征，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法難以檢測(cè)。一般認(rèn)為NB可采用免疫熒光、免疫組化、TEM、PCR、鈣染色等方法檢測(cè)[12]，但免疫學(xué)以及TEM等方法繁瑣且復(fù)雜[4]。早期研究中，Kajander等[13]證明 NB存在DNA，并在GenBank中提交了注冊(cè)號(hào)為X98418和X98419的16S rRNA序列。16S rRNA基因序列的分析早已被成功地用于NB的檢測(cè)[13-14]。Lu H等[10-11]和Guo Y 等[15]對(duì)胎盤鈣化組織進(jìn)行分離、培養(yǎng)，通過TEM和16S rRNA序列分析確認(rèn)培養(yǎng)產(chǎn)物中NB的存在，認(rèn)為胎盤鈣化與NB感染有關(guān)。Zhang QH等[3]對(duì)睪丸結(jié)石分離產(chǎn)物進(jìn)行CIIFS、TEM和16s rRNA序列分析，確認(rèn)其中NB的存在，認(rèn)為睪丸結(jié)石與NB感染有關(guān)。Zheng J等[5]對(duì)150例Ⅲ型前列腺炎患者的前列腺液分別進(jìn)行PCR和CIIFS檢測(cè)，PCR陽(yáng)性率為57.3%，CIIFS陽(yáng)性率為55.3%，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，敏感性相當(dāng)，因此認(rèn)為PCR可作為一種檢測(cè)NB的快速、可靠的方法。KIM TH[4]等人也得到類似結(jié)論，說明PCR檢測(cè)NB是可行的。使用PCR檢測(cè)NB，克服了NB培養(yǎng)周期長(zhǎng)、鑒定成本高的缺點(diǎn)。

我們依據(jù)X98419基因序列，自行設(shè)計(jì)引物1和引物2，初步研究中發(fā)現(xiàn)它們都具有良好的特異性。小鼠抗NB單克隆抗體8D10是目前公認(rèn)的NB特異性抗體，主要用于NB的鑒定[3,5,16-18]。限于NB的特殊性，CIIFS是已知的NB鑒定方法中較為可信的方法。因此在本研究中，使用引物1和引物2分別檢測(cè)膽囊結(jié)石患者結(jié)石或膽汁中的NB，將擴(kuò)增結(jié)果與CIIFS結(jié)果進(jìn)行比較。比較顯示引物1的檢測(cè)結(jié)果與CIIFS結(jié)果更加符合，這與我們以往對(duì)肝病患者血液中NB的研究結(jié)果相似[1,8]。使用引物1進(jìn)行進(jìn)一步對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，相同標(biāo)本培養(yǎng)前后分別進(jìn)行PCR檢測(cè)，培養(yǎng)前陽(yáng)性率為29.6%，培養(yǎng)后陽(yáng)性率為50%，培養(yǎng)可明顯提高NB的檢出率(P<0.05)，這可能與結(jié)石、膽汁標(biāo)本培養(yǎng)后NB的量增多有關(guān)。因此使用引物1進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)膽囊結(jié)石患者NB感染具有重參考價(jià)值，可作為膽囊結(jié)石患者NB感染的快速檢測(cè)方法。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.015

通訊作者：朱明利，Email:mlzhhz@163.com

Corresponding author:Zhu Ming-li, Email: mlzhhz@163.com

中圖分類號(hào)：R378

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)02-0173-04

收稿日期：2015-07-02；修回日期:2015-10-16

Value of different PCR primers for detecting nanobacteria in gallstone

YE Ning1,2,WANG Jing-jing1,2,ZHU Ming-li2,LIU Shou-rong2

(1.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;2.HangzhouXixiHospital,Hangzhou310023,China)

Abstract:We investigated the infection status of nanobacteria on patients of gallstone, and evaluated the clinical value of PCR by different primers. The nanobacteria from 30 cases of stone specimens and 43 cases of bile samples were detected by culture and subsequent indirect immunofluorescence staining(CIIFS), transmission electron microscopy(TEM) and polymerase chain reaction(PCR). Results showed that the positive rates of primers 1, 2 and culture and subsequent indirect immunofluorescence staining were 56.1%, 86.4% and 54.5% respectively. PCR analysis of primers 1 had a higher specificity for the detection of NB in patients with gallstone, and a high consistency with the results of CIIFS. There was no statistically significant difference (P>0.05) between primers 1 and CIIFS. The sensitivity of PCR for the detection of NB compared with the CIIFS method was 75.0%, with a specificity of 66.7%. The positive predictive value was 73.0%, and the negative predictive value was 69.0%. Primer 1 positive rate in the original group and the culture group were 29.6% and 50% respectively (P<0.05), after the culture can significantly improve the detection rate of nanobacteria. Primer 1’s positive rate in the gallstone group and the bile group were 46.7% and 63.9% respectively (P>0.05). Detection of nanobacterial infection by primer 1 of PCR in gallstone has a high consistency with CIIFS and offers significant advantages for the rapid and reliable detection of nanobacterial infection in gallstone.

Keywords:nanobacteria; gallstone; polymerase chain reaction

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