包曙光， 魏情情， 劉智康， 聶　祥， 門淑珍

( 南開(kāi)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物生物學(xué)和生態(tài)學(xué)系， 天津 300071 )

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擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000表達(dá)模式分析及過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株獲得

包曙光， 魏情情， 劉智康， 聶祥， 門淑珍*

( 南開(kāi)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物生物學(xué)和生態(tài)學(xué)系， 天津 300071 )

摘要：植物體內(nèi)的α,β-不飽和活性醛類化合物對(duì)植物細(xì)胞具有毒害作用，清除這些α,β-不飽和活性醛類化合物對(duì)于植物細(xì)胞維持正常的生命活動(dòng)至關(guān)重要。前人研究報(bào)道通過(guò)體外酶活測(cè)定和異源瞬時(shí)表達(dá)鑒定擬南芥At3g04000基因編碼的蛋白為NADPH依賴的葉綠體醛還原酶(Arabidopsis NADPH-dependent chloroplastic aldehyde reductases, AtChlADRs)，推測(cè)其在清除葉綠體中長(zhǎng)鏈(≥5)α,β-不飽和醛類物質(zhì)中具有重要的功能。該研究主要構(gòu)建了擬南芥At3g04000基因的表達(dá)模式分析載體ProAt3g04000:GUS、亞細(xì)胞定位分析載體At3g04000-EGFP和過(guò)量表達(dá)載體At3g04000-OE，并獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析了At3g04000基因在擬南芥不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明：擬南芥At3g04000基因在幼苗中的轉(zhuǎn)錄水平最高，在蓮座葉、莖生葉、花序和角果中均有較高的轉(zhuǎn)錄水平；而在根部和莖稈中的轉(zhuǎn)錄水平較低。通過(guò)對(duì)ProAt3g04000:GUS轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色分析可知，At3g04000基因在子葉、蓮座葉和萼片的維管組織和保衛(wèi)細(xì)胞中均有較強(qiáng)的表達(dá)，在根的維管組織中有較弱的表達(dá)。通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)At3g04000-EGFP轉(zhuǎn)基因植株的觀察和分析發(fā)現(xiàn)，At3g04000不是定位于葉綠體中，而是定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。該研究結(jié)果為深入研究擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：擬南芥， α,β-不飽和醛， 醛還原酶， At3g04000， 表達(dá)模式， 過(guò)量表達(dá)

活性氧族(Reactive oxygen species，ROS)是植物有氧代謝過(guò)程中重要的副產(chǎn)物，對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起雙重功效：低濃度ROS可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，高濃度ROS對(duì)植物有氧化脅迫作用(Bolwell et al，1995；林植芳和劉楠，2012；田敏等，2005)。正常情況下，植物體內(nèi)ROS產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害。當(dāng)外在或內(nèi)在因素破壞了生物體內(nèi)ROS含量的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)時(shí),生物體內(nèi)過(guò)多的ROS將會(huì)損傷生物大分子，主要包括對(duì)蛋白質(zhì)的損傷作用、對(duì)DNA和糖類的氧化損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化(Potikha et al，1999；Halliwell，2006；張文玲等，2000；李冰冰等，2005)。當(dāng)植物遭受到外界生物或非生物脅迫時(shí)，ROS含量會(huì)迸發(fā)(Jackson et al，2001；Fath et al，2002)。ROS中的單線態(tài)氧和羥基自由基能與細(xì)胞膜組分中的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生作用引發(fā)脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量含有羰基的中間產(chǎn)物(Burcham，1998)。不飽和羰基化合物會(huì)擾亂細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡造成氧化脅迫，從而引起對(duì)細(xì)胞的毒害。其中醛類物質(zhì)能破壞膜的完整性，引起細(xì)胞毒害(Esterbauer et al，1991；Millar & Leaver，2000；Yamauchi & Sugimoto，2010)?；钚匀﹨⑴c了植物逆境脅迫下對(duì)細(xì)胞的毒害作用，影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育(Mano et al，2005；Yin et al，2010)。清除植物體內(nèi)過(guò)多的活性醛類物質(zhì)將會(huì)提高植物抵抗逆境的能力。Chen & Murata(2002)發(fā)現(xiàn)甜菜堿乙醛脫氫酶BADH能使細(xì)胞在干旱和高鹽等逆境脅迫下維持滲透平衡從而提高植物抗逆性。張海玲等(2010)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)乙醛脫氫酶基因(ALDH)番茄的抗逆性明顯高于對(duì)照，轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的活性醛類物質(zhì)所造成的氧化脅迫明顯下降。Mano et al(2005)在煙草中過(guò)量表達(dá)擬南芥的2-烯醛還原酶基因(2-ALKENALREDUCTASE，AER)明顯減少?gòu)?qiáng)光誘導(dǎo)的氧化脅迫，提高植物抗逆性。吳茜等(2015)在煙草中過(guò)量表達(dá)擬南芥AER基因明顯提高了煙草抗旱能力。α,β-不飽和活性醛類物質(zhì)可以通過(guò)與氨基反應(yīng)形成希夫堿化合物(Schiff baseadducts)，對(duì)細(xì)胞造成毒害(Yamauchi et al，2008)。因此，去除植物體內(nèi)α,β-不飽和的活性醛類物質(zhì)有助于植物解除活性醛造成的氧化損傷。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中去除α,β-不飽和活性醛的代謝途徑已有報(bào)道(Uchida，2003；Yamauchi et al，2011)，包括(1)醛脫氫酶，氧化醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)轸人猁}類化合物(Sellin et al，1991)；(2)醛-酮還原酶，催化醛轉(zhuǎn)變?yōu)榇碱愇镔|(zhì)(Kolb et al，1994; Burczynski et al，2001)；(3)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)途徑(Hartley et al，1995)；(4)NADPH依賴的鏈烯基氧化還原酶，催化含有α,β-不飽和的活性醛類物質(zhì)的氫化作用(Dick et al，2001)。關(guān)于植物體內(nèi)去除不飽和活性醛類物質(zhì)代謝途徑的研究相對(duì)較少。Yamauchi et al(2011)在擬南芥中篩選到NADPH 依賴的鏈烯基氧化還原酶At1g23740。此外，還在擬南芥中分別篩選到NADPH 依賴且定位于細(xì)胞質(zhì)的醛還原酶(At2g24190和At3g61220)和定位于葉綠體的一個(gè)醛-酮還原酶(At2g37770)及2個(gè)醛還原酶(At1g54870 和At3g04000)。其中，At3g04000具有去除長(zhǎng)鏈(≥5)α,β-不飽和醛和飽和醛的醛還原酶活力，并以紫鴨跖草(Tradescantiareflexa)葉片為材料利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)鑒定擬南芥醛還原酶At3g04000定位于葉綠體。然而，關(guān)于At3g04000表達(dá)模式的分析和在擬南芥穩(wěn)定表達(dá)株系中亞細(xì)胞定位模式的研究尚未見(jiàn)有報(bào)道。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了At3g04000基因在擬南芥不同組織的轉(zhuǎn)錄水平。構(gòu)建了At3g04000基因的啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因的融合載體，并且獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥ProAt3g04000:GUS。通過(guò)GUS染色分析了擬南芥醛還原酶At3g04000的表達(dá)模式。構(gòu)建了At3g04000全長(zhǎng)基因(-927～+933)與GFP基因融合的亞細(xì)胞定位分析載體。以At3g04000-EGFP轉(zhuǎn)基因擬南芥作為材料，檢測(cè)了擬南芥醛還原酶At3g04000在擬南芥體內(nèi)的亞細(xì)胞定位模式。另外，構(gòu)建了擬南芥醛還原酶At3g04000過(guò)量表達(dá)載體，并且獲得了純合的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥。

1材料與方法

1.1 植物材料

所用的擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞型(Col-0)，種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。擬南芥培養(yǎng)在人工氣候室內(nèi)，溫度設(shè)定為22 ℃，濕度設(shè)定為60%，設(shè)定光照為16 h、8 h黑暗。分別采集野生型擬南芥的根、幼苗、蓮座葉、莖生葉、莖稈、花序和角果用于At3g04000基因表達(dá)模式的分析。采集四周齡的野生型和過(guò)量表達(dá)植株的蓮座葉用于過(guò)量表達(dá)植株的轉(zhuǎn)錄水平分析。植物材料采集后立即于液氮中速凍，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和 SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均購(gòu)自TaKaRa生物公司。引物訂購(gòu)和測(cè)序反應(yīng)均由華大生物有限公司完成。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司。其它試劑購(gòu)自上海生工生物有限公司。

1.3 主要方法

1.3.1 RNA提取和cDNA的合成擬南芥總RNA 的提取按照TaKaRa生物公司RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取2 μg不同組織的的總RNA用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 At3g04000基因的啟動(dòng)子、開(kāi)放閱讀框和全長(zhǎng)基因(-927～+933)的克隆通過(guò)擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(www.arabidopsis.org)獲得At3g04000基因的完整信息。選取起始密碼子(ATG)上游927 bp作為該基因的啟動(dòng)子。采用Premer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)At3g04000基因的啟動(dòng)子、開(kāi)放閱讀框和全長(zhǎng)基因序列(-927～+933)的特異引物，附加所需的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(表1)。以3周齡擬南芥蓮座葉的DNA為擴(kuò)增At3g04000基因啟動(dòng)子和全長(zhǎng)基因(-927～+933)的模板。以幼苗總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為擴(kuò)增At3g04000基因開(kāi)放閱讀框的模板。

1.3.3 表達(dá)載體構(gòu)建和擬南芥轉(zhuǎn)化通過(guò)酶切連接的方法分別構(gòu)建了At3g04000表達(dá)模式分析載體、亞細(xì)胞定位分析載體和基因過(guò)量表達(dá)載體(圖2)。(1)利用KpnⅠ和SpeⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增得到的At3g04000基因的啟動(dòng)子產(chǎn)物和pGreenⅡ-0229-GUS載體進(jìn)行酶切反應(yīng)。通過(guò)T4連接酶的連接作用將At3g04000基因的啟動(dòng)子序列連接到pGreenⅡ-0229-GUS載體中，獲得了At3g04000基因表達(dá)模式的分析載體ProAt3g04000:GUS。(2)利用KpnⅠ和SpeⅠ限制性內(nèi)切酶將擴(kuò)增得到的At3g04000全長(zhǎng)基因(-927～+933)產(chǎn)物和pGreenⅡ-0229-EGFP載體進(jìn)行酶切反應(yīng)。通過(guò)T4連接酶的連接作用將At3g04000全長(zhǎng)基因(-927～+933)連接到pGreenⅡ-0229-EGFP載體中，獲得了At3g04000基因亞細(xì)胞定位的分析載體At3g04000-EGFP。(3)利用XbaⅠ和SpeⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增得到的At3g04000基因的開(kāi)放閱讀框產(chǎn)物和過(guò)量表達(dá)載體pBA002分別進(jìn)行酶切反應(yīng)。通過(guò)T4連接酶的連接作用將At3g04000基因的開(kāi)放閱讀框序列連接到過(guò)量表達(dá)載體pBA002中，獲得了帶有CaMV35S啟動(dòng)子的過(guò)量表達(dá)植物載體At3g04000-OE。

將測(cè)序正確的At3g04000基因表達(dá)模式分析載體、亞細(xì)胞定位分析載體和過(guò)量表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株C58C1中。采用花苞浸泡法將3個(gè)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到擬南芥中。

1.3.4 At3g04000基因過(guò)量表達(dá)植株轉(zhuǎn)錄水平分析提取4周齡的野生型和過(guò)量表達(dá)植株蓮座葉的總RNA且反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用半定量RT-PCR方法鑒定過(guò)量表達(dá)植株中At3g04000基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.5 At3g04000基因表達(dá)模式和蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的分析(1)ProAt3g04000:GUS植株的GUS 染色分析：將ProAt3g04000:GUS轉(zhuǎn)基因植株的不同組織分別置入配置好的GUS 染色液中，37 ℃保溫過(guò)夜。將染色好的植物組織置于固定液(乙醇∶乙酸=3∶1)中固定脫色2 h，然后用透明劑進(jìn)行透明處理。

表 1　本文中用到的引物

注：下劃線標(biāo)識(shí)引入的酶切位點(diǎn)。Note: Restriction site is underlined.

將透明好的植物材料置于顯微鏡下觀察和拍照。(2)At3g04000基因的實(shí)時(shí)定量PCR分析：以擬南芥的不同組織總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，以持家基因ACTIN2基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)At3g04000基因的特異引物作為擴(kuò)增引物(表1)。擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性 94 ℃ 2 min; 變性94 ℃ 10 s，退火60 ℃ 10 s，延伸 72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。(3)At3g04000蛋白的亞細(xì)胞定位分析：以轉(zhuǎn)基因擬南芥At3g04000-EGFP的T2代幼苗的子葉作為實(shí)驗(yàn)材料，置于共聚焦顯微鏡下觀察和拍照。

2結(jié)果與分析

2.1 擬南芥At3g04000基因的啟動(dòng)子、開(kāi)放閱讀框和全長(zhǎng)基因(-927～+933)的克隆及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

根據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因信息，At3g04000基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?16 bp, 編碼了272個(gè)氨基酸。以野生型擬南芥的DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增分別獲得At3g04000基因的啟動(dòng)子和全長(zhǎng)基因(-927～+933)的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。以野生型擬南芥幼苗總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得At3g04000基因開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。用酶切連接的方法分別構(gòu)建At3g04000基因的表達(dá)模式分析載體ProAt3g04000:GUS、亞細(xì)胞定位分析載體At3g04000-EGFP和過(guò)量表達(dá)載體At3g04000-OE(圖2：A、B、C)。通過(guò)花苞浸泡法分別獲得3個(gè)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株，并利用PCR對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定，獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(圖2：D、E、F)。

圖 1　擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000啟動(dòng)子、全長(zhǎng)基因(-927～+933)和開(kāi)放閱讀框PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果　M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； A. At3g04000啟動(dòng)子的擴(kuò)增產(chǎn)物； B. At3g04000全長(zhǎng)基因(-927～+933)的擴(kuò)增產(chǎn)物； C. At3g04000基因開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增產(chǎn)物。Fig. 1　PCR products of promoter,genomic sequences (-927-+933) and open reading frame of Arabidopsis aldehyde reductase encoding gene At3g04000 analyzed by agarose gel electrophoresis　M. DNA marker; A. PCR products of At3g04000 promoter; B. PCR products of At3g04000 genomic sequence(-927-+933); C. PCR products of At3g04000 open reading frame.

2.2 At3g04000基因表達(dá)模式的分析

為檢測(cè)At3g04000基因的表達(dá)模式，分別以野生型擬南芥的根、幼苗、蓮座葉、莖生葉、莖稈、花和角果為材料，對(duì)擬南芥不同組織中At3g04000基因的表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。由圖3可知，At3g04000基因在所有檢測(cè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平明顯不同。At3g04000基因在幼苗中的表達(dá)水平最高，在蓮座葉、莖生葉、花序和角果中也均有較高的表達(dá)水平；At3g04000基因在莖稈中的表達(dá)水平最低，在根中的表達(dá)水平也較低(圖3)。

為了進(jìn)一步檢測(cè)At3g04000基因在不同組織表達(dá)的特異性，通過(guò)GUS組織化學(xué)染色法分析了ProAt3g04000:GUS轉(zhuǎn)基因植株的不同組織中At3g04000基因的表達(dá)情況。分別將ProAt3g04000:GUS轉(zhuǎn)基因植株的不同組織材料置于GUS染色液中37 ℃保溫過(guò)夜。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ProAt3g04000:GUS轉(zhuǎn)基因植株的幼苗、蓮座葉、花序中都有染色。在幼苗的整個(gè)子葉中都有強(qiáng)的染色，尤其在維管組織和保衛(wèi)細(xì)胞中，而在根部維管組織中染色較弱；在蓮座葉維管組織和保衛(wèi)細(xì)胞中有強(qiáng)的染色；在花序中僅在萼片的維管組織和保衛(wèi)細(xì)胞中有強(qiáng)的染色(圖4)。

2.3 At3g04000蛋白亞細(xì)胞定位的分析

為了檢測(cè)At3g04000蛋白的亞細(xì)胞定位模式，以At3g04000-EGFP轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的子葉為材料分析At3g04000的亞細(xì)胞定位模式。通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察可知，At3g04000并不定位于葉綠體中，而是定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(圖5)。

2.4 At3g04000基因過(guò)量表達(dá)植株的獲得及相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分析

為了研究At3g04000基因在擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用，采用酶切連接的方法構(gòu)建了At3g04000基因的過(guò)量表達(dá)載體At3g04000-OE(圖2：C)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將測(cè)序正確的過(guò)量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中并獲得了At3g04000-OE轉(zhuǎn)基因擬南芥的T1代種子。由于過(guò)量表達(dá)載體pBA002中有除草劑抗性基因，因此采用除草劑篩選獲得了T1代抗性植株。通過(guò)PCR進(jìn)行基因型鑒定進(jìn)一步獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(圖2：F)。將不同轉(zhuǎn)基因株系的T2代擬南芥種子播種于土中，用除草劑進(jìn)行篩選。選擇抗性苗與非抗性苗比例為3∶1分離的株系作為繼續(xù)篩選的材料。通過(guò)除草劑的篩選獲得了純合的At3g04000-OE轉(zhuǎn)基因單拷貝株系。為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植株中At3g04000轉(zhuǎn)錄水平的變化，采用半定量RT-PCR分析了轉(zhuǎn)基因植株中At3g04000的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，表明轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)t3g04000-OE-1 #、5# 和22 #中At3g04000基因的表達(dá)量均明顯的高于野生型(圖6)。這表明獲得的純合At3g04000-OE-1 #、5 #和22 #株系是At3g04000基因過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。

3討論

植物體內(nèi)的有氧代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生活性氧，此外當(dāng)植物受到外界環(huán)境脅迫時(shí)也會(huì)有活性氧在細(xì)胞中大量累積(Asada，1999；Thannickal & Fanburg，2000；薛鑫等，2013)?；钚匝醯倪^(guò)量積累會(huì)造成植物體內(nèi)脂質(zhì)的過(guò)氧化， 從而引起大量醛的累積(Burcham，1998)。在逆境脅迫下植物體內(nèi)醛的過(guò)量積累是引起植物傷害的重要因素之一(Mano et al，2005；Yin et al，2010)。清除植物體內(nèi)過(guò)量累積的醛類物質(zhì)有利于解除植物所受到的毒害和提高抗逆性(張海玲等，2010；吳茜等，2015)。植物體內(nèi)的α,β-不飽和的活性醛是一類對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害的醛類物質(zhì)(Yamauchi et al，2011)。因此清除植物體內(nèi)的α,β-不飽和的活性醛有利于解除細(xì)胞受到的毒害。Yamauchi et al(2011)通過(guò)體外酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)和瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)鑒定了At3g04000是一個(gè)NADPH依賴的定位于葉綠體的擬南芥醛還原酶。然而，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)和GUS 染色分析可知：At3g04000基因不僅在擬南芥的子葉、蓮座葉和萼片中有表達(dá)，而且在根部也有明顯的表達(dá)。因此推測(cè)：At3g04000基因可能并不僅僅定位于葉綠體。

圖 2　擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000載體構(gòu)建示意圖和轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定結(jié)果　A. 表達(dá)模式分析載體構(gòu)建示意圖； B. 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建示意圖； C. 過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖； D. ProAt3g04000:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定結(jié)果，1-9、11-14和16#為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株； M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； P. 陽(yáng)性對(duì)照; N. 陰性對(duì)照； E. At3g04000-EGFP轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定結(jié)果，1-6、8-11和13-16為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株; M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); P. 陽(yáng)性對(duì)照; N. 陰性對(duì)照； F. At3g04000-OE 轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定結(jié)果，1-25和27-31#為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株; M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); P. 陽(yáng)性對(duì)照; N. 陰性對(duì)照。Fig. 2　Schematic diagrams of constructed vector and PCR results of transgenic plants of Arabidopsis aldehyde reductase encoding gene At3g04000　A. Schematic diagram of the vector constructed for analyzing expression pattern of the At3g04000 gene; B. Schematic diagram of the vector constructed for analyzing subcellular of the At3g04000 gene; C. Schematic diagram of the vector for At3g04000 gene overexpression vector. D. PCR results of ProAt3g04000:GUS transgenic Arabidopsis, 1-9, 11-14 and 16 # are positive transgenic plants; M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control; E. PCR results of At3g04000-EGFP transgenic Arabidopsis, 1-6, 8-11 and 13-16 # are positive transgenic plants; M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control; F. PCR results of At3g04000-OE transgenic Arabidopsis, 1-25 and 27-31 # are positive transgenic plants; M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control.

圖 3　擬南芥At3g04000基因在擬南芥不同組織的表達(dá)水平　Fig. 3　Expression levels of At3g04000 gene in various Arabidopsis tissues

本研究主要構(gòu)建了擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000的表達(dá)模式分析載體、亞細(xì)胞定位載體和過(guò)量表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法分別獲得了轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株。GUS染色分析和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的結(jié)果都表明At3g04000基因在擬南芥的根部有表達(dá)。盡管At3g04000在擬南芥根部表達(dá)的水平較低，然而表達(dá)模式的分析結(jié)果卻暗示著At3g04000并不僅僅定位在葉綠體。為了確定At3g04000基因的亞細(xì)胞定位，采用酶切連接的方法將At3g04000全長(zhǎng)基因(-927～+933)與綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因融合構(gòu)建了亞細(xì)胞定位表達(dá)載體At3g04000-EGFP。以At3g04000-EGFP轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的子葉作為觀察材料分析了At3g04000亞細(xì)胞定位模式。本研究表明，At3g04000并不定位于葉綠體中，而是定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

Yamauchi et al(2011)是以紫鴨跖草為材料采用瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)證明At3g04000定位于葉綠體。他們用于亞細(xì)胞定位的表達(dá)載體中的啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子， 而且只選擇了At3g04000N 端的124個(gè)氨基酸與GFP形成融合蛋白。本研究中用于亞細(xì)胞定位分析的載體中的啟動(dòng)子為At3g04000基因的自身啟動(dòng)子，而且采用At3g04000完整蛋白與GFP形成融合蛋白，并以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因擬南芥作為觀察材料。因此，本研究中的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果更具準(zhǔn)確性和科學(xué)性。本研究表明，At3g04000不是擬南芥葉綠體醛還原酶(AtChlADRs)，而是擬南芥細(xì)胞質(zhì)醛還原酶(ArabidopsisNADPH-dependent cytosolic ADRs, AtCytADRs)。另外，At3g04000定位于細(xì)胞核也暗示著該酶可能存在著其它的功能。

圖 4　ProAt3g04000:GUS 轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色分析　A. 5 d齡幼苗； B. 幼苗子葉的放大圖； C. 幼苗子葉的局部放大圖，顯示保衛(wèi)細(xì)胞； D. 幼苗根部的放大圖； E. 3 d齡黑暗培養(yǎng)的幼苗子葉； F. 16 d齡的擬南芥； G. 完全伸展的蓮座葉； H. 花序； I. 花。Fig. 4　GUS staining analysis of ProAt3g04000:GUS transgenic plants　A. Five-day-old seedling; B. Magnified figure of seedling cotyledon; C. Magnified figure of seedling cotyledon, highlight the guard cells; D. Magnified figure of seedling root; E. Three-day-old seedling under dark treatment; F. Sixteen-day-old Arabidopsis; G. Fully extended rosette leaf; H. Inflorescence; I. Flower.

圖 5　At3g04000的亞細(xì)胞定位分析　A. At3g04000-綠色熒光蛋白信號(hào)； B. 葉綠體自發(fā)熒光信號(hào)； C. A和B圖疊加后圖像。Fig. 5　Aanlysis on subcellular localization of At3g04000 protein　A. Green fluorescence protein signal; B. Auto-fluorescence signal of chloroplast; C. Merged image.

圖 6　At3g04000-OE 轉(zhuǎn)基因植株中At3g04000基因的轉(zhuǎn)錄水平分析　At3g04000-OE-1#、5# 和22#為At3g04000的過(guò)量表達(dá)株系；ACTIN2作為內(nèi)參基因。Fig. 6　Transcription levels of At3g04000 gene　At3g04000-OE-1#, 5# and 22# were overexpression lines of At3g04000. ACTIN2 gene was used as housekeeping gene.

為了更深入研究At3g04000的功能，本研究雖獲得了純合的At3g04000過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥，但在正常生長(zhǎng)條件下過(guò)量表達(dá)植株與野生型相比未展現(xiàn)出明顯的區(qū)別。對(duì)于擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000的功能分析還需要進(jìn)一步研究才能掌握該基因在植物抗逆中的作用。本文為進(jìn)一步研究擬南芥醛還原酶在植物抗逆中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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Expression pattern analysis ofArabidopsisaldehyde reductase encoding gene At3g04000 and generation of overexpression plants

BAO Shu-Guang, WEI Qing-Qing, LIU Zhi-Kang, NIE Xiang, MEN Shu-Zhen*

(DepartmentofPlantBiologyandEcology,CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity, Tianjin 300071, China )

Abstract:Reactive aldehyde, especially α,β-unsaturated aldehyde compounds are toxic to plant cells. Therefore, elimination of α,β-unsaturated aldehyde compounds is vital for plant cells to maintain normal life activities. In previous reports, the Arabidopsis At3g04000 gene was identified as encoding a NADPH-dependent chloroplastic aldehyde reductases (AtChlADRs) by enzyme activity assay in vitro and subcellular localization analyse in spiderwort cells. And it was proposed to play important role in scavenging α,β-unsaturated aldehydes with more than 5 carbons (C≥5) in chloroplasts. To further analysis the roles of At3g04000 gene, we generated transgenic Arabidopsis plants expressing a ProAt3g04000:GUS for analysis of its expression pattern, a At3g04000-EGFP translational fusion for subcellular localization analysis, and 35S:At3g04000 for overexpression of At3g04000 gene. We also used quantitative real time PCR to investigate the transcription of At3g04000 gene during the developmental process of Arabidopsis. The results showed that the transcription of At3g04000 gene was detected in all examined tissues. The highest transcription level of At3g04000 gene was detected in Arabidopsis seedlings, relative high level of At3g04000 gene transcripts were also detected in rosette leaf, cauline leaf, inflorescence and silique, while in root and stem the transcription level of At3g04000 gene was very weak. The results of GUS staining in ProAt3g04000: GUS transgenic Arabidopsis plants were in consistency with the results of the quantitative real time PCR analysis. Strong GUS staining was found in vascular tissues and guard cells of cotyledon, rosette leaf and sepal, and weak GUS staining was found in vascular tissues of root. To analyze the subcellular localization of the At3g04000 gene encoded protein, the At3g04000-EGFP transgenic Arabidopsis seedling was observed by confocal microscopy. The results showed that At3g04000 gene encoded protein was not localized in chloroplast, but localized in cytoplasm and nucleus. This study provides tools for further study of the roles of At3g04000 gene in Arabidopsis.

Key words:Arabidopsis, α,β-unsaturated aldehyde, aldehyde reductase, At3g04000, expression pattern, overexpression

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201601028

收稿日期:2016-01-18修回日期：2016-03-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31570247, 91417308, 91017009, 31460453)；天津市自然科學(xué)基金(12JCZDJC23200)；國(guó)家基礎(chǔ)學(xué)科人才培養(yǎng)基金南開(kāi)大學(xué)生物學(xué)人才培養(yǎng)基地(J1103503) [Supported by the National Science Foundation of China (31570247, 91417308, 91017009, 31460453); the Natural Science Foundation of Tianjin (12JCZDJC23200); Funds for National Basic Science Personnel Training (J1103503)]。

作者簡(jiǎn)介：包曙光(1985-)，男(蒙古族)，內(nèi)蒙古通遼市人，博士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究，(E-mail) mindaguang3906@126.com。 *通訊作者：門淑珍，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物固醇的研究，(E-mail) shuzhenmen@nankai.edu.cn。

中圖分類號(hào)：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142(2016)06-0698-09

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