駱曉艷，周　宇，鮑翠玉

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院護理學院)

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艾塞那肽對高糖誘導的心肌細胞損傷的保護作用機制探討*

駱曉艷1，周宇1，鮑翠玉2*

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院護理學院)

摘要：目的 探討艾塞那肽對高糖誘導的心肌細胞損傷的保護作用及其可能的作用機制。方法 將培養(yǎng)48h的原代心肌細胞分為5個組：正常組、模型組、小劑量組(10nmol/L)、大劑量組(20nmol/L)、甘露醇組，培養(yǎng)24h后，用western blot檢測Sirt1、p-p38蛋白的表達、ELISA測腫瘤壞死因子-a,白介素-6等炎癥因子。結果 模型組Sirt1的表達量低于正常組，p-p38的表達量高于正常組，給予艾塞那肽處理后，Sirt1蛋白的表達明顯高于模型組，p-p38的表達量低于模型組，但仍然高于正常組。甘露醇組的蛋白表達量與正常組相比無統(tǒng)計學差異。結論 艾塞那肽對高糖誘導的心肌細胞的炎性損傷有保護作用，其保護作用可能是通過調節(jié)Sirt1、p-p38蛋白的表達量來發(fā)揮作用的。

關鍵詞：艾塞那肽;高糖;Sirt1;p-p38;心肌細胞

糖尿病心肌病是一種獨立于其他的心臟疾病，發(fā)生于糖尿病患者特異性的疾病，它以心臟的收縮、舒張功能障礙為主要特征，最終導致心力衰竭。糖尿病心肌病的發(fā)病機制還未完全闡明，研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。艾塞那肽是一種與天然的GLP-1有高度同源性的GLP-1受體激動劑，是一種新型的糖尿病治療藥物。近幾年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)艾塞那肽不僅具有降血糖作用，而且對糖尿病心血管疾病的并發(fā)癥也有作用：艾塞那肽可以通過抑制炎癥反應來發(fā)揮抗糖尿病心肌病的作用，但其具體的作用機制還需要進一步探討。我們通過實驗，觀察艾塞那肽對Sirt1、p-p38蛋白表達,IL-6、TNF-a的含量的影響，來探究其抗炎的作用及作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物出生0～3d的新生SD乳鼠(購自于武漢大學實驗動物中心)30只。主要試劑：艾塞那肽(exendin-4)購于sigma公司，Sirt1一抗購自于CST公司，Gibcol胎牛血清，ELISA試劑盒，DMEM培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1心肌細胞的培養(yǎng)用75%的酒精給乳鼠身體表面消毒，用手術彎剪取乳鼠的心尖部分置于預冷的D-hank′s液中，洗去污血。用眼科剪剪去心臟周圍的血管和組織，將心臟組織剪成1mm3大小，用胰酶和二型膠原酶混合消化多次，收集上清液于10%的培養(yǎng)液中終止消化，1000rpm,離心5min,棄去上清液，獲得細胞沉淀，采用差速貼壁的方法純化心肌細胞，將純化的心肌細胞用20%的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h。

1.2.2模型的建立及分組將分離的乳鼠原代心肌細胞培養(yǎng)48h后首度換液，在倒置顯微鏡下觀察細胞的長勢，待細胞融合至90%時，將細胞分成六組分別給予以下處理：正常組(DMEM培養(yǎng)基)，模型組(DMEM培養(yǎng)基+24.5mmol/L的葡萄糖溶液)，小劑量組(模型組+exendin-4,10nmol/L),高劑量組(模型組+exendin-4,20nmol/L),對照組(DMEM培養(yǎng)基+24.5mmol/L的甘露醇)，以上細胞均繼續(xù)培養(yǎng)24h,進行以下指標的測定。

1.2.3炎癥因子IL-6和TNF-a含量的測定用ELISA試劑盒測收集到的細胞培養(yǎng)液，嚴格按照說明書操作，用酶標儀在450nm波長測量各孔的吸光度，根據(jù)標準曲線，計算出IL-6和TNF-a含量，用來判斷高糖誘導下的心肌細胞內炎癥因子水平的變化。

1.2.4乳鼠心肌細胞內Sirt1、p-p38蛋白水平的測定采用western blot測定細胞內Sirt1、p-p38蛋白的表達水平，用Sirt1與b-actin的蛋白條帶的灰度值比值，p-p38 和p38蛋白條帶的灰度值比值來比較Sirt1、p-p38蛋白的表達水平。

1.3統(tǒng)計學分析以上指標的測定均重復三次，數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗進行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析作統(tǒng)計學處理。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。

2結果

2.1炎癥因子含量的變化

2.1.1IL-6含量的變化與正常組比較，模型組心肌細胞內IL-6的含量明顯升高(159.89±10.01，P<0.01)，給予艾塞那肽大劑量組和小劑量組后，心肌細胞內的炎癥因子水平下降(P<0.05)，分別為131.90±10.35,122.58±11.23,見圖1。

2.1.2TNF-a的含量變化與正常組相比較，模型組心肌細胞內TNF-a的含量明顯升高(64.45±6.07，P<0.01)，給予艾塞那肽大劑量組和小劑量組(P<0.05)后，心肌細胞內的炎癥因子水平下降，分別為(46.42±7.03，P<0.05),(40.52±4.94，P<0.05)，如圖1。

圖1　IL-6及TNF-a的含量

2.2p-p38蛋白表達量的變化圖2顯示，與正常組相比較，模型組心肌細胞內p-p38的含量明顯升高(5.15±0.23,P<0.01)，給予艾塞那肽大劑量組和小劑量組后，心肌細胞內的p-p38蛋白的表達量下降,分別為4.17±0.27,4.19±0.24(P<0.05)。

圖2　p-p38蛋白表達量的變化

2.3Sirt1蛋白表達量的變化與正常組相比較，高糖能使Sirt1蛋白的表達量減少(0.45±0.09,P<0.01),給予小劑量(0.66±0.07)和大劑量(0.73±0.04)艾塞那肽后，Sirt1蛋白的表達量明顯增加(P<0.05,P<0.01)，但仍低于正常組，結果如圖3。

圖3　Sirt1蛋白表達量的變化

3討論

糖尿病心肌病是糖尿病主要的并發(fā)癥之一，也是導致糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病心肌的發(fā)病機制目前還未完全闡明，但是大量的研究[1]均證明炎癥反應在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，糖尿病時，心肌組織中炎癥細胞大量浸潤，炎癥因子異常表達,本實驗也觀察到高糖環(huán)境下，心肌細胞內的炎癥因子與其他組相比其含量增加，說明高糖對心肌細胞有損傷作用。

沉默信息調節(jié)因子相關酶1(Sirt1)是酵母沉默信息調節(jié)因子2(Sir2)的哺乳動物同源體，是一種高度保守的NAD+依賴的組蛋白去乙?；?屬于Ⅲ類組蛋白去乙?；?，它可以與多種底物結合發(fā)揮抗氧化應激、促進糖、脂代謝以及抑制炎癥反應等生理作用[2，3]。Sirt1在調控炎癥反應中起著重要的作用，讓小鼠的巨噬細胞過表達Sirt1基因，可以控制急性炎癥的發(fā)生，敲除Sirt1會使炎癥因子過高表達[4]。Sirt1受體的激動劑白黎蘆醇可以通過增加Sirt1的表達，抑制NF-κB，從而抑制血管的炎癥反應[5],這說明Sirt1的異常低表達會引發(fā)炎癥反應。本實驗結果表明高糖可以誘導心肌細胞內的Sirt1蛋白表達降低，同時模型組的炎癥因子水平也比其他組明顯升高，驗證了這一論述。

P38MAPK信號通路是體內一條重要的信號傳導通路，它不僅與細胞的增殖凋亡有關，也與細胞內的炎癥反應有關。因此在我們的實驗中，高糖環(huán)境可以使心肌細胞內的炎癥因子表達增加，于此同時p-p38的表達也增加。

GLP-1是由腸L細胞分泌的一種腸促胰島素，臨床上被廣泛用于治療糖尿??；GLP-1受體不僅僅存在于胰腺組織中，而且也存在于其他的組織器官中。近年來發(fā)現(xiàn)GLP-1還有抗炎作用[6],能增加Sirt1的表達。通過給予艾塞那肽后我們發(fā)現(xiàn)：不論是大劑量組，還是小劑量組，均能明顯的改善高糖所引起的炎癥因子水平的高表達和Sirt1蛋白的低表達的情況，說明艾塞那肽對高糖導致的心肌細胞的炎性損傷有保護作用，可能與增加Sirt1蛋白的表達有關。

綜上所述，高糖可以誘導乳鼠心肌細胞的炎性損傷，艾塞那肽可以通過下調Sirt1蛋白，上調p-p38蛋白，抑制炎癥反應來減輕高糖環(huán)境下心肌細胞的損傷。

參考文獻：

[1]Yuli Cai,Xiaorong Hu,Bo Yi，et al.Glucagon-like peptide-1 receptor agonist protects against hyperglycemia-induced cardiocytes injury by inhibiting high mobility group box 1 expression[J].Mol Bio Rep,2012,39(12):10705

[2]Thakur BK,Chandra A,Dittrich T,et al.Inhibition of SIRT1 by HIV-1 viral protein Tat results in activation of p53 pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,424(2):245

[3]Kuno,Hori YS,Hosoda R,et al.Resveratrol improves cardiomyopathy in dystrophin-deficient mice through SIRT1 protein-mediated modulation of p300 protein[J].J Biol Chem,2013,288(8):5963

[4]Liu TF,McCall CE.Deacetylation by SIRTl reprograms inflammation and cancer[J].Genes Cancer,2013,4(34):135

[5]Rong Guo,Baoxin Liu,Ke Wang et al.Resveratrol ameliorates diabetic vascular inflammation and macrophage infiltration in db/db mice by inhibiting the NF-κB pathway[J].Diabetes & Vascular Disease Research，2014,11(2) 92

[6]Krasner NM,Ido Y,Ruderman NB，et al.Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analog liraglutide inhibits endothelial cell inflammation through a calcium and AMPK dependent mechanism[J].PLoS One,2014,9(5):e97554

Protective Effect of Exenatide on High Glucose-induced Myocardial Cell Injury and its Mechanism

LUO Xiao-yan,ZHOU Yu,BAO Cui-yu

(SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

ABSTRACT：Objective To investigate the effect of exenatide on the myocardial cell damage induced by high glucose and explore the possible mechanism. Methods The primary cultured myocardial cells were divided into five groups: normal group，high glucose group，low-dose group(10nmol/L)，high-dose group(20nmol/L) andmannitol group.Western blot was used to detect the expression of sirt1 and p-p38 after culturing for 24 hours，the levels of tumor necrosis factor-α，interleukin-6 and other inflammatory cytokines were assayed by ELISA.Results Compared with normal group，sirt1 expression level was lowered in high glucose group and p-p38 expression was increased.Compared with high glucose group，exenatide could significantly elevate sirt1 expression and decrease p-p38 protein.No significant difference was observed in protein expression beween mannitol group and normal group.Conclusion Exenatide can protect high glucose-induced myocardial cell injury in rats by up-regulation of sirt1 expression and down-regulation p-p38 expression.

KEY WORDS：Exenatide;High glucose;Sirt1;p-p38;Myocardial cell

*通訊作者，E-mail：bcy_tiaopi@126.com

中圖分類號：R961

文獻標識碼：A

文章編號：2095-4646(2016)03-0188-03

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.03.0188

(收稿日期：2016-02-04)