沈秀珍，王　凌，方毅華

(赤壁市人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 赤壁 437300)

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青蒿素減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

沈秀珍，王凌，方毅華

(赤壁市人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 赤壁 437300)

摘要：目的 探討青蒿素是否可以通過調(diào)節(jié)自噬減輕心肌缺血再灌注(I/R)損傷以及可能的機(jī)制。方法 采用大鼠心肌I/R模型(缺血30min，再灌注4h)，雄性SD大鼠30只隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(SO組，n=10)、缺血再灌注組(I/R組，n=10)和青蒿素治療組(A+I/R組，n=10，Arteannuin:25mg/kg，Tid，造模前1d灌胃)。檢測心肌損傷標(biāo)記物肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌鈣蛋白I(cTnI)；檢測氧化應(yīng)激水平(丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平；檢測自噬蛋白beclin-1和LC3水平。結(jié)果 與SO組比較，I/R組可誘導(dǎo)心肌損傷標(biāo)記物，氧化應(yīng)激水平的增加和自噬的過度激活；與I/R組比較，青蒿素可顯著的降低心肌損傷標(biāo)記物的表達(dá)、氧化應(yīng)激水平和自噬的過度激活。結(jié)論 ①青蒿素可以通過抑制過度自噬減輕心肌I/R損傷；②青蒿素可能通過抑制氧化應(yīng)激，抑制再灌注階段自噬過度激活。

關(guān)鍵詞：青蒿素；自噬；氧化應(yīng)激；心肌缺血；再灌注損傷

自噬是細(xì)胞在應(yīng)激或不良狀態(tài)下的一種自我保護(hù)過程，可以清除降解的蛋白質(zhì)和損傷的細(xì)胞器。通常認(rèn)為，自噬是細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維護(hù)者，然而，過度的自噬也可以引起細(xì)胞死亡，稱為自噬性程序性細(xì)胞死亡(程序性死亡共三種，另外兩種為凋亡和壞死)，這說明自噬對細(xì)胞的影響是多樣的、復(fù)雜的。前期的研究證實(shí)[1，2]，自噬是心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一，它在損傷的起始和進(jìn)展過程中都發(fā)揮了重要作用。

青蒿素是青蒿的活性成分，因其100%的抗瘧性而受到世界的關(guān)注。近年的研究發(fā)現(xiàn)[3，4]，青蒿素對多種疾病都有明顯的抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用，包括心梗和心肌I/R損傷。炎癥和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致自噬過度激活的重要因素[5]，但青蒿素是否可以通過調(diào)節(jié)自噬減輕心肌I/R損傷，目前尚無研究，為驗(yàn)證上述假設(shè)我們進(jìn)行了下述研究。

1材料與方法

1.1動物準(zhǔn)備與分組30只成年雄性SD大鼠，購于武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。于恒溫、恒濕、明/暗交替(12h)的環(huán)境喂養(yǎng)48h。

大鼠缺血再灌注模型：2%戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg，ip)后，仰臥固定于鼠板，氣管插管(頻率：70bpm，吸呼比：1∶1.5，潮氣量：3～4mL/100g)。胸骨左緣切口，暴露心臟，破心包膜；于左心耳下2～3mm處將前降支與一個(gè)中間帶有凹槽的空心乳膠管一起結(jié)扎，結(jié)扎線下心肌變蒼白表明缺血成功。缺血30min后，沿乳膠管凹槽剪斷結(jié)扎線再灌注4h。再灌注4h后，2%戊巴比妥鈉麻醉(20mg/kg，ip)，頸靜脈采血2mL，迅速剪下心臟，剪除多余部分留取心梗區(qū)(白色)和缺血區(qū)(白色附近5mm)用于檢測。30只大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(SO，n=10)：僅插管、開胸、LAD下穿線但不結(jié)扎；缺血再灌注組(I/R，n=10)：按照上面所述造模，缺血30min，再灌注4h；青蒿素治療組(A+I/R，n=10)：造模前1d青蒿素灌胃(25mg/kg，Tid)，造模同I/R組。

1.2檢測指標(biāo)和方法

(1)分光光度法檢測血清乳酸脫氫酶(LDH)，肌酸激酶(CK)和肌鈣蛋白I(cTnI)，通過心肌損傷標(biāo)記物(LDH、CK、cTnI)的表達(dá)水平反應(yīng)心肌損傷情況。靜脈采血后靜置10min，待血液凝固后離心(3000r/min×15min)，取血清。選用南京建成生物工程研究所試劑盒，嚴(yán)格按照說明操作檢測LDH和CK。

(2)檢測丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，通過檢測MDA和SOD評價(jià)心肌組織氧自由基含量和脂質(zhì)超氧化水平。檢測方法如前所述，采用南京建成生物工程研究所的MDA和SOD試劑盒，嚴(yán)格按照說明操作。

(3)western blot法檢測LC3和beclin-1，組織勻漿在PAGE膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，1抗孵育過夜，包括LC3(1∶500稀釋，sigma)，beclin-1(1∶500稀釋，Abcanm)和β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)。在相應(yīng)的二抗孵育后，ECL顯色，以其與β-actin的比值表示其相對表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1血清LDH、CK和cTnI結(jié)果與SO組比較，I/R組中LDH、CK和cTnI水平明顯升高(P均<0.05)；A+I/R組中CK和cTnI水平明顯增高(P均<0.05)，LDH有增高趨勢，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與I/R組比較，A+I/R組中LDH、CK和cTnI水平明顯降低(P均<0.05)。見表1。

表1　青蒿素對心肌損傷標(biāo)記物的影響±s)

與SO組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

2.2心肌組織MDA和SOD水平結(jié)果見表2。與SO組比較，I/R組中MDA表達(dá)明顯升高，而SOD表達(dá)明顯降低(P均<0.05)。與I/R組比較，A+I/R組中MDA表達(dá)明顯下降，而SOD表達(dá)明顯升高(P均<0.05)。

2.3心肌組織LC3與beclin-1水平結(jié)果見表2。與SO組比較，I/R組中LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1水平明顯升高(P均<0.05)。與I/R組比較，A+I/R組中LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1水平明顯降低(P均<0.05)。

表2　青蒿素對氧化應(yīng)激和自噬的影響±s)

與SO組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

3討論

青蒿素是由我國專家最先從青蒿中提取的活性成分，因其100%的抗瘧有效性而受到世界的關(guān)注。雖然對青蒿素抗炎作用的研究由來已久，但青蒿素與心血管疾病關(guān)系的研究卻很少，且主要集中在心律失常[4，6]。Gu等[4，6]發(fā)現(xiàn)青蒿素可以通過抑制心梗后炎癥反應(yīng)，減輕心臟的自主神經(jīng)重構(gòu)和心臟電生理基質(zhì)的損傷。Sun等[3]發(fā)現(xiàn)，在離體缺氧復(fù)氧模型中，青蒿素可以明顯抑制氧自由基生成，增加脂質(zhì)超氧化。本研究用在體I/R模型進(jìn)一步印證了上述結(jié)論，但本研究首次發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以明顯降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和beclin-1表達(dá)，及抑制過度自噬減輕心肌缺血再灌注損傷。

研究表明，自噬是心肌I/R的重要病理生理機(jī)制之一[1，2]。I/R誘導(dǎo)的ATP耗竭、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白質(zhì)降解等均會增強(qiáng)自噬[5]。自噬對細(xì)胞的影響是多面性的，適度的自噬可以幫助細(xì)胞清除降解的蛋白質(zhì)和損傷的細(xì)胞器，具有保護(hù)作用，但過度激活自噬卻可以導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。目前自噬對心肌I/R的作用尚無定論，通常認(rèn)為，在心肌缺血階段，自噬被適度激活，表現(xiàn)為心肌保護(hù)作用，但在再灌注階段，自噬被過度激活，表現(xiàn)為加重心肌損傷的作用[1，2]。Matsui等[1，2]證實(shí)，在心肌再灌注階段beclin-1水平明顯升高bcl-2明顯降低，標(biāo)志自噬被過度激活，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡。Beclin-1是一種關(guān)鍵的自噬蛋白，可以調(diào)節(jié)自噬小體的形成和進(jìn)展。在再灌注階段，beclin-1是誘導(dǎo)自噬過度激活的關(guān)鍵蛋白，研究證實(shí)，通過siRNA抑制beclin-1表達(dá)可以抑制自噬的過度激活，減輕I/R損傷[7]。眾所周知，在再灌注階段，氧自由基的過度生成而非能量耗竭是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的主要因素。Hariharan等[8]證實(shí)，氧自由基的生成伴隨beclin-1的高表達(dá)，給予抗氧化劑處理可明顯降低beclin-1的表達(dá)，這說明，活性氧是通過調(diào)節(jié)beclin-1的表達(dá)調(diào)節(jié)再灌注階段的心肌細(xì)胞自噬。另外，LC3為自噬相關(guān)蛋白，IL3-Ⅱ?yàn)橹|(zhì)化的活性狀態(tài)，IL3-Ⅰ為未脂質(zhì)化的非激活狀態(tài)，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值可以反應(yīng)自噬的激活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧可通過抑制ATG4的激活，促進(jìn)LC3脂質(zhì)化激活自噬[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以明顯抑制氧化應(yīng)激(降低MDA水平，升高SOD水平)，抑制過度自噬(降低beclin-1水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值)，因此我們推測，青蒿素可以通過抑制氧化應(yīng)激，抑制心肌I/R中自噬過度激活。

綜上所述，青蒿素可以通過抑制過度自噬減輕心肌I/R損傷，其可能通過抑制氧化應(yīng)激，抑制再灌注階段自噬過度激活。

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Artemisinin Alleviates Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury via Autophagy Regulation

SHEN Xiu-zhen，WANG Ling，F(xiàn)ANG Yi-huang

(DepartmentofCardiology，People'HospitalofChibi，ChibiHubei437300，China)

ABSTRACT：Objective To investigate the protective effect of artemisinin on myocardial ischemia and reperfusion(I/R) injury and the possible mechanism. Methods Rat I/R model was established by ligation of left anterior descending coronary artery for30min，followed by reperfusion for 4h.30 rats were divided into three groups: sham-operated group (SO)，ischemia and reperfusion group (I/R) and artemisinin treatment group (A+I/R)，10 rats in each group.Cardiac injury markers (serum creatine (CK)，lactate dehydrogenase (LDH)，and cTnI)，oxidative stress indexes (malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) and autophagy markers (beclin-1 and LC3) were detected.Results Compared with SO group，the levels of CK，LDH，cTnI MDA and the activity of SOD were significantly increased；autophagy was excessively activated in I/R group.Compared with I/R group，artemisinin significantly decreased the contents of CK，LDH,cTnI and MDA and increased the activity of SOD in myocardial tissue,decreased beclin-1 level and LC3-Ⅱ/Ⅰ ratio，suppressed excessive activation of autophagy .Conclusion Artemisinin can protect against myocardial I/R injury via suppressing oxidative stress and excessiveof activation autophagy.

KEY WORDS：Artemisinin；Autophagy;Oxidative stress;Myocardial ischemia；Reperfusion injury

中圖分類號：R-33

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-4646(2016)03-0191-03

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.03.0191

(收稿日期：2016-01-22)