楊發(fā)忠++董智森++肖春

摘要：采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-OES）法測(cè)定了中國(guó)月季感染白粉菌前后礦質(zhì)元素種類和含量的變化。測(cè)定的16種礦質(zhì)元素，從健康中國(guó)月季中都能檢出；而從感病后的中國(guó)月季中僅有14種檢出，并且含量發(fā)生了明顯變化。感病后K、Ca、Mg、Si、Na、Se等元素含量顯著降低，其中Si含量降低程度最大，為62.62%；而Al、Cu含量增加程度最大，分別為810.71%、656.20%，且Al的含量高達(dá)528.12 μg/g。結(jié)果表明，白粉菌侵染誘導(dǎo)了中國(guó)月季生理生化發(fā)生變化。分析了白粉菌侵染中國(guó)月季后對(duì)中國(guó)月季上昆蟲甜菜夜蛾產(chǎn)生抑制作用的原因。研究結(jié)果為病蟲互作關(guān)系及其互作機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：月季白粉菌；中國(guó)月季；礦質(zhì)元素；ICP-OES；病蟲互作關(guān)系

中圖分類號(hào)： S436.8+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0304-03

收稿日期：2015-05-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31160354）。

作者簡(jiǎn)介：楊發(fā)忠（1974—），男，云南楚雄人，博士，副教授，主要從事化學(xué)生態(tài)學(xué)的研究。E-mail：yangfazhong105@163.com。

通信作者：肖春，博士，教授，主要從事昆蟲行為與化學(xué)生態(tài)學(xué)研究。E-mail：xiaochune@yeah.net。已有較多的研究表明，在植物病原菌—寄主植物—昆蟲組成的三元系統(tǒng)中，存在著寄主植物介導(dǎo)間接的病蟲相互作用[1-4]。其中，植物病原菌侵染寄主植物會(huì)對(duì)共享寄主的昆蟲造成不利影響。研究已經(jīng)證明中國(guó)月季感染月季白粉菌后，對(duì)中國(guó)月季上的甜菜夜蛾產(chǎn)生不利影響[5]，但是對(duì)影響機(jī)制研究還未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。研究寄主植物介導(dǎo)間接的病蟲互作關(guān)系的植物保護(hù)學(xué)家根據(jù)所得相關(guān)結(jié)果進(jìn)行推測(cè)，病害對(duì)蟲害的影響與植物病原菌誘導(dǎo)植物生理生化代謝變化有著直接的關(guān)系[1]。顯然，植物染病后體內(nèi)礦質(zhì)元素種類和含量變化正是植物代謝變化的一個(gè)重要方面。

各種礦質(zhì)元素對(duì)昆蟲維持正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要性已眾所周知。進(jìn)行昆蟲人工飼養(yǎng)所用人工飼料中需要加入韋氏鹽來(lái)提供所需的礦質(zhì)元素[6]，起到“保生長(zhǎng)”的重要作用。如果人工飼料中沒(méi)有加入適量的各種礦質(zhì)元素，即使其他各種營(yíng)養(yǎng)成分合適，昆蟲也無(wú)法正常生長(zhǎng)發(fā)育和繼代繁殖。

中國(guó)月季感染白粉菌后甜菜夜蛾幼蟲取食量下降，蛹重減輕，幼蟲歷期延長(zhǎng)，幼蟲死亡率提高，表明白粉菌對(duì)甜菜夜蛾有明顯的抑制作用[5]。本研究采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-OES）法對(duì)中國(guó)月季感染白粉菌后各種礦質(zhì)元素種類和含量的變化進(jìn)行測(cè)定，以期明確白粉菌對(duì)甜菜夜蛾的不利影響以及感染白粉菌后礦質(zhì)元素變化，從而為病蟲互作關(guān)系[1]的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試植物中國(guó)月季幼苗以及所需月季白粉菌均采自云南省昆明市呈貢區(qū)斗南花卉基地種植中國(guó)月季的大棚中。

1.2儀器與試劑

電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-OES）儀，美國(guó)VARIAN公司生產(chǎn)，型號(hào)VISTA-MPX CCD Simultaneous ICP-OES；波長(zhǎng)范圍175～785 nm全覆蓋，完全無(wú)斷點(diǎn)；焦距 0.4 m，中階梯光柵刻線97.4線/mm；RF發(fā)生器頻率40.68 MHz；等離子體輸出功率700～1 700 W；等離子體冷卻氣0～22.5 L/min可調(diào)。

Ca、Na、K、Mg、Co、P、Si、B、Fe、Al、Mn、Cu、Zn、Cr、Pb、Se 16種標(biāo)準(zhǔn)貯備液購(gòu)自國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院，均為1 000 μg/mL，介質(zhì)為5% HNO3、HClO4、HCl、氫氟酸、過(guò)氧化氫等，均為分析純，超純水配制。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1中國(guó)月季栽培將采回的健康無(wú)病蟲害的中國(guó)月季幼苗用基質(zhì)在溫室中栽培，進(jìn)行適時(shí)澆水、施肥、防治病蟲害等正常管理。培育條件為溫度27 ℃，濕度70%，光周期 12 h。未接種白粉菌的植株在試驗(yàn)前、試驗(yàn)中、試驗(yàn)后均未出現(xiàn)白粉病癥狀。

1.3.2白粉菌接種從采回的帶有白粉菌的中國(guó)月季葉片上用軟毛刷輕輕將孢子刷下，并用無(wú)菌水配制成混懸液，再用軟毛刷蘸取混懸液均勻刷在溫室中的中國(guó)月季葉片上，置于光線充足、相對(duì)濕度為90%、溫度27 ℃、光周期12 h條件下培養(yǎng)，17 d后大量萌發(fā)，用于試驗(yàn)。用作對(duì)照的健康中國(guó)月季植株在另一溫室中相同條件下培育，且從未表現(xiàn)出任何感病癥狀。

1.3.3樣品處理從溫室中采集健康無(wú)病蟲害的中國(guó)月季葉片樣品和感染白粉菌且無(wú)其他病蟲害的中國(guó)月季葉片樣品。參考王小平等的方法[7-8]稍有改動(dòng)，分別用去離子水洗凈，風(fēng)干，研細(xì)后過(guò)120目篩，精確稱取樣品0.500 0 g，置于高壓消化罐中，加5 mL濃HNO3，放置10 h，再加1 mL濃HNO3、1 mL H2O2、0.5 mL HF，調(diào)節(jié)消化溫度至180 ℃消化 5 h。去除密封裝置，將溶液緩慢加熱至干。再向殘?jiān)屑尤? mL濃HClO4，緩慢加熱至冒白煙，以驅(qū)除多余的F-。稍冷卻后加入2 mL濃HNO3，緩慢加熱至殘?jiān)咳芙猓芤鹤優(yōu)闊o(wú)色。冷卻后定容至50 mL待測(cè)。相同方法進(jìn)行全程空白試驗(yàn)。

1.3.4礦質(zhì)元素含量測(cè)定電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）測(cè)定礦質(zhì)元素種類和含量。工作條件：射頻功率1.0 KW；等離子氣流量15.0 L/min；輔助氣流量1.50 L/min；霧化器壓力200.00 kPa；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速15 r/min；讀數(shù)時(shí)間 10.0 s；進(jìn)樣延時(shí)15.0 s；清洗時(shí)間10.0 s。根據(jù)譜線的靈敏度和受干擾情況來(lái)確定礦質(zhì)元素分析譜線，選擇譜線間干擾小、精密度好的元素分析線，每種元素選取2～3條特征譜線進(jìn)行測(cè)定，最終選擇了適合中國(guó)月季植物樣品微量元素測(cè)定的分析譜線（表1）。并按選定波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定葉片組織中的16種礦質(zhì)元素。健康、感病中國(guó)月季葉片分別測(cè)定，重復(fù)4次，取平均值。

1.3.5測(cè)量精度用標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的溶液進(jìn)樣4次，以平均吸收強(qiáng)度對(duì)各元素濃度做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程，并獲得相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)。利用所得回歸方程，根據(jù)植物樣品測(cè)定的各元素吸收值計(jì)算出樣品中各元素的含量。

1.3.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)礦質(zhì)元素含量測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 21.0 （IBM-SPSS，Chicago，IL，USA）中的t檢驗(yàn)進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程

不同礦質(zhì)元素工作曲線回歸方程測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。16種元素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)在0.999～1.000之間，所得回歸方程穩(wěn)定可靠，可獲得較高的準(zhǔn)確度，且能多元素同時(shí)測(cè)定。此方法適合于中國(guó)月季植物樣品中各相關(guān)元素的測(cè)定，亦可用于其他植物樣品中相關(guān)礦質(zhì)元素的測(cè)定。

2.2感染白粉菌前后中國(guó)月季葉片礦質(zhì)元素種類和含量變化

采用ICP-OES法測(cè)定了感染白粉菌前后中國(guó)月季葉片材料中礦質(zhì)元素種類、含量及其變化（表3）。健康中國(guó)月季中共檢測(cè)出16種元素，按含量從大到小依次順序?yàn)椋篕、Ca、Mg、P、Si、Fe、Na、Al、Mn、Zn、B、Cr、Pb、Se、Cu、Co；而在感染白粉菌后的中國(guó)月季中則總共檢測(cè)出14種元素，含量從大到小依次順序?yàn)椋篕、Ca、Mg、P、Al、Fe、Mn、Si、Na、Zn、B、Cu、Pb、Se。結(jié)果表明，中國(guó)月季感病后多種礦質(zhì)元素含量發(fā)生變化，但從種類上看，感病后只有Cr、Co 2種微量元素未檢測(cè)出。

由表3可見(jiàn)，中國(guó)月季感染白粉菌后，在測(cè)定的16種元素中K、Ca、Mg、Si、Na、Pb、Se、Cr、Co共9種元素含量降低，只有Fe、Al、Mn、B、Zn、Cu含量升高，并且升高輻度相對(duì)較小，絕對(duì)含量不高。含量降低的元素主要是對(duì)植物生命代謝重要的元素，其中K、Ca、Mg、Na、Si為大量元素，含量降低的程度均很大。其中，含量最大的K元素從11 055.54 μg/g下降至 7 062.80 μg/g，下降了36.12%；Si也下降了62.62%，下降程度最大，表明中國(guó)月季感染白粉菌后生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝受到較大影響。

3討論

相關(guān)研究業(yè)已證明，中國(guó)月季感染白粉菌后對(duì)中國(guó)月季植株上的昆蟲甜菜夜蛾造成了不利影響，使甜菜夜蛾幼蟲取食量下降，同時(shí)還使蛹重減輕，幼蟲歷期延長(zhǎng)，幼蟲死亡率提高等[5]。其他植物病原菌侵染寄主植物也會(huì)對(duì)共享寄主的昆蟲造成不利影響[1-2]。但是，專門針對(duì)病害對(duì)蟲害的影響機(jī)制的研究還未見(jiàn)報(bào)道。植物病原菌通過(guò)寄主植物介導(dǎo)作用對(duì)昆蟲造成不利影響的原因是多方面的，其中寄主植物受到植物病原菌侵染后誘導(dǎo)植物體內(nèi)生理生化代謝變化是主要原因[9]，包括植物體內(nèi)礦質(zhì)元素種類和含量的變化，是對(duì)昆蟲造成不利影響的重要原因之一。

本研究結(jié)果表明，礦質(zhì)元素含量在中國(guó)月季感染白粉菌后發(fā)生了明顯的變化。K、Ca、Mg、Na等元素為昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育所必需，在感病后含量顯著降低。在飼養(yǎng)昆蟲所用的人工飼料中，這些元素是通過(guò)加入韋氏鹽的方式來(lái)提供，若人工飼料中缺乏這些元素，則昆蟲難以繼代繁殖，表明礦質(zhì)元素種類和含量對(duì)昆蟲維持正常生長(zhǎng)發(fā)育起到關(guān)鍵作用[6]。表明中國(guó)月季感染白粉菌后礦質(zhì)元素種類和含量發(fā)生變化，是導(dǎo)致甜菜夜蛾幼蟲取食量下降的重要原因之一。

感病后Mg元素含量減少明顯。采樣過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，感染白粉菌后中國(guó)月季葉片失綠的現(xiàn)象普遍，與Mg元素含量減少結(jié)果相吻合。可能是白粉菌侵染導(dǎo)致Mg代謝失衡，對(duì)該元素的吸收減少；同時(shí)也可能是在感病后，植物啟動(dòng)了細(xì)胞程序性死亡程序，將Mg有計(jì)劃地轉(zhuǎn)移至其他未感病部位加以利用。感病后Si元素減少的程度在所有元素中是最大的，與感病前相比減少了62.62%。植物缺乏Si元素，則抗病性下降，易倒伏[10]。Mg、Si含量下降是否與昆蟲取食量下降有關(guān)仍然未知，還沒(méi)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

感染白粉菌后中國(guó)月季葉片內(nèi)Al元素含量增加了 810.71%，在所有元素中增幅最大，且絕對(duì)量也非常大，達(dá)到528.12 μg/g。該元素增加以及絕對(duì)量大，是否會(huì)對(duì)甜菜夜蛾的取食量產(chǎn)生影響，是值得深入研究的問(wèn)題。顏斐等研究表明，Al含量過(guò)高能引起渦蟲Dugesia japonica（渦蟲綱，不屬于節(jié)肢動(dòng)物）死亡[11]。在鱗翅目昆蟲的人工飼料中添加韋氏鹽[6]，其中含Al，但其在人工飼料中含量?jī)H為0.16 μg/g，表明要維持昆蟲正常生長(zhǎng)發(fā)育所需Al量很少，即使是健康中國(guó)月季中的Al含量也高于此值。Al不是植物生長(zhǎng)和昆蟲生長(zhǎng)的必需元素。Cu元素含量在感染白粉菌后也顯著增加，Al、Cu元素對(duì)昆蟲有著很強(qiáng)的毒性，推測(cè)2種元素含量的增加可能與感染白粉菌后甜菜夜蛾幼蟲的取食量減少有關(guān)，這2種元素含量增加不利于昆蟲取食。這可能也是中國(guó)月季感病后對(duì)甜菜夜蛾具有明顯抑制作用的原因之一。Mn元素含量增加可能對(duì)甜菜夜蛾幼蟲取食也有影響。

Al元素含量超標(biāo)對(duì)各種動(dòng)植物都有毒害作用[12-14]。目前，還沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)說(shuō)明Al含量達(dá)到多大數(shù)值會(huì)對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)明顯影響。為什么中國(guó)月季感染白粉菌后Al元素含量會(huì)發(fā)生很大變化，以及該元素在植物抗病性方面的作用，或者說(shuō)Al可能是白粉菌侵染寄主過(guò)程中的一種重要元素，白粉菌需要通過(guò)主動(dòng)改變寄主中Al含量才能成功實(shí)現(xiàn)入侵，上述問(wèn)題將開(kāi)展進(jìn)一步深入研究。

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