咸 赫， 史素娟， 毛靜靜， 王 倩， 劉好寶*

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東 青島 266101；2. 青島市第九中學(xué)，山東 青島 266012；3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東 青島 266109）

?

一株細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株Gluconacetobacter xylinus的分離鑒定及其產(chǎn)物分析

咸 赫1，2， 史素娟1， 3， 毛靜靜1， 王 倩1， 劉好寶1*

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東 青島 266101；2. 青島市第九中學(xué)，山東 青島 266012；3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東 青島 266109）

摘 要：為獲得具有機(jī)械強(qiáng)度及彈性模量高等優(yōu)點(diǎn)的細(xì)菌纖維素，滿足其在食品工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、造紙、聲學(xué)器材和石油開采等方面的廣泛應(yīng)用。本研究通過初步活化和分步富集的方法獲得細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株，經(jīng)過16S rDNA及形態(tài)學(xué)鑒定后，利用單因子試驗(yàn)對(duì)該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并利用掃描電子顯微鏡、紅外光譜分析以及X-衍射等技術(shù)對(duì)獲得的細(xì)菌纖維素進(jìn)行表征。最終篩選獲得一株細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株，經(jīng)鑒定為木葡糖酸醋桿菌Gluconacetobacter xylinus，命名為G. xylinus 5-2；經(jīng)碳源、氮源、pH及其他影響因素的優(yōu)化，該菌株發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素純化干燥后干重達(dá)到13.2 g/L；發(fā)酵分離產(chǎn)物經(jīng)掃描電子顯微鏡、紅外光譜分析以及X-衍射等表征分析，證明該產(chǎn)物為細(xì)菌纖維素；對(duì)細(xì)菌纖維素進(jìn)行力學(xué)性質(zhì)表征分析，表明該細(xì)菌纖維素的彈性模量達(dá)到3.38 GPa。因此，本研究篩選獲得了一株在生產(chǎn)效率和產(chǎn)品性能等方面都較為優(yōu)異的纖維素生產(chǎn)菌株G. xylinus 5-2，并對(duì)其細(xì)菌纖維素的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步分析，為工業(yè)化生產(chǎn)高性能細(xì)菌纖維素奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌纖維素；Gluconacetobacter xylinus；篩選；性能分析

纖維素是葡萄糖分子經(jīng)過β-1，4糖苷鍵連接而成的多聚物，主要來源于植物，包括樹木、棉花等。植物來源的纖維素是造紙業(yè)、紡織業(yè)、建筑業(yè)以及化工領(lǐng)域的主要原材料。同時(shí)，一些細(xì)菌，如木醋桿菌、根瘤菌、土壤桿菌及假單胞菌等，也能以異養(yǎng)方式高效地產(chǎn)生胞外纖維素，又稱細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）［1-2］。通常而言，植物源纖維素由于被木質(zhì)素、半纖維素等雜質(zhì)包裹，生產(chǎn)過程較為復(fù)雜。而細(xì)菌纖維素則多以純纖維素的形式存在，纖維素直徑在幾到幾十納米之間。因其獨(dú)特的合成方式，細(xì)菌纖維素具有機(jī)械強(qiáng)度及彈性模量高、吸水性及生物相容性好等特點(diǎn)，在食品工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、造紙、聲學(xué)器材和石油開采等方面有巨大的應(yīng)用潛力。特別是在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，細(xì)菌纖維素作為繃帶、人工皮膚、工程支架、人造血管、藥物載體等原料的優(yōu)質(zhì)替代品，受到人們的廣泛關(guān)注［2-5］。

目前，細(xì)菌纖維素生物合成的研究主要集中在培養(yǎng)方式改造、培養(yǎng)裝備設(shè)計(jì)、發(fā)酵條件優(yōu)化、發(fā)酵菌株的代謝工程改造以及特效發(fā)酵生產(chǎn)纖維素菌株的篩選等方面。Hornung等研發(fā)出一種帶有噴霧裝置的反應(yīng)器，通過該噴霧裝置把葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)成分和氧氣噴灑到纖維素表面，使纖維素的產(chǎn)量高達(dá)9 g干重/天［6-7］。Chao等研制出底部有氣孔的發(fā)酵罐，通過輸入高濃度氧氣，節(jié)省能源降低成本，產(chǎn)量達(dá)到10.4 g/L。Hwang等通過優(yōu)化培養(yǎng)基 pH和溶氧濃度，使得木醋桿菌 Acetobacter xylinum BRC5中纖維素的合成率達(dá)到0.3 g/L·h，最高產(chǎn)量達(dá)到 15 g/L干重［8］。Shigemats等通過基因敲除手段構(gòu)建了木葡糖酸醋桿菌Gluconacetobacter xylinus BPR2001葡萄糖脫氫酶缺陷型菌株GD-I，改造后菌株的葡萄糖合成纖維素的能力比原始菌株提高了1.7倍［9］。另外，Carolina等克隆了G. hansenii ATCC23769纖維素合酶操縱子中的基因 bcsA、bcsB、bcsC、bcsD、cmcax、ccpAx和bglx，以期通過過表達(dá)這些基因提高纖維素產(chǎn)量［10］。除了利用基因工程改造菌株外，細(xì)菌纖維素生物合成研究在培養(yǎng)工藝等方面也進(jìn)行了大量的優(yōu)化并取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，具體措施包括在培養(yǎng)過程中添加乙醇或1-甲基環(huán)丙烯等，采用混合菌發(fā)酵等，在一定程度上大幅度提高纖維素的產(chǎn)量［11-14］。

盡管細(xì)菌纖維素生物合成在培養(yǎng)裝備、培養(yǎng)工藝和菌株代謝工程改造等方面取得了良好進(jìn)展，從源頭上篩選具有良好的纖維素生產(chǎn)能力的菌株，優(yōu)化其合成條件，表征獲得纖維素，仍然具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。本工作從細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株的篩選展開，通過菌株鑒定、發(fā)酵條件的優(yōu)化和獲得纖維素的表征等研究，以期獲得適合工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)菌納米纖維素生產(chǎn)菌株。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要試劑和儀器

酵母浸膏和胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID公司；葡萄糖、蔗糖、碳酸鈣、乙酸、乙酸鈉、乙醇、瓊脂、檸檬酸、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O等化學(xué)試劑均達(dá)到試劑純純度。試驗(yàn)中所需的Taq DNA聚合酶、細(xì)菌DNA提取試劑盒等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。所用引物由北京六合華大科技股份有限公司合成。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，LDZM-80KCS型蒸汽滅菌器購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠，GSP-9080MBE型隔水式培養(yǎng)箱購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，Nicolet 6700傅里葉變換紅外分析儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，D8 Advance X-衍射儀購(gòu)自德國(guó)Bruker公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 富集培養(yǎng)基

5%葡萄糖，0.5%酵母膏，0.2%乙酸鈉，1%CaCO3，pH5.0，121℃滅菌20 min。滅菌后加入2%乙醇和Nystatin（制霉菌素）50 mg/L。

1.2.2 斜面菌株保存培養(yǎng)基

5%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母膏，0.1%檸檬酸，0.2% Na2HPO4·12H2O，0.1% KH2PO4，0.025% MgSO4·7H2O，2%瓊脂，pH5.8，121℃滅菌20 min。

1.2.3 初始發(fā)酵培養(yǎng)基

2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.27% Na2HPO4，0.115%檸檬酸，pH5.0，121℃滅菌20 min。

1.3 菌株的富集與篩選

采集不同類型的腐爛水果、茶水及土豆淀粉等樣品。將1 g采集樣品用10 mL無菌水浸提1 h，靜置得到上清液。吸取1 mL上清液接種于10 mL富集培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)5～7 d，待管內(nèi)液面出現(xiàn)乳白色菌苔，吸取1 mL菌液到新鮮富集培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)5～7 d。富集得到的菌液適當(dāng)稀釋后，取100 μL涂平板，分離單菌落，30℃靜置培養(yǎng)48 h。隨機(jī)挑取菌落直徑大、表面光滑、邊緣整齊的菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)5～7 d，觀察并測(cè)定獲得的細(xì)菌纖維素。

1.4 細(xì)菌纖維素膜的處理方法

細(xì)菌纖維素膜的處理方法參照Putra等［15］，具體步驟如下：蒸餾水洗滌細(xì)菌纖維素膜并抽濾，去除膜表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡并沸水浴30 min；取出纖維素膜，用0.5%乙酸溶液浸泡5～10 min以中和NaOH溶液；用蒸餾水多次浸泡沖洗纖維素膜，直至其呈半透明乳白色；用濾紙吸干膜表面水分，60℃干燥至恒重。細(xì)菌纖維素產(chǎn)量用干重g/L表示。

1.5 16S rDNA鑒定

接種篩選獲得菌株于富集培養(yǎng)基，經(jīng)24 h靜置培養(yǎng)后離心收集菌體，提取細(xì)菌基因組。以基因組為模版 ， 采 用 細(xì) 菌16S rDNA通 用 引 物fD1（ 5'-GAGTTTGATCCTGGTCAG-3'） 和rP2 （5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT T-3'）進(jìn)行擴(kuò)增，獲得16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物送北京六合華大科技股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，初步確定其種屬。根據(jù)細(xì)菌伯杰氏手冊(cè)對(duì)細(xì)菌種類進(jìn)行鑒定。

1.6 菌株培養(yǎng)方法及優(yōu)化

培養(yǎng)基的優(yōu)化以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)（詳見“1.2”），對(duì)影響細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的主要因素，包括碳源、氮源、pH值以及其他條件進(jìn)行了研究。

1.6.1 不同碳源培養(yǎng)基的配制及處理

取活化后菌液，以5%接種量接種至50 mL含不同碳源（2%葡萄糖、2%果糖或2%蔗糖）的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖勻后30℃靜置培養(yǎng)7 d，按照“1.4”中的方法處理纖維素，稱重。

1.6.2 不同氮源培養(yǎng)基的配制及處理

利用“1.6.1”中優(yōu)化獲得的最佳碳源，按照“1.6.1”中的方法，分析含酵母膏（1%）、蛋白胨（1%）、酵母膏和蛋白胨（各0.5%）或氯化銨（1%）等不同氮源對(duì)纖維素產(chǎn)量的影響。

1.6.3 不同化學(xué)品培養(yǎng)基的配制及處理

以碳源和氮源優(yōu)化后的初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加1 g/L的不同的化學(xué)品，研究其對(duì)該菌株細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響。添加化學(xué)品包括：乙醇、吐溫80、MgCl2、CaCl2和檸檬酸。

1.6.4 不同初始pH培養(yǎng)基的配制及處理

采用碳源、氮源和化學(xué)品優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基初始pH值至5.0、6.0、7.0和8.0，對(duì)比不同pH對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響。

1.7 細(xì)菌纖維素膜的表征

1.7.1 細(xì)菌纖維素膜的電鏡觀察

細(xì)菌纖維素膜按照“1.4”中方法進(jìn)行處理，后經(jīng)用3%戊二醛溶液固定12 h，用pH7.0的磷酸緩沖液（0.1 mol/L）清洗3次，后分別用15%、30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇脫水20 min，無水乙醇脫水3次（30 min/次），最后用醋酸異戊酯置換2次（20 min/次），臨界點(diǎn)干燥后采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察［16-17］。

1.7.2 細(xì)菌纖維素膜的紅外分析

提純后的細(xì)菌纖維素薄膜在空氣中自然干燥，于室溫下用傅立葉紅外光譜分析儀Nicolet 6700測(cè)試其紅外光譜，掃描范圍為400 cm-1～4000 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.7.3 細(xì)菌纖維素膜的X-衍射分析

X-衍射是鑒定細(xì)菌纖維素的重要指標(biāo)之一。本研究X射線衍射采用銅鎳發(fā)射靶，波長(zhǎng)0.154 06 nm，加速電場(chǎng)36 kV，電流20 mA，干纖維素膜固定在旋轉(zhuǎn)靶上，掃描補(bǔ)償0.01o。衍射特征峰位置為布拉格角。根據(jù)布拉格公式計(jì)算出纖維素的晶體面間距（d）［18］。

1.7.4 細(xì)菌纖維素膜的綜合力學(xué)性能分析

將薄膜切成約15mm×4mm的長(zhǎng)方形樣條，用單纖維強(qiáng)力機(jī)進(jìn)行測(cè)試。拉伸速率為20mm/min，測(cè)試夾距為10mm，每個(gè)樣品測(cè)試10次。拉伸強(qiáng)度為斷裂負(fù)荷與試樣寬度和試樣厚度的比值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

采集不同類型的腐爛水果、茶水及土豆淀粉等樣品，利用新鮮的富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集，后經(jīng)過固體培養(yǎng)基涂布篩選，共獲得23株生產(chǎn)纖維素的細(xì)菌菌株。將所獲菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)7 d。挑取纖維素菌膜，按照“1.4”中的處理方法，測(cè)定纖維素的產(chǎn)量。最后，選取纖維素產(chǎn)量最高的5-2號(hào)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 菌株的16S rDNA鑒定

對(duì)5-2號(hào)菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定。將該菌株16S rDNA序列（1355 bp）提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析。結(jié)果表明，該序列與葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）16S rDNA序列的同源性為99%。5-2號(hào)菌株細(xì)胞從橢圓到桿狀、直或彎，0.6～0.8 μm × 1.0～4.0 μm，單生、成對(duì)或成鏈。有的菌體有退化體，它們呈球狀、膨大、棒狀、彎的或絲狀體，革蘭氏染色陰性。該菌株從形態(tài)、生理生化和16S rDNA的同源性等方面均與葡糖酸醋桿菌具有很高的相似度，因此將該菌株命名為G. xylinus 5-2。

2.3 菌株的培養(yǎng)方法與優(yōu)化

2.3.1 碳源對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

本研究分析了葡萄糖、蔗糖和果糖三種常見碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響（圖 1a）。結(jié)果顯示，相對(duì)于其他兩種碳源，發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為2%葡萄糖時(shí)，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量最高，達(dá)到7.24 g/L，比果糖和蔗糖分別提高23%和27%。該試驗(yàn)表明，不同碳源對(duì)G. xylinus 5-2菌株的纖維素合成量有較大的影響，葡萄糖更利于5-2菌株的纖維素的產(chǎn)出。

2.3.2 氮源對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

在確定以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步分析了酵母膏（1%）、蛋白胨（1%）、酵母膏和蛋白胨（各 0.5%）或氯化銨（1%）等常用微生物培養(yǎng)氮源對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響（圖 1b）。結(jié)果顯示，當(dāng)使用1%無機(jī)氮源氯化銨時(shí)，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量最低；氮源分別為1%蛋白胨或1%酵母膏時(shí)，纖維素的產(chǎn)量居中；氮源為0.5%酵母膏和0.5%蛋白胨復(fù)配時(shí)，細(xì)菌纖維產(chǎn)量最高，達(dá)到8.92 g/L。該產(chǎn)量比單獨(dú)使用酵母膏或蛋白胨處理提高了 20%，是氯化銨處理中細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的 5倍。該試驗(yàn)表明，不同氮源對(duì)G. xylinus 5-2菌株的纖維素合成量的影響很大，酵母膏和蛋白胨的混合組合更利于5-2菌株的纖維素的產(chǎn)出。

圖1 G. xylinus 5-2菌株細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.3 不同化學(xué)品對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

本研究進(jìn)一步分析了5種不同化學(xué)品（乙醇、吐溫80、MgCl2、CaCl2和檸檬酸）對(duì)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響（圖1c）。結(jié)果顯示，乙醇和吐溫80能夠較大幅度地提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。其中，添加1 g/L的吐溫80后，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量比空對(duì)照提高40%左右。MgCl2對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響不大，而CaCl2和檸檬酸略微抑制細(xì)菌纖維素的產(chǎn)生。乙醇對(duì)細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力的影響與已有研究相似，均能夠提高菌株的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力［19］。吐溫 80是一種常用的表面活性劑，能夠提高細(xì)菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性，推測(cè)其可能通過增強(qiáng)菌株的纖維素排出能力，提高了細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。

2.3.4 不同初始pH對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

pH不僅影響細(xì)菌中酶的催化活性，也影響細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。因此，本研究對(duì)比了初始pH分別為5.0、6.0、7.0和8.0的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響（圖1d）。試驗(yàn)表明，初始培養(yǎng)基pH為6.0時(shí)，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量最高，pH值為7.0時(shí)，次之；pH為8.0時(shí)，產(chǎn)量最低，約為pH6.0時(shí)的50%。該結(jié)果表明，pH過高或高低，均會(huì)降低細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。

綜上，本試驗(yàn)中G. xylinus 5-2菌株的纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基初步優(yōu)化為：2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母膏，0.27%Na2HPO4，1 g/L吐溫，1 g/L乙醇，0.115%檸檬酸，初始pH值為6.0。隨后，本研究以G. xylinus 5-2為發(fā)酵菌株，采用50 mL優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，在500 mL的搖瓶中發(fā)酵7 d，細(xì)菌纖維素干重提高至13.2 g/L，表明該優(yōu)化培養(yǎng)基更加適用于該菌株纖維素的產(chǎn)出。

2.4 細(xì)菌纖維素膜的表征

本研究采用掃描電鏡、紅外光譜掃描分析、X-衍射分析等方法對(duì)G. xylinus 5-2產(chǎn)出的細(xì)菌纖維素進(jìn)行了初步表征，并對(duì)其力學(xué)性能進(jìn)行了測(cè)定。

2.4.1 細(xì)菌纖維素膜的電鏡觀察

G. xylinus 5-2菌株發(fā)酵7天后，菌液表面生成明顯的膠狀菌膜，其韌性、彈性與文獻(xiàn)報(bào)道的物理特性相同，表明該菌株具有較強(qiáng)的合成纖維素能力。菌膜經(jīng)處理后，在電鏡下可觀測(cè)到明顯的纖維素網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（如圖 2所示）。單根纖維素直徑在0.1 μm～0.5 μm之間，比棉纖維直徑（＞5 μm）低一個(gè)數(shù)量級(jí)。根據(jù)掃描電鏡的觀察結(jié)果，初步確定G. xylinus 5-2菌株的合成產(chǎn)物為納米級(jí)纖維素。

圖2 G. xylinus 5-2菌株細(xì)菌纖維素的電鏡掃描結(jié)果

2.4.2 細(xì)菌纖維素膜的紅外分析

為進(jìn)一步對(duì)所獲細(xì)菌纖維素的性質(zhì)進(jìn)行確定，本研究利用紅外光譜掃描儀對(duì)G. xylinus 5-2菌株發(fā)酵產(chǎn)品的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測(cè)（如圖3所示）。譜圖數(shù)據(jù)表明，在3419 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，主要為-OH官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰，由纖維素分子間的氫鍵引起；2924 cm-1處的吸收峰由-CH2或-CH3官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)引起；在1539 cm-1和1384 cm-1處由于-CH3和-CH2的彎曲振動(dòng)出現(xiàn)了較強(qiáng)吸收峰；在1000 cm-1附近出現(xiàn)的幾個(gè)吸收峰是由于葡萄糖分子間形成的半縮醛的伸縮振動(dòng)引起。與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對(duì)，分子結(jié)構(gòu)與 cellophane（玻璃紙，一種以棉漿、木漿等天然纖維為原料制成的透明薄膜）的掃描譜圖匹配良好，匹配度達(dá)77.48%。

圖3 G. xylinus 5-2菌株細(xì)菌纖維素的紅外圖

2.4.3 細(xì)菌纖維素的X-衍射分析

隨后，本研究對(duì)所獲的纖維素膜進(jìn)行了X-衍射分析（如圖4所示）。從衍射譜圖可以看出，在2θ = 14.564、16.874、22.687處有較強(qiáng)的衍射峰，表明該纖維素為I型纖維素。三個(gè)衍射角分別對(duì)應(yīng)纖維素（1，－1，0）、（1，1，0）、（2，0，0）的三個(gè)晶面、結(jié)晶度和各個(gè)晶面的晶粒大?。ㄈ绫?所示）。

圖4 G. xylinus 5-2菌株細(xì)菌纖維素的X-衍射譜圖

表1 G. xylinus 5-2菌株細(xì)菌纖維素X-衍射分析（結(jié)晶度和晶面大小）

2.4.4 細(xì)菌纖維素膜的綜合力學(xué)性能分析

本研究對(duì)G. xylinus 5-2菌株細(xì)菌纖維素產(chǎn)品的拉伸強(qiáng)度和彈性模量進(jìn)行了測(cè)量（如表2所示）。本試驗(yàn)所獲細(xì)菌纖維素產(chǎn)品的拉伸強(qiáng)度約為12.41 MPa，彈性模量為3.38 GPa。

表2 G. xylinus 5-2菌株細(xì)菌纖維素力學(xué)性質(zhì)測(cè)定

3 結(jié)論

培養(yǎng)基的優(yōu)化對(duì)提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量具有重要的意義，是細(xì)菌纖維素產(chǎn)業(yè)化過程中的必經(jīng)階段和基礎(chǔ)。本試驗(yàn)通過利用單因子試驗(yàn)，將G. xylinus 5-2菌株的纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了初步優(yōu)化，使細(xì)菌纖維素干重提高至13.2 g/L，表明該優(yōu)化培養(yǎng)基更加適用于該菌株纖維素的產(chǎn)出。由于目前所獲數(shù)據(jù)均來源于普通搖瓶發(fā)酵水平，預(yù)示著隨著后續(xù)設(shè)備改造的優(yōu)化，纖維素產(chǎn)量還有很大的提升空間［6-8］。

在研究不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)本研究采用的5-2菌株與關(guān)曉輝等獲得的木葡糖酸醋桿菌在碳源利用效率方面存在一定差異［20］。葡萄糖是自然界中低品質(zhì)纖維素和淀粉等生物質(zhì)的主要成分。本研究中采用的G. xylinus 5-2菌株能夠利用葡萄糖為主要碳源，高效合成細(xì)菌纖維素，為生物質(zhì)的綜合高值化利用提供了一條可參考的途徑。

氮源為0.5%酵母膏和0.5%蛋白胨復(fù)配時(shí)，細(xì)菌纖維產(chǎn)量最高，達(dá)到8.92 g/L，明顯優(yōu)于其他處理。推測(cè)原因可能是酵母膏和蛋白胨的混合使用為菌株提供了更多的生長(zhǎng)因子，使其能更好地生長(zhǎng)和發(fā)酵。因此，后續(xù)放大試驗(yàn)中采用酵母膏/蛋白胨的混合組合進(jìn)行發(fā)酵。

G. xylinus 5-2發(fā)酵生成的細(xì)菌纖維素產(chǎn)品的拉伸強(qiáng)度為12.41 MPa，彈性模量為3.38 GPa。細(xì)菌纖維素的彈性模量多集中在10 MPa～130 MPa不等，而Yamanaka等最早報(bào)道了細(xì)菌纖維素干膜的彈性模量（楊氏模量）大于15 GPa［21］；后來Iguchi等對(duì)細(xì)菌纖維素進(jìn)行堿處理，使其干膜的彈性模量達(dá)到30 GPa［22］。細(xì)菌纖維素膜的力學(xué)性能與發(fā)酵菌株、培養(yǎng)基成分、發(fā)酵方式、膜的干燥方法、彈性模量測(cè)定方法等不同有關(guān)。

本研究篩選獲得了一株在生產(chǎn)效率和產(chǎn)品性能等方面都較為優(yōu)異的纖維素生產(chǎn)菌株G. xylinus 5-2。該菌株在普通搖瓶培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)出優(yōu)良的生產(chǎn)能力。推測(cè)后期通過進(jìn)一步改造該菌株的培養(yǎng)方式，在生產(chǎn)方面還有較大的提升空間。所獲得的細(xì)菌纖維素產(chǎn)品的拉伸強(qiáng)度為12.41 MPa，彈性模量為3.38 GPa，與已報(bào)道的細(xì)菌纖維素相比，具有較好的力學(xué)性能。該工作為工業(yè)化生產(chǎn)高性能細(xì)菌纖維素，拓展其在多個(gè)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 王海波. 細(xì)菌纖維素耐低溫生產(chǎn)菌株的選育及其改性的研究［M］. 山東輕工業(yè)學(xué)院碩士學(xué)位論文， 2009.

［2］ 周勝虎， 薛齊佳， 劉傳鳳， 等. 細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株的篩選和初步鑒定［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 52（15）: 3514-3517.

［3］ 譚玉靜， 洪楓， 邵志宇. 細(xì)菌纖維素在生物醫(yī)學(xué)材料中的應(yīng)用［J］. 中國(guó)生物工程雜志， 2007， 27（4）: 126-131.

［4］ 謝健健， 洪楓. 細(xì)菌纖維素發(fā)酵原料的研究進(jìn)展［J］. 纖維素科學(xué)與技術(shù)， 2011， 19（3）: 68-77.

［5］ 汪麗粉， 李政， 賈士儒， 等. 細(xì)菌纖維素性質(zhì)及應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2014， 41（8）: 1675-1683.

［6］ Hornung M， Ludwig M， Gerrard A M， et al. Optimizing the production of bacterial cellulose in surface culture: Evaluation of product movement influences on the bioreaction （Part 2）［J］. Engineering in Life Sciences， 2006， 6（6）: 546-551.

［7］ Hornung M， Ludwig M， Schmauder H P. Optimizing the productin of bacterial cellulose in surface culture: A novel aerosol bioreactor working on a fed batch principle （Part 3）［J］. Engineering in Life Sciences， 2007， 7（1）: 35-41.

［8］ Hwang J W， Yang Y K， Hwang J K， et al. Effects of pH and dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 in agitated culture［J］. Journal of Bioscience & Bioengineering， 1999， 88（2）: 183-188.

［9］ Shigematsu T， Takamine K， Kitazato M， et al. Cellulose production from glucose using a glucose dehydrogenase gene （gdh）-deficient mutant of Gluconacetobacter xylinus and its use for bioconversion of sweet potato pulp［J］. Journal of Bioscience & Bioengineering， 2005， 99（4）: 415-422.

［10］ Melo C V D， Souza-Moreira T， Valentini S R， et al. Cloning of upstream region and cellulose synthase operon genes involved in bacterial cellulose biosynthesis by Gluconacetobacter hansenii ATCC23769［J］. BMC Proceedings， 2014， 8（4）: 176.

［11］ Park J K， Jung J Y， Park Y H. Cellulose production by Gluconacetobacter hansenii in a medium containing ethanol［J］. Biotechnology Letters， 2004， 25（24）: 2055-2059.

［12］ Bae S， Shoda M. Bacterial cellulose production by fed-batch fermentation in molasses medium［J］. Biotechnology Progress，2004， 20（5）: 1366-1371.

［13］ Seto A， Yu S， Matsushige M， et al. Effective cellulose production by a coculture of Gluconacetobacter xylinus andLactobacillus mali［J］. Applied Microbiology & Biotechnology， 2006， 73（4）: 915-921.

［14］ Hu Y， Catchmark J M. Influence of 1-methylcyclopropene （1-MCP） on the production of bacterial cellulose biosynthesized by Acetobacter xylinum under the agitated culture［J］. Letters in Applied Microbiology， 2010， 51（1）: 109-113.

［15］ Putra A， Kakugo A， Furukawa H， et al. Tubular bacterial cellulose gel with oriented fibrils on the curved surface［J］. Polymer，2008， 49（7）: 1885-1891.

［16］ 毋銳琴， 杜雙奎， 李志西， 等. 細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及超微觀結(jié)構(gòu)分析［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2008， 24（6）: 1068-1074.

［17］ Czaja W， Romanovicz D， Brown R M. Structural investigations of microbial cellulose produced in stationary and agitated culture［J］. Cellulose， 2004， 11（11）: 403-411.

［18］ 周伶俐， 孫東平， 吳清杭， 等. 不同培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響［J］. 微生物學(xué)報(bào)， 2007， 47（5）: 914-917.

［19］ 張麗平， 盧紅梅， 戴銳， 等. 乙醇及有機(jī)酸對(duì)木醋桿菌合成細(xì)菌纖維素的影響［J］. 食品工業(yè)科技， 2014， 35（4）: 161-165.

［20］ 關(guān)曉輝， 尹宗杰， 魯敏， 等. 細(xì)菌纖維素發(fā)酵條件的優(yōu)化及結(jié)構(gòu)分析［J］. 中國(guó)釀造， 2010， 29（10）: 68-71.

［21］ Yamanaka S， Ishihara M， Sugiyama J. Structural modification of bacterial cellulose［J］. Cellulose， 2000， 7（3）: 213-225.

［22］ Iguchi M， Yamanaka S， Watanabe K， et al. Preparation of high-strength materials from bacterial cellulose［M］. Integration of Fundamental Polymer Science and Technology―5. Springer Netherlands， 1991.

中圖分類號(hào)：Q81

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-8405（2016）02-0077-08

DOI:10.16561/j.cnki.xws.2016.02.15

收稿日期：2016-05-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31201489）；川渝中煙優(yōu)質(zhì)煙葉原料研究與開發(fā)（川渝中煙工業(yè)公司項(xiàng)目）。

作者簡(jiǎn)介：咸 赫（1999～），男，高中，研究方向：微生物學(xué)。

* 通訊作者：劉好寶（1964～），男，博士，研究員。研究方向：煙草優(yōu)質(zhì)高效栽培理論與技術(shù)。liuhaobao@caas.cn

Isolation and Identification of a Cellulose-Producing Bacterium-Gluconacetobacter xylinus and Analysis of Its Products

XIAN He1，2， SHI Su-juan1，3， MAO Jing-jing1， Wang Qian1， LIU Hao-bao1*
（1. Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China；2. Qingdao No.9 High School， Qingdao 266012， China；3. College of Agronomy and Plant Protection， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）

Abstract:Bacterial cellulose （BC） is widely used in food industry， biomedicine， paper making， acoustic equipment and oil production for its high purity， crystallinity， mechanical strength and elastic modulus. And the aim of this study is to obtain the cellulose-producing strain. The screened bacterium was identified through morphological and physiological characterization combined with its 16S rDNA gene sequence and data analysis. The culture conditions were optimized by single factor tests， including nitrogen， carbon source， initial pH and other factors. The fermentation products were identified with Fourier transform-infrared spectrum （FT-IR），scanning electron microscope （SEM） and X-ray diffraction spectra. A cellulose-producing strain was identified and designated to be Gluconacetobacter xylinus 5-2 strain. After optimization of culture conditions， the bacterial cellulose of this stain was purified and reached to the dried weight with 13.2 g/L. The cellulose products were identified to be cellulose I by the analysis of FT-IR， SEM and X-ray diffraction spectra， with a high elastic modulus of 3.38 GPa. G. xylinus 5-2， a bacterium which is identified to be able to efficiently produce cellulose with high elastic modulus was obtained by the screening in this study. The culture conditions were optimized and its production of cellulose was qualified. The results provide data for the industrialized production of high performance bacterial cellulose.

Key words:bacterial cellulose； Gluconacetobacter xylinus； screening； biocatalysis