王廣寧，馬愛軍，李 猛，馬得友

（1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071； 3. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

?

大菱鲆微衛(wèi)星標(biāo)記在親本后代中的分離分析

王廣寧1，2，3，馬愛軍1，2，李 猛1，馬得友1

（1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071； 3. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

摘要：為對大菱鲆（Scophthalmus maximus）的養(yǎng)殖群體進(jìn)行微衛(wèi)星分析研究，作者用 70個微衛(wèi)星位點(diǎn)在大菱鲆親本后代中的基因型分離方式進(jìn)行檢測與分析。結(jié)果顯示，70個位點(diǎn)共產(chǎn)生了12種分離方式（♀×♂）。70個微衛(wèi)星位點(diǎn)中45個位點(diǎn)符合孟德爾遺傳定律（P≥0.05），有25個位點(diǎn)偏離了孟德爾遺傳定律（P＜0.05）。平均等位基因數(shù)目為2.2，平均有效等位基因數(shù)為1.885。平均期望雜合度和觀測雜合度分別為0.55和0.537。多態(tài)信息含量為0.182～0.699，平均值為0.361。研究證明這些標(biāo)記大部分可以用于大菱鲆進(jìn)一步的圖譜構(gòu)建，QTL定位和分子標(biāo)記輔助育種研究。同時對群體的分析表明，該大菱鲆養(yǎng)殖群體遺傳多樣性水平較高，可用于進(jìn)一步的良種繁育。

關(guān)鍵詞：大菱鲆（Scophthalmus maximus）； 微衛(wèi)星位點(diǎn)； 遺傳變異； 基因分離

大菱鲆（Scophthalmus maximus）英文名 Turbot，屬于硬骨魚綱（Osleichthyes）、鰈形目（Pleuronectiformes）、菱鲆科（Bothidae）、菱鲆屬（Scophthalmus），俗稱歐洲比目魚，國內(nèi)稱為“多寶魚”［1］； 具有生長快、營養(yǎng)價值高、肉味鮮美、性格溫順等優(yōu)點(diǎn)，在歐洲的養(yǎng)殖已形成產(chǎn)業(yè)化，是歐洲沿海各國重要的海水養(yǎng)殖對象［1-3］。

雷霽霖院士于 1992年首次將大菱鲆引入中國，經(jīng)過多年的研究已形成工廠化養(yǎng)殖模式，經(jīng)濟(jì)效益高，逐漸成為中國海水魚類養(yǎng)殖的主要品種［1，4-5］。然而在大菱鲆養(yǎng)殖繁育過程中，由于親魚的選擇不嚴(yán)格，并且都是近親交配繁殖，使得孵化率下降、出苗率降低、生長速度減慢、抗逆性變差、抗病性減弱［6-7］等種質(zhì)退化現(xiàn)象過早出現(xiàn)，并且退化較嚴(yán)重［8］。國內(nèi)的大菱鲆發(fā)展已經(jīng)到了一個迫切需要改良的階段［9］，需要從根本上去改善大菱鲆的良種選育工作，這就需要對其遺傳育種展開研究，國內(nèi)也已經(jīng)開始了相關(guān)方面的研究。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記由于具有數(shù)量多、多態(tài)性高、重復(fù)性好和便于PCR檢測等優(yōu)點(diǎn)［10］，使得微衛(wèi)星標(biāo)記成為遺傳學(xué)研究使用的主要遺傳標(biāo)記，并且廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建［11-13］、遺傳多樣性分析［14］、系譜認(rèn)證［15］等研究領(lǐng)域。在大菱鲆研究中微衛(wèi)星分子標(biāo)記的應(yīng)用也早已展開，國外的研究開展較早，西班牙的Bouza等［16］用242個微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了包括26個連鎖群的大菱鲆連鎖圖譜，2013年 Hermida［17］等又將圖譜加密，構(gòu)建了包含24個群體487個標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜。 國內(nèi)顧穎［18］等篩選出了一些大菱鲆的微衛(wèi)星標(biāo)記，為進(jìn)一步了解大菱鲆的基因組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及良種選育工作提供了幫助； 許可［19］等篩選了與大菱鲆生長有關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)。但國內(nèi)大菱鲆的微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)仍舊較少，本實(shí)驗(yàn)室的李猛［20］在2013年用FIASCO法和標(biāo)記初步篩選法開發(fā)了 413對微衛(wèi)星引物并進(jìn)行了分析。本實(shí)驗(yàn)是從已開發(fā)的引物中篩選了70對引物，在后代中進(jìn)行檢測，分析其分離模式及偏分離檢測，并對群體多樣性進(jìn)行了分析。而在相近物種中的類似研究較少，劉賢德［21］等用22個微衛(wèi)星標(biāo)記對大黃魚（Larimichthys crocea）的F1代分離方式進(jìn)行了分析，并進(jìn)行了生長相關(guān)性的分析，找到了對大黃魚生長有利的基因型

［Foundation： National High-tech Research and Development Program of China （863 Program） ，No. 2012AA10A408-8； Special Fund for the Industrial Technology System Construction of Modem Agriculture and Countermeasures，No.CARS-50-01］

電話： 0532-85835103，E-mail： maaj@ysfri.ac.cn及與有利基因連鎖的標(biāo)記； 姜黎明［22］使用富集文庫-菌落原位雜交方法開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記對半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）F1代的分離方式進(jìn)行了分離分析，為半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)提供了幫助。本實(shí)驗(yàn)通過對微衛(wèi)星標(biāo)記在后代群體中的分析研究，以期為大菱鲆遺傳圖譜的構(gòu)建，QTL定位和分子標(biāo)記輔助育種提供良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)室2011年在煙臺天源水產(chǎn)國家級良種場所構(gòu)建了育種家系，親魚為2008年實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家系保留魚種，2010年用電子標(biāo)記標(biāo)記了同批次的魚，并進(jìn)行控溫控光，促進(jìn)性腺發(fā)育。2011年在大菱鲆繁殖周期中的盛期，選取健康活潑、體色正常、性腺發(fā)育成熟的大菱鲆作為親魚，采用人工采卵受精的方法按照交配設(shè)計(jì)進(jìn)行定向交配。交配后選擇受精卵量大于 25 mL做為保留家系，孵化后初孵仔魚大于 20 000尾的為保留家系，并分池養(yǎng)殖。本研究選擇以電子標(biāo)記編號5000047593為母本、1000046133為父本雜交獲得的后代家系為檢測群體。2012年隨機(jī)選取家系中 150尾個體進(jìn)行分析，聚丙烯酰胺電泳檢測后將疑似非本家系的個體選出并剔除，然后選擇基因組DNA質(zhì)量好的90個個體并結(jié)合2個親本進(jìn)行SSR分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取與檢測

實(shí)驗(yàn)所用親本和后代 DNA全是用天根海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取，提取完后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶，用NANO DROP1000分光光度計(jì)檢測DNA濃度及純度； 若符合要求，就稀釋至40 ng/μL，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR及檢測

對新合成的引物進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，然后通過PCR擴(kuò)增出包括核心序列在內(nèi)的DNA序列，對PCR產(chǎn)物變性之后進(jìn)行8%PAGE電泳，最后用銀染法分析產(chǎn)物帶型。實(shí)驗(yàn)所用部分微衛(wèi)星引物的信息見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用部分微衛(wèi)星引物的核心序列、引物序列、退火溫度和片段長度Tab. 1 Microsatellite primers，repeat motif sequences，primer sequences，annealing temperature，and fragment lengths used in thisstudy

表1 本實(shí)驗(yàn)所用部分微衛(wèi)星引物的核心序列、引物序列、退火溫度和片段長度Tab. 1 Microsatellite primers，repeat motif sequences，primer sequences，annealing temperature，and fragment lengths used in thisstudy

位點(diǎn)名稱 　　核心序列 　　引物序列 　　退火溫度（℃） 片段長度（bp）L12001F 　　（GT）16　CTGGCACTTGGATTCTGACC 　60 　116 L12001R 　 　GGTGCGGCAAGATGGAGT L12002F 　?。═G）19　CAAAGGCAGATGACAATCAAAC　60 　197 L12002R 　 　ACTCGTAGCCGCTTTCGTC L12012F 　　（CA）24　GGGGATGAACAGGGAGATG 　61 　198 L12012R 　 　GGAGAACAGAGGTGAGGAGGC L12020F 　?。℅T）7（GTGC）6AT（GT）3GC（GT）6　CTGCGAGCATAGTAATGTTTTC 　57 　147 L12020R 　 　CTCCCAAGTAATAATCCCACC L12021F 　?。℅T）6AT（GT）20GC（GT）3　TCAGCTCCTTGGCACAGAAT 　55 　209 L12021R 　 　AACTGATCGGCAACCCACA L12028F 　　（TG）20　TTAGCAATGGCTTACTGAGGT 　55 　159 L12028R 　 　TGTTTTGTGAATTTGGTATGTCC L12029F 　?。℅T）4AT（GT）14　ACAACGTGCAGATTTACAGTAGC　60 　253 L12029R 　 　GACAACTTGGTGAAACAAAACTA L12034F 　?。ˋC）8　TTATCCTGCCCGTCACCCG 　60 　142 L12034R 　 　AACAAATGCGGCAACACGT L12040F 　?。℅T）13； （GA）6TG（GA）7　TGCCTGTCAGCCTGTGTC 　56 　173 L12040R 　 　TGAGCCTTCCCCTCCATT L12046F 　　（GT）15　CTGACCTCGTGAGTGGTAATCC 　55 　254 L12046R 　 　CAGCCAGTGCTTGTTGTGC L12048F 　?。ˋTG）4； （AC）5GC（AC）13　AGAATCAAACTGAAGTGGGTCTT　49 　348

續(xù)表

PCR反應(yīng)程序： 95℃5 min1個循環(huán)； 95℃45 s，退火溫度50 s，72℃50 s，30 循環(huán)； 72℃10 min 1 個循環(huán)；4℃保存。

PCR變性產(chǎn)物電泳是利用的 DYY-10C電泳儀和DYCZ-20C序列分析電泳槽。電泳條件： 電壓1 200 V，電流500 mA，功率600 W。電泳時間在3.5 h左右。然后進(jìn)行染色顯色，自然晾干，拍照后保存。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)每個個體在玻璃板上的條帶位置，確定基因型，每個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因根據(jù)片段大小依次命名為A、B、C、D……。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)群體篩選

用 6對引物（已知其在雙親中表現(xiàn)出的基因型）對150個個體與親本在PCR后同時進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳，挑出與親本基因型相差較大的個體，剔除，最后挑選90個DNA質(zhì)量較好的個體。用 Popgene32軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算各個微衛(wèi)星位點(diǎn)在2個親本和90個后代個體中的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)。在計(jì)算期望雜合度，是根據(jù)親本的基因型進(jìn)行推算，比如親本的基因型為 AC×BC，根據(jù)孟德爾遺傳分離定律，子代的基因分型及其比例應(yīng)該為AB︰AC︰BC︰CC=1︰1︰1︰1，期望雜合度為 0.75；親本的基因型為 AB×BC，根據(jù)分離定律，子代的基因分型及其比例為AB︰AC︰BB： BC=1︰1︰1︰1，期望雜合度為 0.75； 但在親本的基因型為 AA×BB，子代的基因分型全為 AB，期望雜合度為 1，而用Popgene32軟件計(jì)算時，得到的期望雜合度為 0.5。多態(tài)信息含量按Bostein［23］等的公式計(jì)算：

其中，Pi和Pj分別為第i和第j個等位基因在群體中的頻率，n為等位基因數(shù)。并用Excel的χ2功能對各位點(diǎn)的偏分離情況進(jìn)行了卡方檢測。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)在后代群體中的分離

將這70個微衛(wèi)星位點(diǎn)在2個親本和后代90個個體中進(jìn)行檢測，結(jié)果（表1）顯示70個位點(diǎn)在親本后代中有12種分離方式（♀×♂）： AA×AB（8個），AB×AA（12個），AB×AB（20個），AB×AC（1個），AB×BB（9個），AB×BC（4個），AB×CD（2個），AC×BC（2個），AC×AB（1個），BB×AB（9個），BC×AC（1個），BC×AB（1個）。其中只在母本和子代發(fā)生分離的有21個，只在父本和子代發(fā)生分離的有17個，雙親和子代中都發(fā)生分離的有 32個。在所檢測的70個位點(diǎn)中有45個的子代個體基因型符合孟德爾遺傳分離定律（P≥0.05），有 25個位點(diǎn)偏離了孟德爾遺傳定律（P＜0.05），有22個位點(diǎn)嚴(yán)重偏離了孟德爾遺傳定律（P＜0.01）。圖1為L12046，L12094，L120121，L120211 4個位點(diǎn)在2個親本和后代90個個體中的部分電泳圖。70個位點(diǎn)在后代群體中的分離方式及比例見表2。

圖1 L12046，L12094，L120121，L120211 4個位點(diǎn)在后代群體中的電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis results of the four microsatellite loci L12046，L12094，L120121，and L120211 in progeny

表2 親本基因型及70個位點(diǎn)在后代中的基因型分布Tab. 2 Parental genotypes and genotype distributions of 70 loci in progeny

續(xù)表

續(xù)表

2.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)在后代群體的遺傳變異分析

70個微衛(wèi)星位點(diǎn)在后代群體中呈現(xiàn)了各不相同的多態(tài)性。用Popgene32軟件分析數(shù)據(jù)顯示，SSR的等位基因數(shù)位2～4個，平均為2.2個，有效等位基因數(shù)為1.254～3.951，平均有效等位基因數(shù)1.885。按孟德爾遺傳分離定律計(jì)算，期望雜合度為0.5、0.75、 1共3種情況（因親本基因沒有純合的，所以本實(shí)驗(yàn)中期望雜合度沒有為0的情況），平均觀測雜合度為0.537。多態(tài)性信息含量（PIC）為 0.182～0.699，差異較大，PIC平均值為0.361。70個位點(diǎn)具體的雜合度，多態(tài)信息含量，偏離程度 P，有效等位基因數(shù)等信息見表3。

表3 70個微衛(wèi)星位點(diǎn)在大菱鲆后代群體中的遺傳信息統(tǒng)計(jì)Tab. 3 Genetic information statistics for ?70 microsatellite loci in the F1 generation of turbot

續(xù)表

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在計(jì)算群體的期望雜合度的時候參考的是劉賢德的計(jì)算方法［21］，即根據(jù)親本的基因型來推斷子代的基因型，然后根據(jù)子代的基因型理論分布情況來計(jì)算期望雜合度。這與張寧［24］、劉瑞成［25］等用常用群體分析軟件所采用 Nei氏公式的計(jì)算方法是不同的，這兩種計(jì)算方法的結(jié)果有時候一致，有時候不一致。

例如本實(shí)驗(yàn)中親本為AB×CD時，使用Nei氏公式推斷的子代期望雜合度為 0.75，而根據(jù)孟德爾分離定律，子代全為雜合，期望雜合度為1，兩種方法結(jié)果不一致； 親本為兩種不同的純和體（如AA×BB），子代全為雜合，期望雜合度為1，用Nei氏公式計(jì)算結(jié)果為 0.5，結(jié)果也不一致。因此對于家系群體，應(yīng)該根據(jù)親本的基因型，按照孟德爾分離定律來計(jì)算期望雜合度［21］。70個微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀測雜合度均值為 0.537，說明該群體的雜合度較高，群體的遺傳多樣性較高。

70個微衛(wèi)星位點(diǎn)中有 25個偏分離（P＜0.05），偏分離比例較大（0.357）。發(fā)生偏分離的原因有多種，比如統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時，基因型劃分不準(zhǔn)確，條帶讀取不夠準(zhǔn)確［26］、研究個體數(shù)較少、純合致死基因的存在［27］。本研究中可能是由于國內(nèi)大菱鲆都是養(yǎng)殖群體，在養(yǎng)殖過程中，沒有野生群體血緣的加入，是群體的純合致死基因純合幾率增大，使得偏分離程度增加。

PIC的大小能夠反映出某一個遺傳標(biāo)記所包含的遺傳信息含量，當(dāng)PIC＞0.5時，表明該遺傳標(biāo)記具有高度的可提供遺傳信息性； 當(dāng) 0.5＞PIC＞0.25時，表明該遺傳標(biāo)記能夠較為合理的提供遺傳信息，而當(dāng) PIC＜0.25時，表明該遺傳標(biāo)記可提供的遺傳信息較差［28］。70個位點(diǎn)中PIC＞0.5的有10對，有58個在0.5＞PIC＞0.25的范圍之內(nèi)，只有兩個位點(diǎn)L12020 和L12265 的PIC＜0.25，這說明70個微衛(wèi)星位點(diǎn)提供的遺傳信息較豐富，同時也表明該群體總體的遺傳多樣性水平還是較高的。從以上分析可以看出，這些微衛(wèi)星位點(diǎn)大部分還是能夠滿足大菱鲆進(jìn)一步的遺傳學(xué)研究的，為大菱鲆的圖譜構(gòu)建，QTL定位和分子標(biāo)記輔助育種的研究提供了較好的分子標(biāo)記。對群體的分析表明，該大菱鲆養(yǎng)殖群體雖然出現(xiàn)了一定程度的退化，但是遺傳多樣性水平還比較高，可用于進(jìn)一步的良種繁育。

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（本文編輯： 譚雪靜）

中圖分類號：Q341

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3096（2016）04-0001-10

doi：10.11759//hykx20141028002

收稿日期：2014-10-28； 修回日期： 2014-12-30

基金項(xiàng)目：國家863 計(jì)劃（2012AA10A408-8）； 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金共同資助（CARS-50-01）

作者簡介：王廣寧（1987-），男，山東青州人，碩士，主要從事海洋動物遺傳育種研究，E-mail： wgning1314@126.com； 馬愛軍，通信作者，研究員，

Separation and analysis of turbot microsatellite markers in progeny

WANG Guang-ning1，2，3，MA Ai-jun1，2，LI Meng1，MA De-you1
（1. Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences； Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries，Ministry of Agriculture； Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology，Qingdao 266071，China； 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology，Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Qingdao 266071，China； 3. Shanghai Ocean University，College of Fisheries and Life Science，Shanghai 201306，China）

Received： Oct. 28，2014

Key words：turbot； microsatellite loci； genetic variation； gene isolation

Abstract：To evaluate the farmed turbot population using microsatellite markers，we analyzed the segregation patterns of genotypes constituted by 70 microsatellite loci in turbot parents and their progeny. Results revealed that a total of 12 patterns were detected through sexual hybridization （♀×♂）. A total of 45 loci were found to adhere to the Mendel’s law of inheritance （P≥0.05），whereas the remaining 25 deviated from the law （P＜0.05）. The average number of alleles and effective number of alleles were 2.2 and 1.885，respectively. The average expected and observed heterozygosities were 0.55 and 0.537，respectively. The range of polymorphic information content was between 0.182 and 0.699，with an average of 0.361. These results demonstrate that most of these markers will be useful for future progress in genetic breeding in turbot and the farmed turbot population with a high level of genetic diversity can be used for the further breeding of improved varieties.