沈　潔，劉　月，劉利強(qiáng)，劉　娜，劉建釵，劉彥威，邢　鑫

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兔須癬毛癬菌感染樣本常規(guī)診斷與定量PCR診斷的比較研究

沈潔，劉月，劉利強(qiáng)，劉娜，劉建釵，劉彥威，邢鑫

河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，邯鄲動(dòng)物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北056021

摘要：目的為探討須癬毛癬菌快速、敏感、特異的診斷方法。方法采集患兔臨床樣本63例，分別進(jìn)行培養(yǎng)法、鏡檢法和定量PCR法診斷，比較這些方法的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。結(jié)果顯示樣本培養(yǎng)法、鏡檢法和定量PCR法的陽(yáng)性率分別為65%、73%和86%；與常規(guī)方法(培養(yǎng)法和鏡檢法)相比，定量PCR法敏感性和陰性預(yù)測(cè)值均為100%，高于培養(yǎng)法(77.35%和45.45%)和鏡檢法(86.79%和64.17%)，而特異性(90.90%對(duì)100%～100%)和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(90.90%對(duì)100%～100%)兩種方法無(wú)明顯差異。結(jié)論培養(yǎng)法特異，但敏感性差、耗時(shí)長(zhǎng)，有假陰性；鏡檢快速，但不特異，敏感性低；而定量PCR快速、敏感、又特異，可以替代鏡檢用于臨床樣品的診斷，但不能替代培養(yǎng)法。

關(guān)鍵詞：定量PCR；常規(guī)診斷；兔、須癬毛癬菌

須癬毛癬菌是兔的常見(jiàn)皮膚真菌病的病原，不僅引起兔的皮膚及附屬物感染，還能通過(guò)兔傳染人，引起人的皮膚感染，因此，有效防控須癬毛癬菌感染，無(wú)論對(duì)促進(jìn)養(yǎng)兔業(yè)健康發(fā)展，還是在公共衛(wèi)生等方面都具有重要意義[1-2]。目前，對(duì)須癬毛癬菌病診斷基于病料的直接顯微觀察和病原真菌分離培養(yǎng)，盡管這些方法沿用了80余年，仍然存在多局限，如直接顯微觀察缺乏特異性，不能區(qū)分病原真菌的種類；分離培養(yǎng)及后續(xù)的鑒定較慢，通常需要2～4周[2]。大量臨床資料和經(jīng)驗(yàn)表明，須癬毛癬菌感染的療效與轉(zhuǎn)歸，很大程度上取決于早期診斷和治療[3]。然而，目前臨床上皮膚真菌感染的診斷面臨著巨大的困難和挑戰(zhàn)，很大程度上制約了早期診斷和治療，延誤了最佳治療時(shí)機(jī)，因此，發(fā)展敏感、特異、快速的診斷方法已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。基于此2013年本實(shí)驗(yàn)室建立了兔須癬毛癬菌巢式PCR方法，雖然巢式PCR比常規(guī)PCR敏感，但巢式PCR需進(jìn)行兩次PCR較繁瑣，且還需電泳進(jìn)行驗(yàn)證，易污染[1]。針對(duì)巢式PCR的局限，2015年又建立了須癬毛癬菌敏感、特異、快速定量PCR方法，并與直接顯微觀察和分離培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，以期望找出更適合臨床快速診斷的方法。

1材料與方法

1.1病料樣品采集和常規(guī)診斷在2014年6月到10月，疑似皮膚真菌感染兔主要表現(xiàn)皮屑增多、結(jié)痂、脫毛、滲出、毛囊炎及癢感等癥狀。共收集來(lái)自不同兔場(chǎng)的病料樣品(皮屑和被毛)63份(編號(hào)S1-S63)，沒(méi)有皮膚病變健康兔的皮屑和被毛10份作對(duì)照。病料采集時(shí)，用無(wú)菌手術(shù)刀片在病變與健康皮膚組織交界處刮取皮屑或被毛，每份病料樣和對(duì)照樣品分成3份，分別用于直接鏡檢、培養(yǎng)及定量PCR分析，其中用于定量PCR的病料-20 ℃保存。

鏡檢：取患兔的病料(皮屑和被毛)于載玻片，滴加改良復(fù)方KOH溶液，直接涂片。加蓋玻片，酒精燈加熱以促進(jìn)角質(zhì)溶解，但避免過(guò)度加熱而使封固液沸騰，輕壓蓋玻片驅(qū)除氣泡，吸除蓋玻片周?chē)缫海胖?0 min，使之軟化透明后，置光學(xué)顯微鏡下觀察。以查到菌絲和(或)孢子為陽(yáng)性，未檢出菌絲和(或)孢子為陰性。

培養(yǎng)：病料涂布在沙保弱培養(yǎng)基(含0.05 g/L氯霉素和0.5 g/L環(huán)己酰亞胺)，27 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，每天觀察菌落生長(zhǎng)情況。純化培養(yǎng)用土豆瓊脂培養(yǎng)基，27 ℃，培養(yǎng)1周，觀察菌落特征。用膠帶黏的一面按在生長(zhǎng)的菌落上，乳酸酚棉藍(lán)染色，在顯微鏡下觀察菌絲和孢子結(jié)構(gòu)。

1.2定量PCR方法

DNA提?。簩⒉×霞羲?，放入液氮研磨，收集病料約0.05～0.1 g于1.5 mLEP管中，用真菌DNA提取試劑盒(Solarbio試劑盒)提取基因組DNA。

引物設(shè)計(jì)： 從GenBank找出與須癬毛癬菌及相關(guān)種類(包括犬小孢子菌、絮狀表皮癬、紅毛癬菌、白色念珠菌、煙曲霉)ITS基因。進(jìn)行聚類分析，采用Primer Express2.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游引物為(5′-GCAAAGAAG CCT GGAAGAAG-3′，核苷酸46-65)，下游引物為(5′-GGAGACCATCTGTGAGAGTT-3，核苷酸166-185)預(yù)期擴(kuò)增片段大小140 bp。引物由華大基因合成。

定量PCR：采用25 μL的反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，用雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性60 s；94 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，作熔解曲線，采用軟件自動(dòng)分析。

1.3ITS序列分析對(duì)于定量PCR與常規(guī)診斷不一致的樣品，再進(jìn)行ITS序列分析，經(jīng)過(guò)直接顯微檢查、培養(yǎng)和定量PCR比較，最終確定樣品陽(yáng)性與陰性。

DNA提?。夯纪貌杉×蠘悠芳羲?，放入200 μL緩沖液(10 mmol/L Tris-HCIpH8.0，10 mmol/L Na2-EDTA，100 mmol/L NaCl，2%十二烷基硫酸鈉)56 ℃過(guò)夜，加10 μL蛋白酶K孵育3 h。步驟按試劑盒(Solarbio試劑盒)方法進(jìn)行。

第一輪PCR：上游引物為5′-CATCGAGTACATGTGCTCGC-3′，下游引物5′-CATCGA GTA CATGTGCT GC-3′，目的片段為435 bp。反應(yīng)體系25 μL：Mix(2×)12.5 μL，引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，加雙蒸水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性3 min，94 ℃變性60 s，60 ℃退化75 s，72 ℃延伸120 s，共30循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃終止反應(yīng)。

巢式PCR：上游引物為5′-GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3′，下游引物5′-GGAGACCA TCT GTGAGAG TTG-3′，目的基因片段為288 bp。反應(yīng)體系25 μL：Mix(2×)12.5 μL，引物各0.5 μL，模板DNA(第1輪PCR產(chǎn)物1∶6稀釋)1.0 μL，加雙蒸水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件條件同第1輪PCR。取5 μL巢式PCR產(chǎn)物在0.5 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)處理采用SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件包，采用方差統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1常規(guī)檢查在顯微鏡下，觀察到呈串珠狀的菌絲段(圖1)者為陽(yáng)性，檢出陽(yáng)性率為73%(46/63)培養(yǎng)基上兔須癬毛癬菌菌落為顆粒型，正面為淺黃色，背面為褐色，在顯微鏡下，小分生孢子為葡萄狀，數(shù)量較多，大分生孢子為棒狀，數(shù)量較少，同時(shí)還有特征性的螺旋菌絲和破梳子狀菌絲(圖2)，陽(yáng)性率為65%(41/63)。

圖1　皮屑中菌絲段(10×40)

圖2 　養(yǎng)的菌絲和孢子(10×40)

2.2定量PCR檢查定量PCR檢測(cè)，呈“S”型擴(kuò)增曲線，Ct值≤36.5，且Tm值介于為86.5 ℃～90.0 ℃之間時(shí)，說(shuō)明樣本含有須癬毛癬菌，陽(yáng)性率為86%(54/63)，10份對(duì)照樣本為陰性。

2.3鏡檢與定量PCR檢查比較在檢測(cè)63份樣本中，分離培養(yǎng)、鏡檢和定量PCR陽(yáng)性結(jié)果是一致的。在12例樣本檢查結(jié)果不一致：S12、S14、S16、S23、S33鏡檢陽(yáng)性、S13、S15、S26、S31、S48、S52ITS序列分析陽(yáng)性，最終結(jié)論均為陽(yáng)性。 S4鏡檢和ITS序列分析均陰性，最終結(jié)論亦然。

圖3　定量PCR熔解曲線

圖4　定量PCR擴(kuò)增曲線

2.4常規(guī)診斷與定量PCR方法性能比較培養(yǎng)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為77.35%、100%、100% 和45.45%，鏡檢的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為86.79%、100%、100%和64.17%，定量PCR的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為100%、90.9%、98.1%和100%(見(jiàn)表1)。與培養(yǎng)和鏡檢相比，定量PCR的敏感性(P<0.05)和陰性預(yù)測(cè)值(P<0.01)最高，而特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與培養(yǎng)和鏡檢沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。

表1　常規(guī)診斷與定量PCR方法性能比較

*:**P<0.05; #:##P<0.01.

3討論

3.1培養(yǎng)診斷方法及影響因素須癬毛癬菌分離培養(yǎng)常選用沙保弱培養(yǎng)基，純化用土豆培養(yǎng)基，根據(jù)菌落形態(tài)和菌絲及孢子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行診斷，有時(shí)也配合生理試驗(yàn)(如尿素酶和毛發(fā)穿孔試驗(yàn))[4]。本試驗(yàn)從患兔病料分離的皮膚真菌，其菌落主要為顆粒型，有特征性螺旋和梳狀菌絲，小分生孢子為圓形數(shù)量多，大分生孢子為棒狀數(shù)量較少，這些完全符合親動(dòng)物須癬毛癬菌形態(tài)特征，即診斷為兔須癬毛癬菌。該菌生長(zhǎng)緩慢，從分離培養(yǎng)、純化到觀察到特征形態(tài)變化，一般需要1～2周，即用培養(yǎng)診斷需要1～2周。文獻(xiàn)報(bào)道時(shí)間長(zhǎng)短不同，短則1周，長(zhǎng)則4周[4-7]。用培養(yǎng)診斷方法，對(duì)臨床樣品檢查陽(yáng)性率報(bào)道不一致，一般為25%～80%。本試驗(yàn)陽(yáng)性率為65%。造成陽(yáng)性率差異原因有多種，首先病料中有20%為死菌絲，無(wú)法培養(yǎng)[7]，特別是使用抗真菌藥治療病例，會(huì)造成菌絲死亡。我們發(fā)現(xiàn)5例樣品經(jīng)過(guò)藥物治療，鏡檢為陽(yáng)性，而培養(yǎng)均為陰性。其次非皮膚真菌混合感染，由于非皮膚真菌生長(zhǎng)快，破壞皮膚真菌生長(zhǎng)[8]。另外，有實(shí)驗(yàn)證明念珠菌抑制皮膚真菌生長(zhǎng)，致使皮膚真菌分離率降低[9]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與鏡檢和定量PCR相比，培養(yǎng)方法特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值沒(méi)有明顯差異，敏感性最低(77.35%)，有17.5%(11/63)假陽(yáng)性。雖然培養(yǎng)診斷方法耗時(shí)長(zhǎng)，敏感性差，但因培養(yǎng)方法可檢測(cè)可培養(yǎng)任何病原真菌，且特異性高，也是其他診斷方法的基礎(chǔ)，目前仍是不可替代診斷方法。

3.2鏡檢診斷結(jié)果及影響因素直接顯微觀察方法是把病料放在顯微鏡進(jìn)行觀察，通過(guò)尋找菌絲或孢子，對(duì)病料進(jìn)行診斷。由于須癬毛癬菌為嗜角質(zhì)真菌，主要在皮膚角質(zhì)層或其皮膚附屬物生長(zhǎng)繁殖，這些組織特點(diǎn)較硬，不易直接觀察到侵染的真菌，為軟化角化的細(xì)胞，增加其透明性，一般滴加10%KOH，目前，報(bào)道該方法陽(yáng)性率為67%～91%[2]。本試驗(yàn)陽(yáng)性率為73%，比培養(yǎng)的方法高。鏡檢陽(yáng)性率的高低與檢查者的經(jīng)驗(yàn)和病料采集有關(guān)。判斷角化上皮有無(wú)感染，需要長(zhǎng)時(shí)間的經(jīng)驗(yàn)積累，最近報(bào)道有豐富經(jīng)驗(yàn)的皮膚真菌形態(tài)學(xué)專家，對(duì)374例人臨床樣本進(jìn)行直接顯微檢查，其陽(yáng)性率為73.8%[2]，這與本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率基本一致；病料采集時(shí)，首先應(yīng)該與其他皮膚病進(jìn)行鑒別，即取得病料應(yīng)該是皮膚真菌感染病料，取病料應(yīng)該在病變與健康皮膚組織交界處刮取皮屑或被毛。由于該方法局限和影響因素存在，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)直接鏡檢敏感性低(86.79%)，真正感染病料有時(shí)無(wú)法檢出，有9.5%(6/63)假陽(yáng)性；特異性差，即檢查了菌絲，也不能確定感染真菌種類。由于直接顯微檢查速度快，簡(jiǎn)單，目前仍是臨床皮膚真菌常用診斷方法之一。

3.3定量PCR與常規(guī)診斷方法比較近年來(lái)，為鑒定皮膚真菌的病原，建立多種分子生物學(xué)方法，包括基于染色體DNA(G+C)的含量、總DNA同源性、線粒體DNA限制酶斷片長(zhǎng)度多態(tài)分析、隨機(jī)引物PCR、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析、PCR指紋，特異基因序列分析等[5,10]。而這些方法是基于純化培養(yǎng)樣品，而不是臨床病料樣品。最近，建立了基于臨床病料的方法，包括PCR反向線點(diǎn)雜交技術(shù)(PCR-RLB)[11]、特異基因和探針定量PCR[12]、復(fù)合PCR[13]、巢式PCR[14]、寡核苷酸芯片[15]和PCR-ELISA[16]等。這些分子生物學(xué)方法都是對(duì)人臨床病料的檢查，對(duì)動(dòng)物皮膚真菌臨床病料分子生物學(xué)檢查，特別是兔須癬毛癬菌臨床病料定量PCR檢查方法還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用定量PCR方法，對(duì)患兔臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，與常規(guī)培養(yǎng)和直接鏡檢方法相比，定量PCR的敏感性和陰性預(yù)測(cè)值明顯高于常規(guī)方法，而特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與常規(guī)方法沒(méi)有明顯差異。在63例臨床樣品檢查中，定量PCR陽(yáng)性率為86%，其陽(yáng)性率高于培養(yǎng)和直接鏡檢方法，多種指標(biāo)綜合評(píng)定，定量PCR方法優(yōu)于常規(guī)方法。

綜上所述，本試驗(yàn)建立定量PCR方法，只能檢測(cè)須癬毛癬菌，對(duì)其它皮膚真菌和非皮膚真菌無(wú)法進(jìn)行診斷。培養(yǎng)方法可診斷和培養(yǎng)任何病原真菌，因此，盡管定量PCR綜合評(píng)定優(yōu)于培養(yǎng)，但不能替代培養(yǎng)。直接鏡檢速度快、費(fèi)用低，但缺乏特異性、敏感性低以及有假陰性。與直接鏡檢比，定量PCR更敏感，更特異性更強(qiáng)，完全可以替代直接鏡檢用于兔須癬毛癬菌的臨床診斷。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.013

通訊作者：劉彥威，Email:Liuyw.edu@126.com

Corresponding author:Liu Yan-wei, Email: liuyw.edu@126.com

中圖分類號(hào)：R379

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)02-0165-04

收稿日期：2015-06-10；修回日期:2015-10-12

Comparison of real-time PCR with conventional methods to diagnose Trichophyton mentagrophytes in clinical specimens from rabbits

SHEN Jie,LIU Yue,LIU Li-qiang,LIU Na,LIU Jian-chai,LIU Yan-wei,XING Xin

(Key Laboratory of Animal Medicine, Agricultural College, Hebei University of Engineering, Handan 056021, China)

Abstract:To investigate a rapid, specific and sensitive method to diagnose Trichophyton mentagrophytes infections in rabbits, a total of 63 clinical specimens were collected from rabbit with suspected dermatophytosis. These specimens were examined by both conventional diagnostic (direct microscopy and culture) method and real-time PCR assay, which were compared by sensitivity, specificity, positive and negative predictive value. The results showed that real-time PCR assay for Trichophyton mentagrophytes was positive in 86%, followed by direct microscopy(73%) and culture method(65%). Comparing with direct microscopy and culture method, real-time PCR assay had significantly higher sensitivity (100%vs 86.79%-77.35%) and negative predictive value (100% vs 64.17%-45.45%), while no significant differences were observed in specificity (90.90% vs 100%-100%) and positive predictive value (98.11% vs 100%-100%). In vitro culture is a specific diagnostic test, but is in poor sensitivity and long turnaround time of technique, with false negative results. Direct microscopy is a rapid diagnostic method but it lacks specificity and sensitivity. The specific result and short response time makes this real-time PCR assay very suitable as a routine diagnostic assay for Trichophyton mentagrophytes. It could advantageously replace the direct microscopy, but not the culture method.

Keywords:real-time PCR; Trichophyton mentagrophytes; conventional diagnosis; rabbit

河北省自然基金項(xiàng)目(No.C180501)；河北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No.Z02014048)和邯鄲市科技局資助項(xiàng)目(No.1422101047-3)聯(lián)合資助

Supported by the Natural Science Foundation Project of Hebei Province (No. C180501), the Key Project of Hebei Province Department of Education (No. Z02014048) and the Science and Technology Bureau--Funded Project (No. 1422101047-3)