胡雪丹 張曼 徐錦華 劉廣 姚協(xié)豐++李蘋芳++陳學好 羊杏

摘要：探討葫蘆科作物在游離小孢子培養(yǎng)中（與花粉培養(yǎng)）的優(yōu)勢，闡述游離小孢子培養(yǎng)過程中供體植株基因型、供體植株生理狀況、預處理、小孢子發(fā)育時期、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等諸多因素的影響，并針對葫蘆科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)中存在的問題提出后續(xù)研究方向。

關鍵詞：葫蘆科作物；游離小孢子培養(yǎng)；優(yōu)勢；影響因素

中圖分類號： Q943.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）06-0025-05

葫蘆科作物在世界園藝作物生產中占有非常重要的地位，隨著人們消費需求的增加，葫蘆科作物的栽培面積逐年增大。葫蘆科作物包括118屬825種，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，中國約有29屬142種，常見的主要有西瓜、甜瓜、苦瓜、黃瓜、西葫蘆等，栽培面積大且具有較高的經濟效益，在人們日常生活中具有重要作用。由于葫蘆科作物的常規(guī)遺傳育種方法育種周期長、難度大、遺傳性狀不穩(wěn)定，常規(guī)育種的不足在實際工作中日漸明顯，各國學者開始尋找育種的新途徑和新方法。單倍體育種技術為縮短育種年限、提高育種效率提供了可能，因此在葫蘆科作物中開展以離體培養(yǎng)為基礎的生物技術育種研究顯得尤為重要。獲得單倍體葫蘆科植物最常見的方法是通過輻射花粉授粉，誘導單倍體胚胎進行原位孤雌發(fā)育。近年來，離體雄核發(fā)育途徑生產單倍體技術逐漸受到重視，離體雄核發(fā)育途徑有花藥離體培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)，其效果可以媲美輻射花粉授粉技術[1]。早在1971年，西貞夫等在黃瓜花藥培養(yǎng)的研究中獲得了不定芽。之后的幾十年里，學者們致力于花粉離體培養(yǎng)，已經在葫蘆科作物中的南瓜屬、葫蘆屬、西瓜屬、甜瓜屬、苦瓜屬等獲得了單倍體[2]。與花藥離體培養(yǎng)相比，葫蘆科作物游離小孢子培養(yǎng)起步較晚、研究相對較少，僅在黃瓜、西瓜、甜瓜上獲得了胚狀體或再生植株。

1葫蘆科作物游離小孢子培養(yǎng)的優(yōu)勢

在葫蘆科蔬菜作物中，自發(fā)產生單倍體的頻率極低。為獲得單倍體植株，離體雄核發(fā)育途徑（花藥或小孢子培養(yǎng)）、雌核發(fā)育途徑（未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)、外源化學藥劑、正常花粉或輻射過的花粉授粉誘導的孤雌生殖）等手段被用來誘導單倍體。近年來，游離小孢子培養(yǎng)技術的不斷成熟為離體培養(yǎng)單倍體帶來了曙光。

游離小孢子培養(yǎng)研究于20世紀70年代初開始，于1982年在蕓薹屬作物上首次獲得成功[2]。在高等植物的生活史中，小孢子是雄配子體發(fā)育過程中短暫而重要的階段，是減數(shù)分裂后四分體釋放出的單倍性單細胞。小孢子培養(yǎng)是指將小孢子從花藥中游離出來，在人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)并獲得再生植株的過程。與花藥培養(yǎng)相比，游離小孢子培養(yǎng)開展的并不晚，但進展較緩慢。早在1982年，Licher首次報道采用甘藍型油菜游離小孢子培養(yǎng)形成植株[3]。20世紀80年代后期，游離小孢子培養(yǎng)技術在十字花科的油菜上得以迅速發(fā)展并日臻完善。近十幾年，游離小孢子培養(yǎng)技術在甘藍型油菜上日漸成熟，已陸續(xù)在黑芥、結球甘藍、芥藍、嫩莖花椰菜、抱子甘藍、羽衣甘藍、皺葉甘藍、小白菜、大頭菜、葉芥等十幾種蔬菜上獲得成功，但對葫蘆科游離小孢子培養(yǎng)至今尚未見明確成功的報道[4]。

從概念來看，花藥離體培養(yǎng)是把小孢子發(fā)育到一定階段的花藥接種至培養(yǎng)基上，以改變花藥內小孢子粒的發(fā)育程序，使其分裂形成細胞團，進而分化成胚狀體，形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株。小孢子離體培養(yǎng)是指把小孢子從花藥中分離出來，以單個小孢子粒作為外植體進行離體培養(yǎng)的技術。由于小孢子已是單倍體細胞，誘發(fā)它經愈傷組織或胚狀體發(fā)育而成的植株都是單倍體，且不受花藥的藥隔、藥壁、花絲等體細胞的干擾。從培養(yǎng)層次來看，花藥離體培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)，小孢子離體培養(yǎng)屬細胞培養(yǎng)，但花藥離體培養(yǎng)和小孢子離體培養(yǎng)的目的均是誘導小孢子細胞發(fā)育成單倍體細胞，最后發(fā)育成單倍體植株。一般來說，花藥培養(yǎng)比游離小孢子培養(yǎng)的技術要求相對簡單。從培養(yǎng)過程來看，花藥離體培養(yǎng)相對容易，技術比較成熟，但最后須對培養(yǎng)成的植株進行染色體倍數(shù)檢測；小孢子離體培養(yǎng)盡管不受花藥壁、藥隔等二倍體細胞的干擾，但這種特殊單倍體細胞的培養(yǎng)技術難度較大，目前僅在少數(shù)植物上獲得成功。

產生單倍體的方法主要有花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)，但近年來花藥培養(yǎng)已逐漸被小孢子培養(yǎng)所取代。與花藥培養(yǎng)相比，小孢子培養(yǎng)方法具有以下幾方面優(yōu)勢：（1）排除了母體組織體細胞的干擾，培養(yǎng)獲得的植株均是由單倍體小孢子發(fā)育來的，避免了嵌合體的發(fā)生，染色體加倍后可獲得遺傳上純合穩(wěn)定的后代。（2）有利于提高小孢子胚胎發(fā)生的機率。（3）小孢子均是單細胞，數(shù)量多、發(fā)育快、易獲得、誘導率高、易突變，在自然條件下容易加倍，操作簡便，得到的胚狀體還可應用于育種實踐和遺傳分析。（4）適合作為單一細胞群體系統(tǒng)的生理生化研究。（5）易于誘發(fā)突變和進行離體篩選。小孢子培養(yǎng)技術在育種及基礎研究應用上具有以下優(yōu)勢：（1）小孢子培養(yǎng)獲得的DH（doubled haploid，雙單倍體）植株是同源體，因而是真實育種；[JP2]（2）從雜種中培養(yǎng)得到的小孢子單倍體在遺傳上代表隨機配子；（3）小孢子培養(yǎng)獲得純合植株一般需要7～8個月，而傳統(tǒng)育種方法需要3～4年，大大節(jié)省了時間和成本；（4）與組織培養(yǎng)技術相結合能獲得大量成本相對較低的目標材料；（5）小孢子能直接發(fā)育成胚胎，因而減少了遺傳變異；（6）單倍體小孢子能進行顯性和隱性性狀的突變誘導。 [JP]

總體來講，瓜類蔬菜作物通過離體雄核發(fā)育途徑生產單倍體難度較大，只有西瓜的花藥培養(yǎng)較為成功。薛光榮等利用瓊酥西瓜品種，通過培養(yǎng)單核靠邊期的花藥在國際上首次獲得了西瓜單倍體植株，并從其加倍后代中直接選育出優(yōu)良的新品種[5]，1988年薛光榮等在周至紅這一品種上獲得了成功[6]。在南瓜的花藥培養(yǎng)上也有學者進行過嘗試。Shail等培養(yǎng)花藥但并未獲得單倍體植株[7]；Kurtar等對4個南瓜品種花粉母細胞處于單核期的花藥進行培養(yǎng)，并摸索了蔗糖濃度和2，4-D濃度對培養(yǎng)效果的影響，但最后得到的3個植株均為二倍體[8]；直到1998年，Metwally等成功得到了10個單倍體植株，并對培養(yǎng)基進行篩選，發(fā)現(xiàn)單核中期、單核晚期的南瓜小孢子接種在MS+15%蔗糖+5 mg/L 2，4-D上培養(yǎng)的效果最好，每塊愈傷組織植株再生頻率可達192%[9]。Dryanovska等曾嘗試甜瓜的花藥培養(yǎng)，結果以失敗告終[10]。早在1982年，Lazarte等分別取黃瓜四分體、小孢子、成熟期3個時期的花粉進行花藥培養(yǎng)，并得到再生植株，但直到目前并無進一步研究，所得植株是否起源于小孢子仍未知[11]。直到2003年，Ashok等成功獲得了黃瓜單倍體植株[12]。詹艷等以10個不同基因型的黃瓜為試材進行游離小孢子培養(yǎng)，通過對成胚條件的系統(tǒng)研究，從7447和Poinsett97中獲得了子葉形胚和再生植株，得到的子葉形胚易分化成苗，而其他類型的胚狀體未能獲得再生植株，但誘導頻率仍然很低，難以用于育種實踐[13]。唐懿等針對基因型、小孢子發(fā)育時期等影響苦瓜花藥培養(yǎng)的主要因素進行綜述，討論了苦瓜花藥培養(yǎng)中存在的問題，并為今后苦瓜花藥培養(yǎng)提供了研究方向[14]。Han等利用子葉節(jié)建立了葫蘆再生體系[15]，但關于葫蘆花藥離體培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)并無報道。

2葫蘆科作物小孢子培養(yǎng)的影響因素

影響單倍體離體誘導的因素很多，涉及供體植株的基因型、培養(yǎng)基、外植體預處理方式、外植體發(fā)育時期、培養(yǎng)條件等方面，且各因素之間存在相互作用。根據關于游離小孢子培養(yǎng)和再生植株的報道，得出小孢子培養(yǎng)的主要影響因素。

2.1誘導游離小孢子胚胎發(fā)生的影響因子

小孢子培養(yǎng)受到供體植株基因型、供體植株生理狀況、預處理、小孢子發(fā)育時期、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等諸多因素的影響，因此小孢子出胚率受到很大限制，成為實際應用中的一大難題。

2.1.1供體植株的基因型供體植株的基因型是影響小孢子培養(yǎng)的關鍵因素，不同基因型的植株對培養(yǎng)具有不同反應，主要體現(xiàn)在基因型的反應范圍、產胚率的差異2個方面。基因型的反應范圍即有多少基因型有反應，以及有反應的基因型產胚率的差異。詹艷等對10份黃瓜供試材料進行研究，只有4份試材獲得了胚狀體，其中成胚率最高的是7447，為312個/皿；成胚率最低的是康德，為1.5個/皿；其余6份材料中有些游離小孢子出現(xiàn)膨大，有些已啟動分裂，但均未能繼續(xù)分裂形成胚狀體[13]。李娟對西瓜進行研究發(fā)現(xiàn)，野生種和栽培種的成胚率有顯著差別，前者高于后者[4]。緱艷霞、董艷榮分別在西瓜、甜瓜花藥培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代植株的愈傷組織誘導率明顯大于親本，表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢，表明小孢子的基因型至少是決定培養(yǎng)能力的因素[16-17]。

2.1.2供體植株的生長環(huán)境供體植株的生理狀態(tài)對小孢子胚胎誘導率具有重要影響，試驗中一般選擇生長發(fā)育健壯、無病蟲害的花蕾為試材進行培養(yǎng)，以達到最佳效果。另外，光照、溫度、水肥等供體植株生長的環(huán)境條件也是影響小孢子培養(yǎng)的關鍵因素。供體植株生長環(huán)境的溫度影響最為顯著，很多研究表明，適當?shù)蜏乜娠@著提高供體植株小孢子的出胚率。曹鳴慶等以種植在部分控溫溫室和露地的17個基因型的大白菜為試材，研究供體母株的生長環(huán)境條件對小孢子胚胎發(fā)生的影響；結果表明，供體植株生長環(huán)境的溫度為10～25 ℃，小孢子的胚產量較高[18]。張鳳蘭等利用人工氣候室研究光照、溫度對小孢子胚胎發(fā)生的影響，結果表明，日照時數(shù)為 14 h 最有利于小孢子胚胎發(fā)生且產胚量最高，最適溫度為 20 ℃[19]。袁亦楠等在番茄游離小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，5月下旬、10月薯葉番茄花蕾的類胚發(fā)生率分別為0.01%、0.25%，可能是土壤的低夜溫影響了供體內小孢子的發(fā)育方向，使其偏離配子體方向發(fā)育，從而脫分化形成胚狀體[20]。

2.1.3小孢子發(fā)育時期小孢子發(fā)育時期、花蕾大小、取樣時期均會影響小孢子培養(yǎng)效果。小孢子發(fā)育時期通常分單核期、雙核期、三核期，并非任何時期的小孢子都適于培養(yǎng)。單核期又分為單核早期、單核中期、單核靠邊期，最適于游離小孢子培養(yǎng)的時期通常為單核靠邊期。很多研究表明，小孢子發(fā)育時期與花蕾長度、花藥長度、花瓣長等花蕾形態(tài)指標密切相關，可作為小孢子群體是否適于培養(yǎng)的衡量指標。Thurling等在進行蕓薹屬花藥培養(yǎng)時指出，雖然花蕾大小是判斷小孢子發(fā)育階段的可靠指標，但也隨著供體基因型、生長條件、生長時間、花序等的變化而變化，此結論同樣適用于瓜類[4]。

在大多數(shù)作物花藥培養(yǎng)中，花粉的發(fā)育時期均選用單核靠邊期，但目前對其作用機理仍不清楚。在黃瓜花藥培養(yǎng)中，不同發(fā)育期的花藥幾乎均可形成愈傷組織。詹艷等對黃瓜進行研究發(fā)現(xiàn)，只有單核靠邊期的小孢子誘導成胚[13]。謝淼等則研究發(fā)現(xiàn)，單核中后期的花藥適于作為外植體，而甜瓜花藥培養(yǎng)的最佳時期是單核靠邊期至雙核期[21]。薛光榮等利用瓊酥西瓜品種，通過培養(yǎng)單核靠邊期的花藥在國際上首次獲得西瓜單倍體植株，并從其加倍后代中獲得了新品種，但并未進行推廣[22]。不能僅憑花蕾的大小來判斷花粉發(fā)育時期。崔群香等以蜜本南瓜、安生黑鉆南瓜開花初期的雄花蕾為試驗材料，利用熒光染色技術對南瓜花粉發(fā)育時期進行鑒定[23]?；ɡ俅笮∫蛑仓晟L狀況及采花時期而有所不同，同樣大小的花蕾其發(fā)育時期也不盡相同；因此，掌握葫蘆科作物花蕾的采集時期，須先對葫蘆科作物不同發(fā)育階段的花藥進行顯微觀察，了解葫蘆科作物花粉發(fā)育的特點。

2.1.4逆境脅迫預處理預處理可改變小孢子的發(fā)育途徑，使其從配子體發(fā)育途徑轉向孢子體發(fā)育途徑，從而誘導小孢子胚的形成。預處理包括離心、低溫、高溫、輻射、秋水仙素、饑餓等人為處理，目前廣泛應用的預處理方法一般為低溫預處理、高溫熱激處理、甘露醇預處理、秋水仙素預處理。溫度脅迫是影響小孢子胚狀體發(fā)生的最主要因素。一般來說，從植株上采下花蕾后，直接進行小孢子培養(yǎng)很難誘導胚狀體發(fā)生。溫度脅迫可改變小孢子發(fā)育途徑，從而阻止小孢子向成熟花粉粒方向發(fā)展，而是沿著胚胎的發(fā)展途徑最終形成胚。羊杏平等研究低溫、高溫、甘露醇、蔗糖、激素、三十烷醇6種處理對西瓜小孢子存活率的影響發(fā)現(xiàn)，4 ℃低溫預處理2 d、35 ℃高溫熱激4 d、13%蔗糖處理均可顯著提高西瓜小孢子的存活率（P<0.05）；甘露醇、三十烷醇對不同西瓜品種的小孢子存活率影響不同，在培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L 6-BA+04 mg/L 2，4-D的西瓜小孢子存活率最高[24]。

低溫預處理和高溫熱激是游離小孢子培養(yǎng)中最常用的2種方法。Ashok等研究了Calyps、Cucumis sativus Lr等2個黃瓜品種在花藥離體培養(yǎng)時對溫度預處理的反應，結果表明，花蕾在 4 ℃ 預處理2 d、32.8 ℃熱激1 d時反應最好[12]。郭尚等通過花粉培養(yǎng)、顯微鏡觀察的方法研究不同溫度、營養(yǎng)條件、保藏條件對花粉生活力的影響，結果表明，西瓜花粉萌發(fā)的適宜溫度為18～38 ℃，上限、下限溫度分別為48、8 ℃，在較高生長溫度條件下形成的花粉生活力較強；低溫處理時間越長，對花粉發(fā)芽越不利；8 ℃低溫、干燥條件有利于花粉短期保存；營養(yǎng)充足的大型花蕾花粉萌發(fā)較好[25]。朱迎春等以4 ℃低溫預處理48、72 h時，西瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導率較高，均顯著高于對照，表明4 ℃低溫預處理可作為花蕾的一種保存方式[26]。詹艷等對10份黃瓜供試材料進行研究發(fā)現(xiàn)，低溫預處理有利于胚狀體的誘導，以4 ℃預處理2～4 d為宜，以處理2 d的胚狀體產量最高[13]。緱艷霞等以具有較多優(yōu)良性狀的F1代西瓜品種春光、拿比特、喜都的花藥為試材，研究影響西瓜花藥愈傷組織誘導率的因素，表明4 ℃低溫預處理 72 h 可提高西瓜花藥愈傷組織的誘導率；30 ℃高溫預培養(yǎng)72 h后置于25 ℃下低溫培養(yǎng)也可提高西瓜花藥愈傷組織的誘導率[27]。Labbani等以0.3 μmol/L甘露醇預處理、[JP2]4 ℃ 冷處理小麥小孢子，經過3、5、6、7、8、10、12 d等不同時期的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，結合0.3 g/mol甘露醇和7 d冷處理對胚胎數(shù)量有強烈影響[28]。楊安平等在甘藍小孢子培養(yǎng)基中添加秋水仙堿，結果發(fā)現(xiàn)可使部分培養(yǎng)無反應材料產胚，并提高培養(yǎng)有反應材料的產胚量，同時對胚胎的良好發(fā)育具有促進作用[29]。[JP]

2.1.5小孢子分離方法獲得游離小孢子是進行培養(yǎng)的前提和關鍵，一般通過自然散落法、機械擠壓法2種方法獲得游離小孢子。（1）自然散落法。將花蕾消毒、清洗后，于無菌條件下取出花藥并接種到培養(yǎng)基上，任其花粉自然散落。（2）機械擠壓法。把經滅菌、清洗處理后的花蕾放到無菌研缽中，加入少量分離培養(yǎng)基研磨，得到花蕾懸浮液，采用尼龍篩網過濾并濾去殘渣，濾液多次離心，調整小孢子密度。

2.1.6培養(yǎng)基及其成分大多數(shù)瓜類花藥培養(yǎng)均選用MS作為基本培養(yǎng)基，也可選用NLN、B5培養(yǎng)基。很多試驗采用B5作為洗滌培養(yǎng)基，之后以NLN-13（NLN基本培養(yǎng)基+13%蔗糖）或1/2 NLN培養(yǎng)基作為誘導培養(yǎng)基，也能取得良好效果。謝淼等選用MS和B5作為基本培養(yǎng)基對黃瓜花藥進行培養(yǎng)[21]。在關于絲瓜花藥培養(yǎng)的研究中選用的是N6；在蔬菜作物中常用的胚狀體誘導培養(yǎng)基一般為NLN或1/2 NLN培養(yǎng)基。在黃瓜游離小孢子培養(yǎng)中，NLN和B5作為基本培養(yǎng)基誘導獲得的胚狀體產量差異性雖然不明顯，但NLN更有利于球形胚進一步發(fā)育成子葉形胚。

碳源是植物組織培養(yǎng)不可缺少的物質，它不僅能為外植體提供能量，也能維持一定的滲透壓。常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇等，蔗糖能支持絕大多數(shù)植物離體培養(yǎng)物的旺盛生長，一直作為植物組織培養(yǎng)的標準碳源被廣泛應用。然而近年來許多研究表明，蔗糖并不一定是最佳碳源，不同植物對不同糖類的反應不完全相同，并且多數(shù)植物組織培養(yǎng)物以葡萄糖、果糖為碳源時也能良好生長。碳源一般在6%～12%變化范圍內即可滿足瓜類植物的營養(yǎng)需求。黃均元等以茄子、黃瓜、番茄、西瓜、甜瓜5種蔬菜作物為研究對象，以不同濃度的蔗糖、硼酸、赤霉素進行處理，觀察花粉的萌發(fā)情況，結果表明，硼酸、赤霉素、蔗糖均能促進花粉萌發(fā)[30]。

小孢子培養(yǎng)過程中會產生有毒物質，進而降低胚狀體的發(fā)生頻率，改變胚的形態(tài)，產生畸形胚，而活性炭可有效吸附有毒物質。姜鳳英等認為，添加活性炭的培養(yǎng)基有利于魚雷形小孢子胚成苗，100 mg/L活性炭的成苗率增大最明顯，但對子葉形胚成苗的作用不大[31]。申書興等發(fā)現(xiàn)，活性炭的適宜添加量為0.05～0.10 g/L[32]。Lichter指出，活性炭不僅能吸收培養(yǎng)基中的有毒物質，也能吸收一些必要元素和植物激素，因此活性炭濃度不宜過高，否則會起負作用[33]。配制活性炭時最好加少量（0.5%左右）瓊脂糖，因為無瓊脂糖的游離活性炭吸附到小孢子上反而會阻止胚狀體發(fā)生。

楊清等發(fā)現(xiàn)，花椰菜花藥培養(yǎng)中添加62.5 mg/L AgNO3能顯著促進胚發(fā)生[34]。Ochatt等發(fā)現(xiàn)，AgNO3對花藥培養(yǎng)具有促進作用，對某些基因型的促進效果較明顯[35]。Dias等對甘藍類蔬菜花藥培養(yǎng)進行研究發(fā)現(xiàn)，誘導培養(yǎng)基中添加 10 mg/L AgNO3后出胚率大大增加，而在未加AgNO3的培養(yǎng)基中這些基因型幾乎無胚狀體形成[36-39]。Biddington等指出，對于難出胚的基因型，在培養(yǎng)基中加入乙烯的抑制劑 AgNO3 也許能提高其出胚率[40]。方淑桂等認為，AgNO3可促進青花菜小孢子的胚胎發(fā)生[41]。于文佳等在小菘菜胚芽分化影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在B5固體培養(yǎng)基中添加一定質量濃度的AgNO3，[JP]可顯著提高小孢子的胚芽誘導率和平均每胚出芽數(shù)[42]。[JP]

常用于植物組織培養(yǎng)的外源激素有2類，即生長素類（2，4-D、IAA、NAA、IBA）和細胞分裂素類（KT、6-BA、ZT、TDZ等）。Metwally等研究花藥培養(yǎng)基中蔗糖和2，4-D的用量發(fā)現(xiàn)，添加150 g/L蔗糖、5 mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基誘導的南瓜單倍體植株最多[9]。Ashok等研究了Calyps、Cucumis sativus Lr 等2個黃瓜品種在花藥離體培養(yǎng)時對生長調節(jié)劑的反應，認為最佳的誘導胚產生愈傷組織是在B5培養(yǎng)基中添加2.0 μmol/L 2，4-D和1.0 μmol/L BAP，在添加0.09 μmol/g蔗糖、0.25 μmol/L NAA、0.25 μmol/L KN的B5培養(yǎng)基中獲得分化的胚胎，在添加5 μmol/L ABA的B5培養(yǎng)基中胚胎發(fā)育，在含有0.09 μmol/L蔗糖的B5培養(yǎng)基中萌發(fā)成苗[12]。朱至清等認為，外源激素對花粉細胞去分化啟動是非必需的，但可防止多細胞花粉的敗育，使較多細胞形成愈傷組織[43]。薛光榮等證實，適當提高2，4-D濃度可提高西瓜愈傷組織誘導率，適當提高BA或KT濃度可提高直接增殖率和分化率[6]。生長激素是黃瓜組織培養(yǎng)中的重要因素，其中2，4-D作用最明顯，NAA次之，細胞分裂素中KT的作用差異顯著。甜瓜在較低濃度生長激素調節(jié)下具有較高分化率和成苗率。關于葫蘆、冬瓜、南瓜、絲瓜等花藥培養(yǎng)的報道不多，但許多學者使用未添加任何外源激素的培養(yǎng)基同樣獲得了數(shù)量和質量均較好的胚狀體，因此外源激素在小孢子培養(yǎng)中不是必需的。

2.1.7培養(yǎng)基pH值大多數(shù)植物適合在pH值為5.8～6.0的培養(yǎng)基中生殖，pH值在該范圍內可促進細胞分裂與增殖。Barinova等研究發(fā)現(xiàn)，高pH值條件下游離小孢子體內的轉化酶活性減弱，同時14C標記的蔗糖大量進入小孢子體內，表明處于高pH值條件下的小孢子糖代謝能力減弱，從而造成饑餓脅迫，阻斷了配子體發(fā)育途徑，誘導孢子體發(fā)育[44]?？梢?，適當提高pH值可能有利于誘導小孢子胚胎發(fā)生。

2.1.8小孢子密度小孢子培養(yǎng)密度過大致使培養(yǎng)基養(yǎng)分供應不足，易引發(fā)培養(yǎng)基中毒性物質過多釋放，導致健康優(yōu)秀的小孢子難以出胚；密度過低則小孢子的競爭優(yōu)勢得不到體現(xiàn)，胚胎發(fā)生比較困難，一般采用的培養(yǎng)密度為10萬～50萬個/mL。詹艷等采用血球計數(shù)板計數(shù)，將小孢子密度調整至10萬個/mL左右，但每次均采用血球計數(shù)板調整小孢子密度使操作過于繁瑣，影響試驗進程[13]。不少學者根據 1 mL 培養(yǎng)基中花蕾的數(shù)量研究小孢子密度對出胚的影響。

2.2胚培養(yǎng)發(fā)育及植株再生

[JP2]一般小孢子培養(yǎng)2～3 d發(fā)生第1次分裂，培養(yǎng)2～3周后形成胚狀體。小孢子胚狀體的類型分為球形、心形、魚雷形、子葉形以及畸形胚。由胚發(fā)育成植株的過程，在游離小孢子培養(yǎng)技術的應用中具有重要作用。國內外眾多學者在此方面的研究結果表明，胚的直接成苗率與培養(yǎng)基、胚的質量、供體植株的基因型均有關。詹艷等將獲得的子葉形胚、部分球形胚和心形胚轉移至胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基MS-BA上，培養(yǎng)20 d后，球形胚、心形胚褐化死亡；發(fā)育成熟的子葉形胚正常萌發(fā)，形成根芽俱全的小植株；處于初期的子葉形胚則大部分未能正常分化，出現(xiàn)未變綠、褐化死亡或僅有根分化的現(xiàn)象[13]?？梢姡尤~形胚最易成苗，因此胚狀體能否正常發(fā)育為成熟的子葉形胚是成苗的關鍵。甘藍類蔬菜出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體后，將其置于搖床上在60 r/min、25 ℃條件下暗培養(yǎng)，形成子葉形胚狀體時轉入B5固體培養(yǎng)基，于25 ℃光暗交替條件下繼續(xù)培養(yǎng)。[JP]

谷佳南等研究了黃瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導及植株再生，將帶有芽點的愈傷組織轉接到生根培養(yǎng)基中，分化出根狀物后，芽的伸長能力明顯下降，使植株再生極為困難[45]。這可能與基因型有關，也可能是黃瓜花藥愈傷組織中存在某種激素，在促進根分化的同時阻礙了芽的伸長生長，為植株再生帶來一定困難。激素配比尚須調整，黃瓜花藥再生植株分化有待進一步研究。

2.3小孢子再生植株的倍性鑒定

小孢子培養(yǎng)得到的再生植株以單倍體居多，然而培養(yǎng)過程中一般會發(fā)生不同程度的自然加倍，因此小孢子再生植株是由不同倍性植株組成的混合群體，為生產應用帶來較大不便，有必要對其進行倍性鑒定。常用的倍性鑒定方法有形態(tài)學鑒定法、氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法、花粉母細胞染色體計數(shù)法、根尖染色體計數(shù)法、流式細胞儀DNA含量測定法，且這5種鑒定方法各有優(yōu)劣。不同倍性植株的外部形態(tài)特征存在差異，單倍體植株的生活力、生長勢、各主要器官大小均劣于正常二倍體，而倍性水平高的植株形態(tài)優(yōu)于正常二倍體。

植株形態(tài)鑒定法易受植株長勢、營養(yǎng)條件等因素的影響，且倍性水平高時不易區(qū)分，判斷結果不準確，難以有效鑒定。氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法具有簡便、快捷、準確性高的優(yōu)點，但須建立不同倍性葉綠體數(shù)量與倍性之間的關系，對染色方法、操作技巧等有一定要求。為快速鑒定煙草花粉植株染色體倍性，劉仁祥等采用氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法[46]。為尋求簡便、快速的西瓜染色體倍性鑒定方法，施先鋒等以二倍體西瓜TS、0517及其同源四倍體為試材，通過觀察葉片氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)來鑒定西瓜染色體倍性，結果表明，2種倍性間的葉綠體數(shù)差異顯著，二倍體葉綠體數(shù)在15個以下，四倍體葉綠體數(shù)≥15個，氣孔葉綠體數(shù)隨染色體倍性的增加而增加，用氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)預測植株倍性的準確率可達90.2%[47]?？梢姡捎脽晒怙@微鏡觀察葉綠體數(shù)可在苗期快速、準確地確定植株的染色體倍性。

2.4染色體加倍

小孢子再生植株有很大部分不能自然加倍，須采用人工誘導方法進行加倍。人工誘導方法有很多，通常采用2種途徑，即培養(yǎng)過程中處理、移栽時誘變劑處理。單倍體人工加倍主要采用0.2～0.4 mg/g秋水仙堿處理單倍體植株，使其加倍。采用秋水仙堿溶液處理根、芽等分生組織或直接加至培養(yǎng)基中，均可起到一定加倍作用。周偉軍等對剛分離的油菜小孢子、移入固體培養(yǎng)基前的胚體進行秋水仙堿處理和再生植株浸根處理，研究3種不同時期秋水仙堿處理對小孢子胚胎發(fā)育、成苗、加倍率的影響，結果表明，采用秋水仙堿直接處理的新分離油菜小孢子培養(yǎng)體系獲得的自發(fā)加倍率顯著高于常規(guī)培養(yǎng)體系，且分離小孢子直接進行秋水仙堿加倍染色體更為安全、快速、有效[48]。

3葫蘆科作物小孢子培養(yǎng)存在的問題與展望

近年來，盡管花粉培養(yǎng)取得了很大進展，但對葫蘆科作物的研究相對較少，僅在黃瓜、西瓜上獲得了胚狀體或再生植株。小孢子培養(yǎng)在育種、生物技術等方面用處很大，但關于小孢子培養(yǎng)技術的機制目前仍不清楚。小孢子培養(yǎng)技術在十字花科、茄科、禾本科作物上已得到實際應用，在葫蘆科作物上目前仍處于實驗室試驗階段。存在的主要問題是小孢子無法啟動萌發(fā)或成胚率太低，不同物種或不同基因型間差異較大，形成的愈傷組織或胚狀體無法進一步發(fā)育成為單倍體植株。今后的研究將從碳源、生長調節(jié)劑的種類及濃度、活性炭的應用、預培養(yǎng)的溫度及時間等方面入手，以期建立葫蘆科作物小孢子培養(yǎng)的植株再生體系，使小孢子培養(yǎng)技術在育種及其他生物技術的應用中發(fā)揮積極作用，通過建立穩(wěn)定、高效地獲得純合二倍體的葫蘆游離小孢子培養(yǎng)體系來解決上述問題。

參考文獻：

[1][ZK（#]Joanna G，Katarzyna N S. Review of research on haploid production in cucumber and other cucurbits[J]. Folia Hort，2013，25（1）：67-78.[HJ1.35mm]

[2]雷春，陳勁楓. 葫蘆科蔬菜作物單倍體材料創(chuàng)制的研究進展[J]. 中國蔬菜，2006（1）：33-36.

[3]Lighter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus[J]. Z Pflanzenphysiol，1982，105：427-434.

[4]李娟. 西瓜花藥和小孢子培養(yǎng)研究[D]. 雅安：四川農業(yè)大學，2008.

[5]薛光榮，余文炎，費開偉，等. 西瓜花藥離體培養(yǎng)獲得花粉植株[J]. 植物生理學通訊，1983（4）：40-42.

[6]薛光榮，余文炎，楊振英，等. 西瓜花粉植株的誘導及其后代初步觀察[J]. 遺傳，1988，10（2）：5-8，49.

[7]Shail J W，Robinson R W. Anther and ovule culture of Cucurbita[J]. Cucurbit Genet Coop Rpt，1987，10：92.

[8]Kurtar E S，Uzun S，Esendal E. Haploid plant propagation by anther culture of squash （Cucurbita pepo L.）[J]. Ondokuzmayis Universitesi Ziraat Fakultesi Dergisi，1999，14（2）：33-45.

[9]Metwally E I，Moustafa S A，El-Sawy B I，et al. Haploid plantlets derived by anther culture of Cucurbita pepo[J]. Plant Cell：Tissue and Organ Culture，1998，52（3）：171-176.[ZK）]

[10][ZK（#]Dryanovska O A，Ilieva I N. In vitro anther and ovule cultures in muskmelon （Cucumis melo L.）[J]. C R Acad Bulgare Sci，1983，36：1107-1110.

[11]Lazarte J E，Sasser C C. Asexual embryogenesis and plantlet development in anther culture of Cucumis sativus L. [J]. HortScience，1982，17（1）：88.

[12]Ashok K H G，Murthy H N，Paek K Y. Embryogenesis and plant regeneration from anther cultures of Cucumis sativus L. [J]. Sci Hortic，2003，98：213-222.

[13]詹艷，陳勁楓，Malik A A. 黃瓜游離小孢子培養(yǎng)誘導成胚和植株再生[J]. 園藝學報，2009，36（2）：221-226.

[14]唐懿，李萬寧，劉繼，等. 苦瓜花藥培養(yǎng)研究進展[J]. 長江蔬菜，2010（24）：4-7.

[15]Han J S，Oh D G，Mok I G，et al. Efficient plant regeneration from cotyledon explants of bottle gourd （Lagenaria siceraria Standl.）[J]. Plant Cell Rep，2004，23：291-296.

[16]緱艷霞. 西瓜花藥離體培養(yǎng)技術研究[D]. 杭州：浙江大學，2006.

[17]董艷榮. 甜瓜花藥再生體系的基礎研究[D]. 南京：南京農業(yè)大學，2002.

[18]曹鳴慶，李巖，劉凡. 基因型和供體植株生長環(huán)境對大白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的影響[J]. 華北農學報，1993（4）：1-6.

[19]張鳳蘭，釗一貫靖久，吉川宏昭. 環(huán)境條件對白菜小孢子培養(yǎng)的影響[J]. 華北農學報，1994，9（1）：95-100.

[20]袁亦楠，朱德蔚，連勇，等. 番茄游離小孢子培養(yǎng)形成胚狀體的初步研究[J]. 農業(yè)生物技術學報，1999（1）：85-88.

[21]謝淼，秦麗穎，潘俊松，等. 黃瓜花器形態(tài)發(fā)生、小孢子發(fā)育與花藥培養(yǎng)[J]. 西北植物學報，2005，25（6）：1096-1100.

[22]薛光榮，費開韋. 西瓜花藥培養(yǎng)獲得花粉植株簡報[J]. 中國果樹，1982（2）：51-52.

[23]崔群香，劉衛(wèi)東，吳敏，等. 用熒光染色法觀察南瓜雄配子體發(fā)育過程[J]. 江蘇農業(yè)科學，2012，40（1）：135-137.

[24]羊杏平，陳學好，周峰. 不同預處理對西瓜小孢子存活率的影響[J]. 江蘇農業(yè)學報，2012，28（5）：1104-1108.

[25]郭尚，王秀英. 不同因素對西瓜花粉生活力的影響[J]. 華北農學報，2006，21（3）：91-94.

[26]朱迎春，孫德璽，鄧云，等. 前期處理對西瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導的影響[J]. 中國瓜菜，2012，25（5）：17-19.

[27]緱艷霞，張明方. 西瓜花藥離體培養(yǎng)影響因子研究[J]. 北方園藝，2010，10：117-120.[HJ1.45mm]

[28]Labbani Z，de Buyser J，Picard E. Effect of mannitol pretreatment to improve green plant regeneration on isolated microspore culture in Triticum turgidum ssp. durum cv. ‘Jennah Khetifa[J]. Plant Breeding，2007，126（6）：565-568.

[29]楊安平，張恩慧，鄭愛泉，等. 秋水仙堿對甘藍游離小孢子胚胎發(fā)生及發(fā)育的影響[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2010，8（8）：131-137.

[30]黃均元，曾安新，鄭素秋. 幾種蔬菜花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基探討[J]. 湖南農業(yè)大學學報，1997，12（6）：61-63.

[31]姜鳳英，馮輝，王超楠，等. 幾種影響羽衣甘藍小孢子胚狀體成苗的因素[J]. 植物生理學通訊，2006，42（1）：58-60.

[32]申書興，梁會芬，張成合，等. 提高大白菜小孢子胚胎發(fā)生及植株獲得率的幾個因素研究[J]. 河北農業(yè)大學學報，1999（4）：65-68.

[33]Lichter R. Efficient yield of embryoids by culture of isolated microspores of different Brassicaceae species[J]. Plant Breeding，1989，103：119-123.

[34]楊清，曹鳴慶. 通過花藥漂浮培養(yǎng)提高花椰菜小孢子胚胎發(fā)生率[J]. 華北農學報，1991，6（3）：65-69.

[35]Ochatt S，Pech C，Grewal R，et al. Abiotic stress enhances androgenesis from isolated microspores of some legume species （Fabaceae）[J]. Journal of Plant Physiology，2009，166（12）：1314-1328.

[36]Dias J C D. Effect of activated charcoal on Brassica oleracea microspore culture embryogenesis[J]. Euphytica，1999，108：65-69.

[37]Dias J S. Effect of incubation temperature regimes and culture medium on broccoli microspore culture embrogenesis[J]. Euphytica，2001，119：389-394.

[38]Dias J S，Correia M C. Effect of medium renovation and incubation temperature regimes on tronchuda cabbage microspore culture embryogenesis[J]. Sci Hort，2002，93：205-214.

[39]Dias J S，Martins M G. Effect of Silver nitrate on anther culture embryo production of different B.oleracea morphotypes[J]. Sci Hort，1999，82（3/4）：299-307.

[40]Biddington N L，Sutherland R A，Robinson H T. Silver nitrate increase embryo production in anther culture of Brussels sprouts[J]. Ann Bot，1988，62：181-185.

[41][JP3]方淑桂，陳文輝，曾小玲，等. 影響青花菜游離小孢子培養(yǎng)的若干因[JP2]素[J]. 福建農林大學學報：自然科學版，2005，34（1）：51-55.[JP]

[42]于文佳，侯喜林，趙曉嫚，等. 小菘菜游離小孢子培養(yǎng)和植株再生[J]. 南京農業(yè)大學學報，2013，36（2）：7-12.

[43]朱至清，孫敬三，王敬駒. 小麥（Triticum aestivum）雄核發(fā)育的細胞學研究[J]. 植物學報，1978，20（1）：6-12，89-90.

[44]Binarova P，Straatman K，Hause B，et al. Nuclear-DNA synthesis during the induction of embryogenesis in cultured microspores and pollen of Brassica napus L.[J]. Theoretical and Applied Genetics，1993，87（1/2）：9-16.

[45]谷佳南，司龍亭，高興，等. 黃瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導及再生的研究[J]. 江蘇農業(yè)科學，2009（3）：37-39，46.

[46]劉仁祥，黃鶯，陸永旭，等. 煙草花粉植株染色體倍性苗期快速鑒定[J]. 湖南農業(yè)大學學報：自然科學版，2008，34（5）：541-544.

[47]施先鋒，彭金光，汪李平. 用西瓜葉片氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)鑒定西瓜染色體倍性[J]. 湖南農業(yè)大學學報：自然科學版，2009，35（6）：640-642，663.

[48]周偉軍，唐桂香，張國慶，等. 甘藍型油菜小孢子秋水仙堿處理提高雙單倍體頻率研究[J]. 中國農業(yè)科學，2002，35（4）：410-414.