霍如雪 劉振寧 楊青 +王光全

摘要：多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）屬于一個(gè)大的水解酶家族，它通過(guò)降解果膠在植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞分離事件中發(fā)揮重要作用。為深入研究桃PG基因家族的功能，利用生物信息學(xué)方法對(duì)桃基因組中PG基因家族成員進(jìn)行鑒定，對(duì)其基因和蛋白特征、保守結(jié)構(gòu)域、基因進(jìn)化樹(shù)分類(lèi)和基因表達(dá)模式等方面進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在桃基因組中共鑒定出了84個(gè)PG基因，可以聚類(lèi)成7個(gè)分支A～G；PG基因在8條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，并存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，共發(fā)現(xiàn)16個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇；利用 UniGene 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的組織表達(dá)分析。說(shuō)明有 10 個(gè)基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中有表達(dá)數(shù)據(jù)，其中有6個(gè)基因具有組織表達(dá)特異性。

關(guān)鍵詞：桃；多聚半乳糖醛酸酶；基因家族；生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)： S662.103文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0033-08

多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，具有水解酶性質(zhì)，廣泛存在于細(xì)菌、真菌和植物中。PG大約在52年以前被鑒定，并被證明參與到植株生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)時(shí)期中果膠的降解。在降解果膠的諸多酶類(lèi)中，PG屬于其中最大的水解酶家族。目前，已經(jīng)在擬南芥、水稻、楊樹(shù)、白菜、黃瓜、甜瓜、卷柏、小立碗蘚等物種中對(duì)其基因家族進(jìn)行了鑒定，并在進(jìn)化上進(jìn)行了分析[1-8]。PG從性質(zhì)上主要分成3種，即內(nèi)切PG、外切PG、鼠李糖PG。根據(jù)不同的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，不同研究者將PG聚類(lèi)為不同的亞類(lèi)。擬南芥A～F等6類(lèi)中的PG基因在表達(dá)模式上存在差異，有些亞類(lèi)的成員趨向于在營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)，而有些則趨向于在生殖器官中表達(dá)[8]。不同亞類(lèi)的PG可能具有獨(dú)特的生物學(xué)功能。Park 等認(rèn)為，A類(lèi)和B類(lèi)含有陸生植物的PG基因，E類(lèi)含有從藻類(lèi)到開(kāi)花植物的PG基因，而C、D、F類(lèi)則只含有開(kāi)花植物的PG基因[8]。對(duì)水稻、楊樹(shù)、苔蘚、小立碗蘚和擬南芥5個(gè)物種中的225個(gè)PG的研究表明，A類(lèi)和B類(lèi)為內(nèi)切PG，C類(lèi)和D類(lèi)為外切PG，E類(lèi)為鼠李糖PG，而F類(lèi)的成員不能被歸類(lèi)于不同性質(zhì)PG中的任何一種[6]。

根據(jù)Hadfield等對(duì)植物PG功能的分類(lèi)，PG可以分為三大類(lèi)，與果實(shí)成熟相關(guān)的PG、與器官脫落相關(guān)的PG、與花粉發(fā)育相關(guān)的PG[9]。研究表明，cpPG1和木瓜果肉軟化有關(guān)，cpPG1在木瓜中的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)果肉的軟化[10]。Roongsattham等在油棕果實(shí)成熟和脫落的過(guò)程中鑒定出14個(gè)PG基因，這些基因均在果實(shí)成熟時(shí)基部的脫落區(qū)表達(dá)[11]。RDPG1是油菜中的一個(gè)PG基因，主要在果莢和花藥的開(kāi)裂區(qū)表達(dá)，并且在花器官的脫落區(qū)、花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中的花柱組織、莖和花梗的節(jié)點(diǎn)中表達(dá)，表明RDPG1可能與器官脫落有關(guān)[12]。在擬南芥花粉發(fā)育過(guò)程中，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂形成四分體小孢子，研究發(fā)現(xiàn)，PG基因[WTBX][STBX]QRT3[WTBZ][STBZ]參與了四分體小孢子的分離。在花粉發(fā)育的早期，[WTBX][STBX]QRT3[WTBZ][STBZ]由絨氈層分泌降解四分體小孢子周?chē)幕ǚ勰讣?xì)胞壁，從而使得四個(gè)小孢子能夠正常分離[13]。

桃（Prunus persica）是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，是世界上廣泛栽培的落葉果樹(shù)之一[14]。與薔薇科木本植物如李和酸櫻桃等多倍體果樹(shù)相比，桃是二倍體（n=8 ），具有相對(duì)較小的基因組（230 Mbp），而且具有相對(duì)短的童期（2～3年），這些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)使得桃成為李屬及其他薔薇科植物的模式基因組物種[15]。桃基因組測(cè)序的完成和序列釋放[16]使得在全基因組水平上對(duì)桃的重要功能基因的發(fā)掘比較和功能研究成為可能。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)桃PG基因家族成員進(jìn)行了鑒定和基因組注釋?zhuān)治隽似浠蚪Y(jié)構(gòu)和保守域，以期為進(jìn)一步對(duì)桃PG家族基因的功能研究提供基礎(chǔ)信息并最終在分子水平上對(duì)桃品種的改良提供明確的候選基因。

1材料與方法

1.1桃PG基因家族的鑒定

首先，利用擬南芥PG蛋白的氨基酸序列作為種子序列在桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_ version 2.0）[16]中BlastP比對(duì)搜索。其次，為保證候選基因沒(méi)有被遺漏，又利用搜索到的PG蛋白的氨基酸序列對(duì)桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行2次BLASTP比對(duì)搜索。最后，利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.janelia.org/）、SMART數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析候選蛋白的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)候選蛋白的氨基酸序列是否至少具有一個(gè)PG的保守結(jié)構(gòu)域（SPNTDGI、GDDC、CGPGHGISIGSLG和RIK）進(jìn)行候選PG基因的篩選和鑒定。除上述方法獲得的PG基因外，還包括[WTBX][STBX]At4g20050（QRT3[WTBZ][STBZ]）[13]，該基因雖然不含有PG基因的任何一個(gè)結(jié)構(gòu)域，但是它已經(jīng)被證明為PG基因。因此，[WTBX][STBX]At4g20050[WTBZ][STBZ]基因在桃基因組中的同源基因單獨(dú)用BLASTP搜索獲得。

1.2桃PG基因的基因組信息和染色體定位

桃PG基因的序列和基因組信息通過(guò)桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，并根據(jù)每一個(gè)PG基因在染色體上的精確位置和染色體的長(zhǎng)度使用Photoshop軟件將PG基因人工定位到對(duì)應(yīng)的染色體上。

1.3桃PG蛋白的生理生化分析

PG蛋白的分子量和等電點(diǎn)通過(guò)（Compute pI/Mwsoftware （http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）[17]來(lái)預(yù)測(cè)，信號(hào)肽序列通過(guò)SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[18]分析。

[BT2+*5]1.4桃PG基因的結(jié)構(gòu)分析、保守域分析和進(jìn)化樹(shù)分析

GSDS網(wǎng)站（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）[19]用來(lái)分析PG基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。在線的MEME軟件（http：//meme.sdsc.edu/meme/meme.html）[20]用來(lái)鑒定PG蛋白的氨基酸序列中的基序。Clustal X軟件用來(lái)對(duì)PG蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。對(duì)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，首先利用MEGA 50軟件（http：//www.megasoftware.net/）自帶的Clustal W應(yīng)用對(duì)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，空格罰分設(shè)置為10，空格擴(kuò)展罰分設(shè)置為0.2。然后將比對(duì)好的序列利用MEGA 50軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)使用鄰接法構(gòu)建，采用泊松校正，成對(duì)刪除和1 000次重復(fù)等建樹(shù)參數(shù)[21]。

1.5桃PG基因的表達(dá)

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)每個(gè)桃PG基因進(jìn)行BLASTN比對(duì)搜索，取高相似度的序列（>95%）搜索其Unigene的EST表達(dá)數(shù)據(jù)，并將基因的表達(dá)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成Log2的格式，最終的基因表達(dá)數(shù)據(jù)使用Multiple Array Viewer軟件[22]以熱點(diǎn)圖的形勢(shì)呈現(xiàn)。

2結(jié)果與分析

2.1桃PG基因家族的鑒定和注釋

根據(jù)擬南芥PG蛋白的氨基酸序列，通過(guò)對(duì)桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST搜索，在桃基因組中共鑒定出了84個(gè)PG基因，并參考擬南芥PG基因的命名方法[4]對(duì)桃PG基因進(jìn)行命名（表1）。這84個(gè)PG基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度在426～2 127 bp，編碼141～708個(gè)氨基酸，相應(yīng)的蛋白分子量在1576～7463 ku，等電點(diǎn)在4.48～9.52之間。對(duì)PG蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)表明，其中64個(gè)蛋白具有一段N末端信號(hào)肽，信號(hào)肽長(zhǎng)度為15～32個(gè)氨基酸。對(duì)桃PG基因染色體定位（圖1），研究表明，PG基因在桃的8條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，其中第1、第2、第3、第4、第7染色體上具有比較多的PG基因，而第5、第6、第8染色體上的PG基因比較少。此外，PG基因在染色體上分布存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，共發(fā)現(xiàn)了16個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇，共包含48個(gè)基因，占PG基因總數(shù)的57%。

2.2桃PG基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類(lèi)

為進(jìn)一步分析桃PG基因在植物中的進(jìn)化模式，筆者選取了桃、擬南芥、楊樹(shù)、水稻、卷柏和小立碗蘚等6個(gè)代表性物種[2，5]中PG蛋白的氨基酸序列使用MEGA5.0軟件，構(gòu)建了NJ進(jìn)化樹(shù)并對(duì)各物種中PG基因進(jìn)行了聚類(lèi)分析（圖2）。結(jié)果表明，這6個(gè)物種的298個(gè)PG基因被聚類(lèi)成7個(gè)分支（A～G）。為明確每個(gè)物種在每個(gè)分支中PG基因的數(shù)目，對(duì)每個(gè)分支中不同物種PG基因的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表2）。結(jié)果表明，桃PG基因家族成員存在于所有的A～G等7個(gè)分支中，分別含有8、5、15、31、13、9、3個(gè)，擬南芥中分別含有8、6、8、20、14、11、1個(gè)。楊樹(shù)PG基因分布于A～F等6個(gè)分支中，分別含有12、7、21、16、14、5個(gè)。單子葉植物水稻PG基因也分布于A～F等6個(gè)分支中，分別含有7、11、4、9、12、1個(gè)。卷柏和小立碗蘚中PG基因數(shù)目比較少，卷柏中含有16個(gè)，分別為A類(lèi)2個(gè)、B類(lèi)6個(gè)、E類(lèi)7個(gè)、F類(lèi)1個(gè)；小立碗蘚中有11個(gè)，分別為A類(lèi)2個(gè)、B類(lèi)1個(gè)、E類(lèi)8個(gè)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也表明，A、B、E類(lèi)包含上述6個(gè)陸生植物的PG基因；C類(lèi)、D類(lèi)只包括桃、擬南芥、楊樹(shù)和水稻的PG基因；F類(lèi)包含桃、擬南芥、楊樹(shù)、水稻和卷柏的PG基因；而G類(lèi)只包括桃和擬南芥的PG基因。

2.3桃PG基因的基因結(jié)構(gòu)分析

為研究桃PG基因的基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)桃基因組信息獲取每一個(gè)PG基因的DNA和CDS序列信息并構(gòu)建其基因結(jié)構(gòu)（圖3）。結(jié)果表明，大部分PG基因都有3～8個(gè)不等的內(nèi)含子，其中分支D中有11個(gè)基因不具有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)基因結(jié)構(gòu)圖和基因進(jìn)化樹(shù)的比較分析，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)分支中PG基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)是比較保守的，尤其是每一個(gè)更小分支中的PG基因。

2.4桃PG蛋白的氨基酸序列比對(duì)和保守域分析

為研究桃PG蛋白的保守域，利用CLUSTAL X對(duì)桃PG蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)（圖4）。結(jié)果表明，PG蛋白一般具有4個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域（Ⅰ，SPNTDGI；Ⅱ，GDDC；Ⅲ，CGPGHGIS；Ⅳ，RIK）。除了分支G中的3個(gè)特殊蛋白不包含這4個(gè)結(jié)構(gòu)域之外，分支A～F中的蛋白都至少具有其中一個(gè)結(jié)構(gòu)域。尤其是分支A、B、C、F中的蛋白一般都具有所有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，而分支E中的13個(gè)蛋白一般只具有Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ這3個(gè)結(jié)構(gòu)域，都缺少結(jié)構(gòu)域Ⅲ。 另外，利用MEME軟件對(duì)桃PG保守基序的分析（圖5），發(fā)現(xiàn)了6個(gè)比較保守的基序（motif 1～6），其中motif 1、motif 5、motif 2和motif 3分別對(duì)應(yīng)Ⅰ～Ⅳ 4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。另外，還分別在74、76個(gè)PG蛋白中發(fā)現(xiàn)了motif 4和motif 6。

2.5桃PG基因的表達(dá)分析

利用 UniGene 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的組織表達(dá)。結(jié)果表明，有 10 個(gè)基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中有表達(dá)數(shù)據(jù)（圖6）。其中有6個(gè)基因具有組織表達(dá)特異性，[WTBX][STBX]PpaPG10、PpaPG65、PpaPG66、PpaPG67、PpaPG68[WTBZ][STBZ]在果實(shí)中特異表達(dá)，[WTBX][STBX]PpaPG60[WTBZ][STBZ]在莖中特異表達(dá)。對(duì)另外4個(gè)非組織特異表達(dá)的基因，[WTBX][STBX]PpaPG01[WTBZ][STBZ]在莖中表達(dá)量比較高，[WTBX][STBX]PpaPG23[WTBZ][STBZ]主要在果實(shí)中表達(dá)，而[WTBX][STBX]PpaPG80[WTBZ][STBZ]在葉中具有比較高的表達(dá)。

3結(jié)論與討論

PG家族是一個(gè)大的基因家族。在不同物種中，PG基因的進(jìn)化和分類(lèi)已經(jīng)被進(jìn)行了大量的研究。Park等通過(guò)聚類(lèi)分析，將藻類(lèi)到陸生植物的PG基因家族成員進(jìn)行了詳細(xì)的劃分[8]。8個(gè)物種的225個(gè)PG成員被聚類(lèi)到A～F等6個(gè)分支，分支A、分支B包含所有陸生植物的PG基因，分支E包含藻類(lèi)到開(kāi)花植物的PG成員，而分支C、D、F則只含有開(kāi)花植物的PG成員[6]。本研究對(duì)桃、擬南芥、楊樹(shù)、水稻、卷柏和小立碗蘚等6個(gè)代表性物種中的298個(gè)PG基因構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)和聚類(lèi)分析，將PG基因聚類(lèi)到A～G等7個(gè)分支。桃和擬南芥PG基因家族成員存在于所有的A～G等7個(gè)分支中，楊樹(shù)和水稻PG基因分布于A～F等6個(gè)分支中，卷柏PG基因分布于分支A、B、E、F中，小立碗蘚PG基因僅分布于分支A、B、E等3個(gè)分支中。與Park等的研究結(jié)果[6]不同的是，分支F中存在1個(gè)卷柏PG基因，因此F亞類(lèi)應(yīng)該包含除苔蘚以外的所有陸生植物的PG基因。

桃、擬南芥、水稻、楊樹(shù)基因組大小分別為230、125、466、480 Mbp，而這4個(gè)物種基因組中PG基因的數(shù)目分別為84、68、44、75個(gè)，說(shuō)明桃基因組中PG基因出現(xiàn)了基因的擴(kuò)增。進(jìn)一步對(duì)這4個(gè)物種每個(gè)分支中PG基因數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和比較發(fā)現(xiàn)，桃的分支C、分支D分別包含15、31個(gè)PG基因，明顯比其他物種在這2個(gè)分支中PG基因多，說(shuō)明桃PG基因的擴(kuò)增主要出現(xiàn)在這2個(gè)分支中?；驍U(kuò)增是基因組進(jìn)化最主要的[CM（25]驅(qū)動(dòng)力之一，是產(chǎn)生具有新功能的基因和進(jìn)化出新物種的[CM）][FL）]

主要原因之一?；蚩梢酝ㄟ^(guò)多種方式進(jìn)行擴(kuò)增，包括全基因組復(fù)制、串連復(fù)制、片段復(fù)制和逆轉(zhuǎn)座復(fù)制等。對(duì)桃PG基因染色體定位進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，PG基因在染色體上，分布存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，共有16個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇，包含48個(gè)基因，占PG基因總數(shù)的57%，表明串聯(lián)重復(fù)是桃PG基因擴(kuò)增的主要方式。分支C中有4個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇，包含13個(gè)基因；分支D有7個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇，包含22個(gè)基因。表明桃PG基因的串聯(lián)重復(fù)主要發(fā)生在分支C和分支D中?；驍U(kuò)增后會(huì)產(chǎn)生大量的基因重復(fù)，基因重復(fù)在生物系統(tǒng)進(jìn)化中發(fā)揮著極其重要的作用，是基因組和遺傳系統(tǒng)分化的重要推動(dòng)力[23]。一般認(rèn)為，復(fù)制基因在進(jìn)化過(guò)程中有4種命運(yùn)，即假基因化、[JP2]保持原有基因功能、亞功能化、新功能化。桃基因組中大量重復(fù)PG基因的進(jìn)化命運(yùn)仍需要進(jìn)一步研究。[JP]

桃的使用主要是鮮食和加工2種方式，而這2種方式對(duì)果實(shí)的硬度和成熟度要求不同[24-26]。PG基因已被證明在果

實(shí)成熟和軟化過(guò)程中具有重要作用。在桃UniGene 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到了10個(gè)有表達(dá)數(shù)據(jù)的PG基因，其中有9個(gè)基因均在果實(shí)中表達(dá)，而且有5個(gè)基因是在果實(shí)中特異表達(dá)，表明PG基因在桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中扮演者重要角色。對(duì)桃PG基因與果實(shí)發(fā)育關(guān)系研究能夠?yàn)榕嘤鲜袌?chǎng)需求的桃優(yōu)良品種提供重要的理論依據(jù)，并具有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。

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