郭錚蕾，谷 強(qiáng)，韓 玥，徐 姍，李 偉（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 10026）

?

質(zhì)量控制圖在藍(lán)舌病競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)中的應(yīng)用

郭錚蕾，谷 強(qiáng)，韓 玥，徐 姍，李 偉
（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 10026）

摘 要：［目的］建立藍(lán)舌病競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)的質(zhì)量控制圖。［方法］采用即刻法與Levey-Jennings 常規(guī)質(zhì)控圖法結(jié)合，繪制連續(xù)20次檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)控圖。更換質(zhì)控血清批號(hào)和試劑盒批號(hào)時(shí)，采用雙質(zhì)控法對(duì)前3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果做質(zhì)控，再轉(zhuǎn)入常規(guī)質(zhì)控圖。 ［結(jié)果］用即刻法對(duì)質(zhì)控物進(jìn)行3次連續(xù)測(cè)定后，就可對(duì)第3次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，用此方法積累20次質(zhì)控物的檢測(cè)結(jié)果后，可用Excel繪制出Levey-Jennings 常規(guī)質(zhì)控圖，用以實(shí)驗(yàn)室日常質(zhì)控。若實(shí)驗(yàn)室更換質(zhì)控血清批號(hào)和試劑盒批號(hào)，采用雙質(zhì)控法對(duì)前3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果做質(zhì)控。［結(jié)論］采用雙質(zhì)控法對(duì)前3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果做質(zhì)控，改進(jìn)了即刻法只能從第3次結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控的缺點(diǎn)，加強(qiáng)了即刻法在ELISA檢測(cè)中的質(zhì)控作用。

關(guān)鍵詞：質(zhì)量控制圖；即刻法；雙質(zhì)控；ELISA；藍(lán)舌病

控制圖是對(duì)檢測(cè)過(guò)程中質(zhì)量的特征值進(jìn)行測(cè)定、記錄、評(píng)估，從而觀察檢測(cè)過(guò)程是否處于控制狀態(tài)的、采用統(tǒng)計(jì)方法設(shè)計(jì)的圖。實(shí)驗(yàn)室使用控制圖是為了預(yù)防不符合工作的發(fā)生，這是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的重要方法。CNAS- CL52：2014 《CNAS-CL01＜檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則＞應(yīng)用要求》［1］5.9.2規(guī)定，“適用時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用質(zhì)量控制圖來(lái)監(jiān)控檢測(cè)或校準(zhǔn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度”。質(zhì)量控制圖多用于實(shí)驗(yàn)室定量分析的質(zhì)量控制，在免疫學(xué)方面多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，但應(yīng)用于動(dòng)檢領(lǐng)域的ELISA方法未見(jiàn)報(bào)道。

與一般定量分析的質(zhì)控方法相比，ELISA檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控有其特殊性。ELLSA檢測(cè)試劑盒的有效期短，批號(hào)更換較頻繁，因此實(shí)驗(yàn)室在短期內(nèi)很難積累20次質(zhì)控物的檢測(cè)結(jié)果，所以對(duì)同一批號(hào)試劑在常規(guī)條件下連續(xù)檢測(cè)20次，難度大，易造成數(shù)據(jù)不足，難以做出完整的質(zhì)控圖，進(jìn)而不能即時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)監(jiān)控，失去了質(zhì)控意義。

目前，對(duì)ELISA試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控，常規(guī)上采用即刻法（Grubbs 法）和Levey-Jennings 常規(guī)質(zhì)控圖（簡(jiǎn)稱L-J圖）結(jié)合的方法［2-3］。用即刻法連續(xù)測(cè)量3次就可對(duì)第3次結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，彌補(bǔ)了L-J圖需要連續(xù)測(cè)定20次才能進(jìn)行質(zhì)控的局限，但是使用即刻法無(wú)法判斷前2次的檢測(cè)結(jié)果是否在控，而采用雙質(zhì)控法［4-5］對(duì)前3次試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，再按即刻法處理，即可達(dá)到控制的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與 試劑

酶標(biāo)儀（Multiskan FC）、洗板機(jī)（Wellwash Versa ）、藍(lán)舌病競(jìng)爭(zhēng)試劑盒（IDVET，批號(hào)656、680）。

1.2 即刻法繪制質(zhì)控圖

按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以450 nm波長(zhǎng)比色，按說(shuō)明書(shū)計(jì)算臨界值（cut-off值，CO），每個(gè)板測(cè)兩個(gè)陰性對(duì)照，CO=OD陰*0.4，每個(gè)板測(cè)兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，S=OD陽(yáng)，用S/CO值表示質(zhì)控值，從第3次測(cè)量開(kāi)始用“即刻法”對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，計(jì)算3次S/CO值的均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），再計(jì)算SI上限和SI下限，查SI值表判斷質(zhì)控結(jié)果有無(wú)失控［6］，按照Grubbs剔除異常值的方法［6］，若結(jié)果處于“告警”或“失控”狀態(tài)應(yīng)舍去，并重新測(cè)定質(zhì)控血清；若結(jié)果處于控制范圍內(nèi)，繼續(xù)檢測(cè)并計(jì)算，積累20次測(cè)定結(jié)果后，用Excel畫(huà)出L-J質(zhì)控圖。具體做法是：

在Excel中輸入20次測(cè)量的OD陽(yáng)、OD陰，用AVERAGE函數(shù)公式計(jì)算D陽(yáng)、D陰，編輯函數(shù)公式，計(jì)算CO值和S/CO值。從第3次的測(cè)量結(jié)果開(kāi)始，用AVERAGE函數(shù)計(jì)算S/CO的平均值（），用SDTV函數(shù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（s）。從第3次的測(cè)量結(jié)果開(kāi)始，用MAX函數(shù)和MIN函數(shù)分別計(jì)算最大值和最小值。編輯函數(shù)（xmax-）/s計(jì)算SI上限，編輯函數(shù)（-xmin）/s計(jì)算SI下限。根據(jù)SI值表，用IF函數(shù)編輯上限結(jié)果和下限結(jié)果的在控狀態(tài)，當(dāng)SI上限和SI下限均小于n2s時(shí)，表示結(jié)果“在控”；當(dāng)SI上限或SI下限處于n2s和n3s之間時(shí)，表示結(jié)果“告警”；當(dāng)SI上限或SI下限大于n3s時(shí)，表示結(jié)果“失控”。處于“告警”和“失控”狀態(tài)的數(shù)值應(yīng)舍去。

以測(cè)量次數(shù)作為橫坐標(biāo)、以S/CO值作為縱坐標(biāo)，用Excel繪制L-J常規(guī)質(zhì)控圖，系列分別選擇“質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)（S/CO）” “上控制限UCL（+3s）” “UWL上警戒限（+2s）” “中心線CL（）” “下警戒限LWL （-2s）” “LCL下控制限（-3s）”。設(shè)置縱坐標(biāo)的最大值為+4s、最小值為—x-4s、主要刻度單位為s值、次要刻度單位為s/10的值。

表1 SI值表

1.3 雙質(zhì)控法繪制質(zhì)控圖

在更換質(zhì)控血清批號(hào)時(shí)，將新批號(hào)的質(zhì)控血清在舊批號(hào)質(zhì)控血清即將結(jié)束使用時(shí)與舊批號(hào)質(zhì)控血清一起測(cè)定3次，也就是在同一酶標(biāo)板上分別加新、舊批號(hào)的質(zhì)控血清。舊批號(hào)質(zhì)控血清數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)上一質(zhì)控圖計(jì)算，新批號(hào)血清的質(zhì)控結(jié)果按即刻法分析。在更換試劑盒批號(hào)時(shí)，在舊批號(hào)的試劑盒即將結(jié)束使用時(shí)將新批號(hào)試劑盒的部分孔位與舊批號(hào)試劑盒同時(shí)測(cè)定3 次，兩種試劑盒均加入同一批號(hào)的質(zhì)控血清，舊批號(hào)試劑盒的質(zhì)控結(jié)果點(diǎn)進(jìn)質(zhì)控圖，新批號(hào)血清的質(zhì)控結(jié)果按即刻法分析。

2 結(jié)果

2.1 即刻法繪制質(zhì)控圖

從表2中看出，第4次和第5次數(shù)據(jù)出現(xiàn)了“失控”的情況。按照Grubbs法剔除異常值，將第4次的測(cè)量結(jié)果剔除掉后，以下的測(cè)量結(jié)果均在控。剔除異常值后的測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表3，畫(huà)L-J質(zhì)控圖，如圖1所示。

表2 即刻法所得20次測(cè)量結(jié)果及數(shù)值在控狀態(tài)

根據(jù)控制圖的判斷原則［7］，未出現(xiàn)判穩(wěn)準(zhǔn)則和判異準(zhǔn)則中的以下異常情況：21個(gè)點(diǎn)中有1點(diǎn)落在3s以外；連續(xù)9點(diǎn)落在中心線同一側(cè)；連續(xù)6點(diǎn)遞增或遞減；連續(xù)14點(diǎn)中的相鄰點(diǎn)交替上下；連續(xù)3點(diǎn)中的2點(diǎn)落在中心線同一側(cè)2s以外；連續(xù)5點(diǎn)中的4點(diǎn)落在中心線同一側(cè)1s以外；連續(xù)15點(diǎn)落在中心線兩側(cè)的1s以內(nèi)；連續(xù)8點(diǎn)落在中心線兩側(cè)，且無(wú)一在1s以內(nèi)。因此，本批次20次質(zhì)控值建立起的質(zhì)控圖是有效的。

2.2 雙質(zhì)控法繪制質(zhì)控圖

2.2.1 兩種批號(hào)質(zhì)控血清雙質(zhì)控法的結(jié)果見(jiàn)表3，舊批號(hào)40～42 次的質(zhì)控血清與新批號(hào)1～3 次的質(zhì)控血清對(duì)應(yīng)同板試驗(yàn)。

2.2.2 兩種批號(hào)試劑盒雙質(zhì)控法結(jié)果見(jiàn)表4，舊批號(hào)試劑盒31～33次與新批號(hào)試劑盒1～3 次對(duì)應(yīng)同批質(zhì)控血清試驗(yàn)。

表3 Grubbs法剔除異常值后的20次測(cè)量結(jié)果

3 討論

在檢測(cè)工作中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制是降低實(shí)驗(yàn)誤差、保證檢測(cè)質(zhì)量的重要手段。對(duì)于定量檢測(cè)項(xiàng)目，大多采用Levey-Jenings質(zhì)控方法或Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法繪制質(zhì)控圖。免疫學(xué)很多檢測(cè)項(xiàng)目采用ELISA法定性，但因手工法和半自動(dòng)化等特點(diǎn)導(dǎo)致其難以標(biāo)準(zhǔn)化，且檢測(cè)頻次低、試劑盒有效期短、批號(hào)更換頻繁，因此ELISA試驗(yàn)的質(zhì)控圖多采用即刻法與常規(guī)質(zhì)控圖結(jié)合的方法。

圖1 藍(lán)舌病競(jìng)爭(zhēng)ELISA質(zhì)控圖

圖2 藍(lán)舌病競(jìng)爭(zhēng)ELISA舊批次質(zhì)控血清24～42次質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)質(zhì)控圖

表4 不同批次質(zhì)控血清質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)

表5 不同批次試劑盒質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)

圖3 藍(lán)舌病競(jìng)爭(zhēng)ELISA舊批次試劑盒15～33次質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)質(zhì)控圖

不同于定量檢測(cè)項(xiàng)目選取被測(cè)性能在重復(fù)試驗(yàn)中相對(duì)穩(wěn)定的值作為特征值，免疫學(xué)試驗(yàn)中臨界于cut-off值（CO值）的低值弱陽(yáng)性質(zhì)控物是質(zhì)控的關(guān)鍵，低值弱陽(yáng)性-臨界值血清是質(zhì)控精密度觀測(cè)的最敏感的窗口，也是提示試驗(yàn)是否成功的標(biāo)識(shí)，因此選擇S/CO值作為質(zhì)控的特征值。

Grubbs法是一種離群值檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法，一組測(cè)定值中的明顯偏離測(cè)定值群體的過(guò)大或過(guò)小值稱為離群值，其既可能是測(cè)定結(jié)果隨機(jī)波動(dòng)的極值，也可能是與群體測(cè)定值非屬同質(zhì)總體的異常值。如果事先給定一個(gè)小概率事件臨界點(diǎn)作為隨機(jī)因素影響的最大波動(dòng)值（即SI界值表），那么凡是測(cè)定偏差超過(guò)臨界值的離群值將被視為異常值，反之被視為極值加以保留。使用即刻法在出現(xiàn)“告警”或“失控”值時(shí)，對(duì)于結(jié)果的取舍有兩種意見(jiàn)，一是出現(xiàn)“告警”或“失控”值時(shí)，剔除末次測(cè)定值；二是出現(xiàn)“告警”或“失控”值時(shí)，剔除最大偏離值。Grubbs法用公式SI上限=（Xmax-）/s，SI下限=（-Xmin）/s計(jì)算SI上限和SI下限值，然后與臨界值表（即SI值表）進(jìn)行比較，以判斷臨界值是否為異常值，因此Grubbs法是判斷一組測(cè)定值中的極大或極小值是“在控極值”還是“異常值”的方法，不能用末次測(cè)定值作為異常值。

在表2中，從第4次測(cè)定結(jié)果開(kāi)始，連續(xù)出現(xiàn)了2個(gè)“失控” 值，由于第4次的測(cè)量結(jié)果與前3次比是最大值，第4次極值引發(fā)了第5次測(cè)量值的失控，因此剔除了第4次極大值后，以下結(jié)果均變?yōu)椤霸诳亍薄?/p>

由于即刻法是從當(dāng)天和以前的所有測(cè)定值中找出最大值和最小值，因此在測(cè)定次數(shù)較少時(shí)，用即刻法有些離群值不一定會(huì)顯示失控，但隨著測(cè)定次數(shù)的增加，測(cè)定值逐漸趨于穩(wěn)定，這時(shí)之前的離群值就會(huì)暴露顯示為“告警”或“失控”，因此Grubbs法判斷異常值有一定的滯后性，也被稱為“回顧性失控檢出”。即刻法的另一個(gè)缺點(diǎn)是結(jié)果容易受到前3個(gè)測(cè)定值的影響，因?yàn)樵诮y(tǒng)計(jì)學(xué)中，樣本量少時(shí)易出現(xiàn)抽樣誤差。因此會(huì)出現(xiàn)即刻法未檢出失控值，但是用L-J質(zhì)控圖分析時(shí)發(fā)生失控的現(xiàn)象，這是由于前3次質(zhì)控結(jié)果精密度差引起的。因此在質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)較多的情況下，L-J質(zhì)控圖法優(yōu)于即刻法，所以在20次測(cè)定結(jié)果完成后，應(yīng)及時(shí)制作L-J質(zhì)控圖進(jìn)行分析。

由于即刻法是從第3次測(cè)定才開(kāi)始進(jìn)行質(zhì)控，雙質(zhì)控法就解決了前2次結(jié)果無(wú)法進(jìn)行質(zhì)控的問(wèn)題。從表4、表5和圖2、圖3中可以看出，原試劑盒和原血清均處于“在控”狀態(tài)，這也就說(shuō)明所換試劑盒和質(zhì)控血清的前3次結(jié)果也處于“在控”狀態(tài)，保證了即刻法的所有結(jié)果處于連續(xù)可靠狀態(tài)。在免疫學(xué)檢測(cè)中，不同批號(hào)試劑盒，甚至同一批號(hào)試劑盒的不同板次所檢測(cè)的樣品或質(zhì)控血清的OD值都會(huì)有一定的差異，不同批次質(zhì)控血清的試驗(yàn)結(jié)果也不一定一樣，在更換試劑盒或質(zhì)控血清時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果常處于不穩(wěn)定狀態(tài)，且ELISA 試驗(yàn)的影響因素較多，因此更需要建立有效的質(zhì)控分析。此前，ELISA試驗(yàn)質(zhì)控圖多用在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上，如HBsAg的初篩、抗HIV的初篩等，在動(dòng)物檢疫領(lǐng)域中尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將ELISA試驗(yàn)質(zhì)控圖初試于動(dòng)檢領(lǐng)域的藍(lán)舌病毒檢測(cè)上，為動(dòng)檢領(lǐng)域其它疫病的ELISA檢測(cè)提供了質(zhì)控方法的參考。但是，目前還沒(méi)有ELISA檢測(cè)的確切質(zhì)控方法，因此以藍(lán)舌病為初探的質(zhì)控圖方法有待于在動(dòng)檢領(lǐng)域的進(jìn)一步驗(yàn)證和擴(kuò)展。

參考文獻(xiàn)：

［1］中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS-CL 52：2014 CNAS-CL01《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》應(yīng)用要求［Z］.北京：2014.

［2］鄭懷競(jìng).免疫學(xué)檢驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)與室內(nèi)質(zhì)控［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：38-61.

［3］丁海明，潘婉儀.ELISA定性實(shí)驗(yàn)“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控的評(píng)價(jià)與應(yīng)用［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（3）：28-30.

［4］李天君，趙鋒，田慶華等.“雙質(zhì)控法”用于ELISA試驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控的探討［J］.中國(guó)輸血雜志，2004，17（6）：443-444.

［5］段惠玲，李忠俊，滕本秀.應(yīng)用“雙質(zhì)控法”加強(qiáng)“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2006，35（11）：971-974.

［6］中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋正態(tài)樣本離群值的判斷和處理：GB/T 4843-2008［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［7］國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.常規(guī)控制圖：GB/T4091-2001［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Application of Quality Control Chart for Detection of Bluetongue Disease Virus by Competitive ELISA

Guo Zhenglei，Gu Qiang，Han Yue，Xu Shan，Li Wei
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026 ）

Abstract ：［Objective］ To establish the quality control chart for detecting bluetongue virus by competitive ELISA.［Methods］The instant method with Levey-Jennings routine quality control chart method was applied to draw an instant-added L-J quality control chart after 20 results were accumulated.While making changes of agent batch number or quality control serum，the double quality control method was used to control the fi rst three detection results and then the routine quality control chart method was used to control the subsequent results.［Results］The three primary quality control data were calculated statistically by instant method.The instant-added L-J quality control chart could be drawn by Excel software after 20 datas were accumulated.While making changes of agent batch number or quality control serum，the double quality control method was used to control the fi rst three results.［Conclusion］The double quality control method solved the problem of uncontrolled test results in the initial times with the instant method and strengthened the quality control with the instant method in ELISA test.

Key words：quality control chart；instant method；double quality control；ELISA；bluetongue

中圖分類號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）02-0077-05

基金項(xiàng)目：質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015IK009）——質(zhì)量控制圖在動(dòng)檢血清學(xué)檢測(cè)應(yīng)用的示范性研究