蔣 明，李 智，董蓮花，陳 斌*(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.畜禽遺傳改良湖南重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

?

烏雞黑色素的提取和測(cè)定及黑色素過(guò)度沉積相關(guān)基因的研究進(jìn)展

蔣 明1,2*，李 智1,2，董蓮花1,2，陳 斌1,2**
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.畜禽遺傳改良湖南重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

摘 要：烏骨雞具有極高的藥用價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和觀賞價(jià)值，而這些價(jià)值的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是黑色素。本文就烏雞黑色素的提取、測(cè)定方法及其及過(guò)度沉積相關(guān)基因等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述。

關(guān)鍵詞：黑色素；紫外分光光度計(jì)；纖維黑色素基因；真皮黑色素抑制基因；提取方法

烏骨雞在我國(guó)飼養(yǎng)歷史上已經(jīng)有將近兩千多年了，遍布云南、貴州、陜西、浙江及江西等省，其具有烏骨、烏皮、烏肉、鳳頭、五爪、叢冠、綠耳、毛腿、絲毛和胡須十大特征[1]。近代醫(yī)學(xué)研究表明，烏雞最重要的實(shí)用價(jià)值和藥用價(jià)值在于其機(jī)體內(nèi)部沉積大量的黑色素，而且許多研究也發(fā)現(xiàn)，烏雞的黑色素具有清除機(jī)體的自由基、延緩衰老、抗紫外線、抗氧化和提高機(jī)體免疫力等生理功能。本文綜述了烏雞黑色素的提取、測(cè)定方法及其及相關(guān)基因等方面的研究進(jìn)展。

1 黑色素的提取方法

烏雞黑色素是一類(lèi)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜、而且在體內(nèi)與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合不易分開(kāi)的多聚體[2]，因此，提取黑色素的關(guān)鍵就在于如何剔除黑色素中的蛋白質(zhì)。目前用于提取烏雞黑色素的主要方法有鹽酸水解提取法和酶水解提取法。

1.1 鹽酸水解提取法

鹽酸水解提取法是黑色素提取的最早的一種方法，這種提取方法對(duì)于黑色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及形態(tài)結(jié)構(gòu)都有一定的破壞。但是，這種方法簡(jiǎn)單，容易操作，而且提取的黑色素光穩(wěn)定性也比較好。徐頂巧等[3]利用單因素實(shí)驗(yàn)的方法以及響應(yīng)面的分析方法對(duì)鹽酸提取過(guò)程中的料液比、鹽酸濃度和提取時(shí)間進(jìn)行研究；結(jié)果表明：當(dāng)鹽酸濃度為27 %，提取時(shí)間為6 h，料液比(m∶V)為1∶2時(shí)，黑色素的得率為最高，達(dá)到了4.72 %。桑宏慶等[4]對(duì)料液比、浸提次數(shù)和提取溫度進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定溫度為40 ℃，浸提次數(shù)為3次，料液比為1∶2的條件為最佳，提取率為0.37 %。朱方等[5]研究表明，提取的最佳工藝條件為：溫度為95 ℃，提取時(shí)間為2 h，料液比為1∶4。劉永忠等[6]對(duì)烏雞胸肌和雞皮等不同部位的提取條件也進(jìn)行了不同的優(yōu)化，并且制定了相應(yīng)的提取方案。目前的研究進(jìn)展表明，鹽酸提取方法的最佳工藝仍然存在一定的分歧，原因可能是由于所取烏雞的種類(lèi)和提取器官的不同導(dǎo)致的，但是其基本操作流程還是一樣的：取一定量的烏雞組織，絞碎，濃鹽酸浸泡一定的時(shí)間，然后抽濾，最后洗滌，真空冷凍干燥得到黑色素粗品。

1.2 酶水解提取法

由于酸提取黑色素的方法容易損傷黑色素的化學(xué)及形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且提取過(guò)程中的回流耗時(shí)長(zhǎng)，能量也消耗大，較為繁瑣，因此國(guó)內(nèi)外許多科研工作者開(kāi)始研究利用蛋白酶來(lái)水解提取黑色素。蔡華珍等[7]從蛋白酶的種類(lèi)、加酶量、pH、酶解溫度和酶解時(shí)間等方面來(lái)對(duì)蛋白酶提取黑色素進(jìn)行研究，結(jié)果表明消化液中氨基態(tài)氮含量與烏雞黑色素分離得率呈極顯著的線性相關(guān)，消化液中的氨基態(tài)氮含量可以作為黑色素含量的一種間接表示。在此次試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，酸性蛋白酶對(duì)烏雞蛋白質(zhì)的水解能力大于木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶大于中性蛋白酶，而中性蛋白酶強(qiáng)于堿性蛋白酶。酸性蛋白酶的最佳水解條件為：pH為2.8，溫度為34.8 ℃，加酶量為3.8 %，酶解時(shí)間為20 h；而且還發(fā)現(xiàn)在總酶量不變的前提下，分兩次加入比單獨(dú)一次性加入效果更好。張恒業(yè)等[8]采取分步酶解法提取烏雞黑色素，首先利用復(fù)合蛋白酶水解烏雞肉末，然后再利用酸性蛋白酶水解，酸性蛋白酶的酶解條件參考蔡華珍等實(shí)驗(yàn)，而復(fù)合蛋白酶最佳條件為酶的加入量為3.5 %，pH 為6.5，酶解時(shí)間為3 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采取分布法提取黑色素的得率高，而且對(duì)維生素C也有一定的保護(hù)能力。

除了上述方法之外，也有科研工作者將酶提取和酸提取方法結(jié)合一起用，周偉偉等[9]將烏雞肉樣在中性的條件下，利用木瓜蛋白酶酶解3 h，將其離心后的沉淀物，經(jīng)過(guò)鹽酸回流，抽濾，最后冷凍干燥獲得黑色素，研究發(fā)現(xiàn)此方法不僅耗時(shí)少，而且該方法獲得的烏雞黑色素的純度也相對(duì)較高。

2 黑色素的測(cè)定

2.1 紫外風(fēng)光光度計(jì)法

烏雞黑色素含量的研究有一段時(shí)間普遍使用重量法，這種方法在操作上比較方便，而且運(yùn)用起來(lái)也非常的簡(jiǎn)單，但是其中存在一個(gè)問(wèn)題，就是那些樣品中不溶于水的雜質(zhì)，它們的存在會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成極大的誤差。近年來(lái)研究結(jié)果表明，黑色素在可見(jiàn)光下沒(méi)有其獨(dú)特的吸收峰，而在紫外波長(zhǎng)下，黑色素的吸收值達(dá)到最高，當(dāng)波長(zhǎng)增加時(shí)，它的吸收值會(huì)下降，因此現(xiàn)在許多科研工作者都采用紫外分光光度計(jì)法來(lái)度量黑色素的含量。Reedy等[10]研究發(fā)現(xiàn)，黑色素在530 nm下的吸光值相對(duì)偏低，因此將530 nm處的吸光值作為黑色素的相對(duì)含量，而Ito等[11]將黑色素經(jīng)過(guò)碘化氫和含過(guò)氧化氫的氫氧化鈉溶液處理后，測(cè)定其在350 nm下的吸光值，也有科研工作者用熱的氫氧化鈉溶液溶解黑色素組織，然后測(cè)定該溶液在500 nm下的吸光值來(lái)確定黑色素的總含量，該方法主要適用于只含有脫黑色素的組織，由于真黑色素很難溶于堿中，但在后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是真黑色素還是脫黑色素都能溶解在閃爍液Soluene-350∶水=9∶1(v∶v)的混合液中，而在500 nm下的吸光值與黑色素的含量呈正相關(guān)，因此常用A500作為黑色素的含量[12,13]。Del等[13]還發(fā)現(xiàn)脫黑色素和真黑色素在500 nm和650 nm下的吸光值有著非常大的區(qū)別，因此可以將其在Soluene-350混合液中的A500/A650預(yù)測(cè)脫黑色素和真黑色素的比例情況。

2.2 液相色譜法

液相色譜測(cè)定黑色素的原理是：由于真黑色素由二羥基吲哚(DHI)和二羥基吲哚羧酸(DHICA)組成，脫黑色素主要由半胱氨酸和酪氨酸的衍生而成，DHICA和DHI在強(qiáng)氧化劑的氧化下分別生成二羧酸吡咯(PDCA)和三羧基吡咯(PTCA)，脫黑色素經(jīng)過(guò)碘化氫處理生成氨基羥基苯基丙氨酸(AHP)，因此可以通過(guò)液相色譜法測(cè)定PTCA和PDCA及AHP分別作為真黑色素和脫黑色素含量的指標(biāo)[14,15]。孫亞真等[16]通過(guò)對(duì)泰和絲羽烏骨雞的研究，建立了對(duì)PDCA和PTCA液相色譜測(cè)定的體系，利用KromasilC18柱進(jìn)行分離和二極管矩陣檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定過(guò)程以甲醇-0.1 %甲酸作為流動(dòng)相，然后梯度洗脫，269.8 nm和282.8 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，最后結(jié)合LC-MS的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的色譜峰進(jìn)行定性判斷，該方法使得PTCA和PDCA很好地分離開(kāi)來(lái)，測(cè)定結(jié)果表明烏骨雞黑色素含量為76.33 μg/mg。王歡歡等[17]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能夠同時(shí)測(cè)定烏雞肉中肌苷酸和黑色素的液相色譜體系，其利用過(guò)氧化氫在堿性環(huán)境下將黑色素樣品進(jìn)行氧化，然后將氧化產(chǎn)物與肌苷酸待測(cè)液混合，分離柱與孫亞真一樣，仍然使用C18柱進(jìn)行分離，但其檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，流動(dòng)相為甲醇-磷酸/三乙胺，洗脫方式也不一樣，為等度洗脫，該方法能夠快速地將肌苷酸和黑色素同時(shí)檢測(cè)出來(lái)。以上科研工作者在該方法的流程細(xì)節(jié)上有少許的不同，那可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的目的、實(shí)驗(yàn)的材料差別所導(dǎo)致的，但是二者均告訴我們，利用液相色譜測(cè)定黑色素的方法相對(duì)于紫外分光光度計(jì)測(cè)定方法靈敏、可靠，而在實(shí)際操作中，應(yīng)根據(jù)具體需求，做相應(yīng)的調(diào)整。

3 黑色素過(guò)度沉積相關(guān)基因

烏雞的超黑色素化是其體內(nèi)過(guò)度沉積黑色素所導(dǎo)致的，研究結(jié)果表明其是由少量的基因調(diào)控的一種質(zhì)量性狀[18]。控制烏雞黑色素過(guò)度沉積的主要基因座有Z染色體上的真皮黑色素抑制基因(DermalMelanin Inhibitor，ID)和20號(hào)染色體上的纖維黑色素基因(Fibromelanosis，F(xiàn)M)[19,20]。皮膚中的黑色素由兩部分組成：表皮黑色素和真皮黑色素，真皮黑色素細(xì)胞主要分布于含磷狀的脛骨中，該處黑色素的沉積主要受ID基因控制，ID基因是一個(gè)復(fù)等位基因，有idA、Id、idM和idC四個(gè)等位位點(diǎn)，隱性表達(dá)時(shí)，脛骨表現(xiàn)為黑色。橫斑基因(B)與其連鎖距離為13cM[21]。ID基因野生型為隱性，顯性Id能夠抑制真皮黑色素的沉積，即只有當(dāng)基因型為id/id 或id/W時(shí)，雞的脛骨表型才為黑色。FM基因則相反，顯性Fm能夠促進(jìn)黑色素的沉積。但是ID基因?qū)M基因有上位效應(yīng)，故烏雞基因型為Fm/-,id/id或者Fm/-,id/W[22,23]。Dorshorst等[24]研究結(jié)果表明，ID基因定位與Z染色體的67.1 Mb～72.3 Mb區(qū)域，而FM基因定位在20號(hào)染色體10.3 Mb～13.1 Mb區(qū)域。田明等[25]利用密度更高的SNP芯片對(duì)FM和ID區(qū)域進(jìn)行定位，并結(jié)合aCGH芯片檢測(cè)技術(shù)，對(duì)FM和ID基因進(jìn)行定位，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FM基因區(qū)域存在兩段拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation，CNV)—CNV-1和CNV-2，推測(cè)其CNV結(jié)構(gòu)形式為兩個(gè)CNV-1之間有一個(gè)180度顛倒的CNV-2，最后再與一個(gè)正常的CNV-2相連，二者之間間隔417 kb(圖1)，ATP5e、END3、TUBB1、SLMO2位于CNV-1內(nèi)，END3基因可能是其中的關(guān)鍵基因。FEM1C、ALDH7A1和MTAP定位于ID區(qū)域，而MTAP可能是ID基因座上的關(guān)鍵基因。除了上述兩個(gè)區(qū)域?qū)蹼u黑色素沉積有關(guān)聯(lián)外，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MC1R[26]、TYP[27]、TYRP1[28]和MITF[29]基因與黑色素的沉積也有一定的關(guān)聯(lián)。

參考文獻(xiàn)：(29篇，略)

中圖分類(lèi)號(hào)：S831.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-0769(2016)04-0077-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助(CARS-36)。

*作者簡(jiǎn)介：蔣明，男，湖南郴州人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種，E-mail:jiangming598@126.com。

**通信作者：陳斌，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:chenbin7586@126. com。